肿瘤坏死因子基因多态性与系统性红斑狼疮
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国外医学临床生物化学与检验学分册 2002年第2期第23卷
1、南通医学院免疫学教研组；南通226001；2、南通医学院附属医院检验科 鞠少卿(综述)；钱勣虎；王惠民(审校)
关键词：肿瘤坏死因子；多态性；系统性红斑狼疮
摘要：
肿瘤坏死因子(TNF)是具有多种生物活性的细胞因子，已经证明TNF在许多疾病中，尤其是在自身免疫病中重要作用，为了弄清TNF与这些疾病的关系，人们对TNF的基因多态性与转录及其与系统性红斑狼疮的关系进行了大量研究，认为TNF基因多态性在一定程度影响TNF的转录，这为探讨TNF基因多态性与系统性红斑狼疮提供理论依据。本文就是TNF基因多态性影响转录及其与系统性红斑狼疮相关性作一综述。
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是体内具有多种生物活性的细胞因子，它具有抗肿瘤、抗病毒感染的作用，诱发炎症反应以及刺激某些正常细胞的生长。TNF基因与MHC基因紧密连锁，编码TNF基因位于HLA-B以及HLA-C2位点之间的HLA-Ⅲ抗原基因簇内，其包含若干多态性位点。根据其在染色体上的位置，及其在慢性炎症中的生物学效应，推测该基因可能与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)发病机制及临床表现有关。近年来研究显示TNF及其受体具有多态性，这种多态性的标志是TNF-α、TNF-β及其受体基因内的碱基变化，这种变化与自然免疫病、感染、肿瘤等许多疾病TNF水平特征性增高有密切关系。最近的研究进一步提示TNF水平增高的原因，认为是TNF基因多态性影响了TNF的转录，故从基因水平上分析了TNF与疾病发生、发展的关系。
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1、TNF基因多态性
人类的TNF基因相当保守，用21种限制性内切酶消化不同个体基因组DNA，只有AccⅠ和NcoⅠ显示了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。Wilson等首先报道了TNF-α基因启动子区域内转录起始位点上游第308位(-380位点)的双等位基因多态性，308位为鸟嘌呤核苷酸G时定义为TNF1，308位为腺嘌呤核苷酸A时定义TNF2，TNF1较常见。这一位点突变造成限制性内切酶NcoⅠ识别位点的缺失，使被A替代的核苷酸序列不能被NcoⅠ识别并切断。除-308位点外，TNF-α基因多态性还表现在-238、-276、163、+70位点G→A碱基的变化。
TNF-β基因多态性位点主要有五种：3'非翻译区的EcoRⅠ的RELP多态性；5'非翻译区的一个多形性残基；第一内含子+252位点和1069位点片G→A碱基变化，当第一内含子+252位点和1069位点处G→A碱基变化，当每内含+252位点处为G时，能被NcoⅠ限制性内切酶识别切断， 产生了识别位点，G存在的基因称为TNFβ+1，存在基因称为TNFβ*2；第一个内含子368位点鸟嘌噙核苷酸G→胞嘧啶核苷C的碱基变化；TNFβ基因的第一外显子内第三个碱基腺嘌噙核苷酸A→胞嘧啶核苷酸C的碱基变化；导致第26位氨基酸的改变，即AAC=Asn(天门冬酰胺)改变为ACC=Thr(苏氨酸)。
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TNF基因的保守性，促使人们利用别的方法来对其多态性现象进行研究，运用微卫星定位技术，已经证明所有的真核生物基因组和部分原核生物基因组都存在一种简单的高度重复的短片段，如(dT-dA)n、(dG-dT)n等，即微卫星(microsatellite)，它们通常分布于基因的非编码区。(CA)n在个体间具有长度的高度多态性微卫星，分别称为TNFa、TNFb、TNFc、TNFd、TNFe、TNFb位于TNFβ基因上游3.5kb处，TNFb为CA重复序列，至少有13个等位基因，TNFb为CT重复序列，至少含有7个等位基因，TNFc是位于TNFβ基因第一内含子内一个双等位基因CT重复序列，有2个等位基因，TNFd和TNFe位于TNFα基因下游8～10kb处，两者均为CT重复序列，分别具有7个和10个等位基因。
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2、TNF基因多态性与转录
Kroeger等应用电泳泳动速度转变分析法(EMSA)研究了TNFα基因-308位点基因多态性对转录的影响。发现TNF1和TNF2对转录因子的结合能力不同，转录因子易与TNF2结合。为了研究-308多态性对TNFα基因启动子转录的影响，把TNF2和TNF1的-993→+110区域转录染入Jurkat细胞或U937细胞中，荧光素酶作报告基因，用PMA刺激转染后的细胞，结果发现在3'UTR存在的条件下，-308A形式比-308G形式的转录活性高二倍。Stuber等用PMA刺激的Jurkat细胞和LPS诱导的巨噬细胞系中TNF1和TNF2的转录活性没有差异。但是，他们的研究中没有应用3'UTR，而Kroeger等研究也表明，在没有3'UTR存在而只有TNF1和TNF2的情况下，基因的表达也无差异。
Louis等用LPS刺激62名健康的人的全血细胞发现TNF2携带者的TNFα产量比TNF1纯合子高(平均值929pg/ml)(480～1473pg/ml)对平均值521pg/ml(178～1473pg/ml，P<0.05)，说明TNF基因-308位点的碱基突变影响了TNFα的产量。
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Lee等用PHA刺激60名韩国籍SLE患者(其中有部分并发狼疮肾炎)和38名健康人的外周血单核细胞和T淋巴细胞，以观察TNFβ*1和TNFβ*2对单核细胞和T淋巴细胞分泌TNFα和TNFβ能力的影响。TNFβ+252基因多态性用PCR-NcoⅠ RFLP进行分析判断，用L929细胞株生物测定法进行TNF总量测定，ELISA法测定TNFβ量。SLE病人分泌TNF量有低于健康对照组的倾向(平均值1032±184pg/ml对1524±224pg/ml，P=0.094)。并发有狼疮肾炎病人TNFα含量降低者明显多于无狼疮肾炎病人(TNFα降低者的百分比为34.9%对7.1%，P<0.01)，TNFβ也显示了相似的结果(TNFβ降低者的百分比为53.1%对21.4%，P<0.05)；具有纯合子TNFβ*1的SLE病人(n=18)TNFβ的平均值明显低于纯合子TNFβ*1的SLE病人(n=9)(平均值642±118.4pg/ml对1126.3±145pg/ml，P=0.021)；但两组病人TNFα产量无显著性差异(平均值分别710±56.4对542.4±71.1pg/ml，P=0.109)。他们结果表明纯合子TNFβ*2的SLE病人外周血单核细胞分泌TNFβ能力降低，这也许是韩国SLE病人狼疮肾炎的一个重要易感因素，因此TNFβ+252位点的碱基突变影响TNFα和TNFβ的产量。
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3、TNF基因多态性与SLE
3.1TNFα基因多态性与SLE 对TNFα-308位点和-238位点基因多态性与SLE的相关性，已有许多国家的研究者进行了研究，结论不尽相同。Wilson等对81例白种人SLE患者和168例健康人进行TNFα-308位点基因多态性与SLE及自身抗体产生的相关性研究，发现TNFα表型及HLA-DR3、B8基因表型频率与SLE显著性正相关，但HLA-DR3和TNFα与抗SSA和抗SSB自身抗体显著相关，分别研究表明TNFα阴性患者的HLA-DR3仍与上述自身抗体无相关，提示TNFα不能独立于HLA-DR3之外与自身抗体相关。此现象的产生与HLA-DR3或其它附件基因连锁不平衡所致。提示TNFα基因多态性在SLE遗传易感染性中起重要作用。
由于HLA-DR3和TNFα存在连锁不平衡，许多与SLE关联的疾病也可能存在MHCⅡ类等位基因的参与，TNFα-308A风险因素也许由于MCHⅡ类基因的参与被掩盖或放大，为了区别此风险究竟是来自MHCⅡ类等位基因，还是来自TNFα等位基因。Sullivan等对不存在HLA-DR3和连锁不平衡88名美籍非洲SLE病人和64名健康人TNFα-308位点基因多态性进行了分析研究，他们的结论是美籍非洲SLE病人和64名健康人TNFα-308位点基因多态性进行了分析研究，他们的结论是美籍非洲SLE病人TNFα-308A基因频率高于健康人，且这些人 HLA-DR3-308A等位基因频率与SLE亦无相关性。
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Rudwaleit等对49名英国白人和49名南非黑人SLE病人TNFα和-308位点多态性进行了检测，结果发现白人的SLE患者中TNF2频率比对照组高(比数比OR2.2，95%可信限CI1.1～4.6，P=0.024)，黑人的SLE患者TNF2频率与正常对照组比较无显著性差异(OR0.76，P=0。45)，患者的TNF2频率与 HLA-DR3-308A有密切联系(P=0.00002)；而黑人患者TNF2频率却比对照组低，患者的 HLA-DR3-308A频率比对照组高，每个种族SLE患者与各自的健康对照组的TNF-238基因多态性频率都无显著性差异。
Rood等对荷兰99例SLE病人和177例正常对照组人群TNFα-238G/A和-308G/A启动子基因多态性以及HLA-DR3等位基因进行了研究，结果显示，TNF2及HLA-DR3基因频率在SLE患者均明显高于对照组，单独分析HLA-DR3或TNF2与SLE的相关性发现，排除TNF2的影响，SLE与HLA-DR3也明显相关，TNF2的相对危险度稍高于HLA-DR3，这结果提示TNFα-308A等位基因是SLE病人独立于HLA-DR3的风险因素。
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D'Alfonso等对意大利SLE患者的TNFα-238位点基因多态性研究发现，在123名意大利患者中有3个TNF-238A/A纯合子，而119名健康者则无一名-238A/A纯合子，暗示了-238A/A基因型可能是SLE临床亚型的一个指标。
3.2 TNF-β基因多态性与SLE 德国学者研究发现TNF-β*1等位基因与SLE相关，而韩国与我国研究却发现TNF-β*2等位基因与SLE相关，且SLE病人TNF-β*1等位基因频率较正常人群降低。但是经比较可见，在德国Bettinotti等的研究中发现健康高加素TNF-β*1频率较低为29.1%，TNF-β*2频率则为70.9%；而我国北方汉族正常为29.1%，TNF-β*1频率明显高于高加索人，为51.3%，TNF-β*2为48.7%，尽管中国汉族SLE患者TNF-β*2都与一些其它等位基因存在连锁不平衡，故TNF-β*2的增多也可能反映了某个与之连锁的基因位点在SLE中的高发性。提示TNF-β*2可能是SLE的易感基因或易感等位基因标志。
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此外意大利研究者D'Alfonso等对LSE患者及健康人位于TNF-β基因上游3.5kb处TNF。微卫星多态性进行分析研究发现，TNFα11亚型在抗PNP抗体阳性和阴性的SLE患者出现频率不同，(10/24对6/58)，即抗RNP抗体阳性出现TNFα11亚型频率不高，但经统计学校正后差异无显著性。Naves等对西班牙SLE患者TNFC2等侠基因微卫星多态性与SLE相关性研究发现，TNFC2等位基因频率在SLE患者增高。
4、目前存在问题及展望
本文综述TNF受体及其基因多态性与SLE的相关性，许多国家的研究者对此做了大量的工作，但结果不尽一致，有的甚至截然相反，这可能是与人种、病例数等有关。另外，由于TNF基因位于HLAⅢ基因，与HLAⅠ类及Ⅱ类抗原基因相邻，TNF基因与HLA的某些单倍体有连锁不平衡，HLA复合体具有高度的多态性，HLA其它基因的基因多态性可影响TNF的活性，因此TNF基因多态性在HLA相关疾病中的地位还不明确，还是辅助作用，或者是其它因素协同作用，或者只是其它主要因素的标志，这些都待于进一步研究。, 百拇医药
关键词：肿瘤坏死因子；多态性；系统性红斑狼疮
摘要：
肿瘤坏死因子(TNF)是具有多种生物活性的细胞因子，已经证明TNF在许多疾病中，尤其是在自身免疫病中重要作用，为了弄清TNF与这些疾病的关系，人们对TNF的基因多态性与转录及其与系统性红斑狼疮的关系进行了大量研究，认为TNF基因多态性在一定程度影响TNF的转录，这为探讨TNF基因多态性与系统性红斑狼疮提供理论依据。本文就是TNF基因多态性影响转录及其与系统性红斑狼疮相关性作一综述。
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是体内具有多种生物活性的细胞因子，它具有抗肿瘤、抗病毒感染的作用，诱发炎症反应以及刺激某些正常细胞的生长。TNF基因与MHC基因紧密连锁，编码TNF基因位于HLA-B以及HLA-C2位点之间的HLA-Ⅲ抗原基因簇内，其包含若干多态性位点。根据其在染色体上的位置，及其在慢性炎症中的生物学效应，推测该基因可能与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)发病机制及临床表现有关。近年来研究显示TNF及其受体具有多态性，这种多态性的标志是TNF-α、TNF-β及其受体基因内的碱基变化，这种变化与自然免疫病、感染、肿瘤等许多疾病TNF水平特征性增高有密切关系。最近的研究进一步提示TNF水平增高的原因，认为是TNF基因多态性影响了TNF的转录，故从基因水平上分析了TNF与疾病发生、发展的关系。
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1、TNF基因多态性
人类的TNF基因相当保守，用21种限制性内切酶消化不同个体基因组DNA，只有AccⅠ和NcoⅠ显示了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。Wilson等首先报道了TNF-α基因启动子区域内转录起始位点上游第308位(-380位点)的双等位基因多态性，308位为鸟嘌呤核苷酸G时定义为TNF1，308位为腺嘌呤核苷酸A时定义TNF2，TNF1较常见。这一位点突变造成限制性内切酶NcoⅠ识别位点的缺失，使被A替代的核苷酸序列不能被NcoⅠ识别并切断。除-308位点外，TNF-α基因多态性还表现在-238、-276、163、+70位点G→A碱基的变化。
TNF-β基因多态性位点主要有五种：3'非翻译区的EcoRⅠ的RELP多态性；5'非翻译区的一个多形性残基；第一内含子+252位点和1069位点片G→A碱基变化，当第一内含子+252位点和1069位点处G→A碱基变化，当每内含+252位点处为G时，能被NcoⅠ限制性内切酶识别切断， 产生了识别位点，G存在的基因称为TNFβ+1，存在基因称为TNFβ*2；第一个内含子368位点鸟嘌噙核苷酸G→胞嘧啶核苷C的碱基变化；TNFβ基因的第一外显子内第三个碱基腺嘌噙核苷酸A→胞嘧啶核苷酸C的碱基变化；导致第26位氨基酸的改变，即AAC=Asn(天门冬酰胺)改变为ACC=Thr(苏氨酸)。
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TNF基因的保守性，促使人们利用别的方法来对其多态性现象进行研究，运用微卫星定位技术，已经证明所有的真核生物基因组和部分原核生物基因组都存在一种简单的高度重复的短片段，如(dT-dA)n、(dG-dT)n等，即微卫星(microsatellite)，它们通常分布于基因的非编码区。(CA)n在个体间具有长度的高度多态性微卫星，分别称为TNFa、TNFb、TNFc、TNFd、TNFe、TNFb位于TNFβ基因上游3.5kb处，TNFb为CA重复序列，至少有13个等位基因，TNFb为CT重复序列，至少含有7个等位基因，TNFc是位于TNFβ基因第一内含子内一个双等位基因CT重复序列，有2个等位基因，TNFd和TNFe位于TNFα基因下游8～10kb处，两者均为CT重复序列，分别具有7个和10个等位基因。
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2、TNF基因多态性与转录
Kroeger等应用电泳泳动速度转变分析法(EMSA)研究了TNFα基因-308位点基因多态性对转录的影响。发现TNF1和TNF2对转录因子的结合能力不同，转录因子易与TNF2结合。为了研究-308多态性对TNFα基因启动子转录的影响，把TNF2和TNF1的-993→+110区域转录染入Jurkat细胞或U937细胞中，荧光素酶作报告基因，用PMA刺激转染后的细胞，结果发现在3'UTR存在的条件下，-308A形式比-308G形式的转录活性高二倍。Stuber等用PMA刺激的Jurkat细胞和LPS诱导的巨噬细胞系中TNF1和TNF2的转录活性没有差异。但是，他们的研究中没有应用3'UTR，而Kroeger等研究也表明，在没有3'UTR存在而只有TNF1和TNF2的情况下，基因的表达也无差异。
Louis等用LPS刺激62名健康的人的全血细胞发现TNF2携带者的TNFα产量比TNF1纯合子高(平均值929pg/ml)(480～1473pg/ml)对平均值521pg/ml(178～1473pg/ml，P<0.05)，说明TNF基因-308位点的碱基突变影响了TNFα的产量。
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Lee等用PHA刺激60名韩国籍SLE患者(其中有部分并发狼疮肾炎)和38名健康人的外周血单核细胞和T淋巴细胞，以观察TNFβ*1和TNFβ*2对单核细胞和T淋巴细胞分泌TNFα和TNFβ能力的影响。TNFβ+252基因多态性用PCR-NcoⅠ RFLP进行分析判断，用L929细胞株生物测定法进行TNF总量测定，ELISA法测定TNFβ量。SLE病人分泌TNF量有低于健康对照组的倾向(平均值1032±184pg/ml对1524±224pg/ml，P=0.094)。并发有狼疮肾炎病人TNFα含量降低者明显多于无狼疮肾炎病人(TNFα降低者的百分比为34.9%对7.1%，P<0.01)，TNFβ也显示了相似的结果(TNFβ降低者的百分比为53.1%对21.4%，P<0.05)；具有纯合子TNFβ*1的SLE病人(n=18)TNFβ的平均值明显低于纯合子TNFβ*1的SLE病人(n=9)(平均值642±118.4pg/ml对1126.3±145pg/ml，P=0.021)；但两组病人TNFα产量无显著性差异(平均值分别710±56.4对542.4±71.1pg/ml，P=0.109)。他们结果表明纯合子TNFβ*2的SLE病人外周血单核细胞分泌TNFβ能力降低，这也许是韩国SLE病人狼疮肾炎的一个重要易感因素，因此TNFβ+252位点的碱基突变影响TNFα和TNFβ的产量。
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3、TNF基因多态性与SLE
3.1TNFα基因多态性与SLE 对TNFα-308位点和-238位点基因多态性与SLE的相关性，已有许多国家的研究者进行了研究，结论不尽相同。Wilson等对81例白种人SLE患者和168例健康人进行TNFα-308位点基因多态性与SLE及自身抗体产生的相关性研究，发现TNFα表型及HLA-DR3、B8基因表型频率与SLE显著性正相关，但HLA-DR3和TNFα与抗SSA和抗SSB自身抗体显著相关，分别研究表明TNFα阴性患者的HLA-DR3仍与上述自身抗体无相关，提示TNFα不能独立于HLA-DR3之外与自身抗体相关。此现象的产生与HLA-DR3或其它附件基因连锁不平衡所致。提示TNFα基因多态性在SLE遗传易感染性中起重要作用。
由于HLA-DR3和TNFα存在连锁不平衡，许多与SLE关联的疾病也可能存在MHCⅡ类等位基因的参与，TNFα-308A风险因素也许由于MCHⅡ类基因的参与被掩盖或放大，为了区别此风险究竟是来自MHCⅡ类等位基因，还是来自TNFα等位基因。Sullivan等对不存在HLA-DR3和连锁不平衡88名美籍非洲SLE病人和64名健康人TNFα-308位点基因多态性进行了分析研究，他们的结论是美籍非洲SLE病人和64名健康人TNFα-308位点基因多态性进行了分析研究，他们的结论是美籍非洲SLE病人TNFα-308A基因频率高于健康人，且这些人 HLA-DR3-308A等位基因频率与SLE亦无相关性。
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Rudwaleit等对49名英国白人和49名南非黑人SLE病人TNFα和-308位点多态性进行了检测，结果发现白人的SLE患者中TNF2频率比对照组高(比数比OR2.2，95%可信限CI1.1～4.6，P=0.024)，黑人的SLE患者TNF2频率与正常对照组比较无显著性差异(OR0.76，P=0。45)，患者的TNF2频率与 HLA-DR3-308A有密切联系(P=0.00002)；而黑人患者TNF2频率却比对照组低，患者的 HLA-DR3-308A频率比对照组高，每个种族SLE患者与各自的健康对照组的TNF-238基因多态性频率都无显著性差异。
Rood等对荷兰99例SLE病人和177例正常对照组人群TNFα-238G/A和-308G/A启动子基因多态性以及HLA-DR3等位基因进行了研究，结果显示，TNF2及HLA-DR3基因频率在SLE患者均明显高于对照组，单独分析HLA-DR3或TNF2与SLE的相关性发现，排除TNF2的影响，SLE与HLA-DR3也明显相关，TNF2的相对危险度稍高于HLA-DR3，这结果提示TNFα-308A等位基因是SLE病人独立于HLA-DR3的风险因素。
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D'Alfonso等对意大利SLE患者的TNFα-238位点基因多态性研究发现，在123名意大利患者中有3个TNF-238A/A纯合子，而119名健康者则无一名-238A/A纯合子，暗示了-238A/A基因型可能是SLE临床亚型的一个指标。
3.2 TNF-β基因多态性与SLE 德国学者研究发现TNF-β*1等位基因与SLE相关，而韩国与我国研究却发现TNF-β*2等位基因与SLE相关，且SLE病人TNF-β*1等位基因频率较正常人群降低。但是经比较可见，在德国Bettinotti等的研究中发现健康高加素TNF-β*1频率较低为29.1%，TNF-β*2频率则为70.9%；而我国北方汉族正常为29.1%，TNF-β*1频率明显高于高加索人，为51.3%，TNF-β*2为48.7%，尽管中国汉族SLE患者TNF-β*2都与一些其它等位基因存在连锁不平衡，故TNF-β*2的增多也可能反映了某个与之连锁的基因位点在SLE中的高发性。提示TNF-β*2可能是SLE的易感基因或易感等位基因标志。
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此外意大利研究者D'Alfonso等对LSE患者及健康人位于TNF-β基因上游3.5kb处TNF。微卫星多态性进行分析研究发现，TNFα11亚型在抗PNP抗体阳性和阴性的SLE患者出现频率不同，(10/24对6/58)，即抗RNP抗体阳性出现TNFα11亚型频率不高，但经统计学校正后差异无显著性。Naves等对西班牙SLE患者TNFC2等侠基因微卫星多态性与SLE相关性研究发现，TNFC2等位基因频率在SLE患者增高。
4、目前存在问题及展望
本文综述TNF受体及其基因多态性与SLE的相关性，许多国家的研究者对此做了大量的工作，但结果不尽一致，有的甚至截然相反，这可能是与人种、病例数等有关。另外，由于TNF基因位于HLAⅢ基因，与HLAⅠ类及Ⅱ类抗原基因相邻，TNF基因与HLA的某些单倍体有连锁不平衡，HLA复合体具有高度的多态性，HLA其它基因的基因多态性可影响TNF的活性，因此TNF基因多态性在HLA相关疾病中的地位还不明确，还是辅助作用，或者是其它因素协同作用，或者只是其它主要因素的标志，这些都待于进一步研究。, 百拇医药