深低温停循环中肺肝肾组织细胞凋亡的初步观察
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体外循环杂志 2002年第2期第4卷
100853 解放军总医院心血管外科 齐弘炜；江朝光；李佳春
关键词：深低温停循环；细胞凋亡；脏器损伤
摘要：
目的
目的：观察深低温停循环对肺、肝、肾组织细胞凋亡的影响情况。
方法：北京农业大学实验用小型猪4头，体重22～25kg。鼻咽温降至18℃时停循环(冰袋敷头)90min，复温120min至鼻咽温36℃。取肺、肝、肾组织制成细胞悬液，Annexin V-FI TC染色，应用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。电镜观察细胞超微结构的变化。
结果：三种脏器均发生了细胞损伤，呈现凋亡和坏死。
结论：深低温停循环造成的脏器损伤可能和细胞凋亡有关。
, 百拇医药
目前深低温停循环(DHCA)已广泛应用于复杂先天性心脏病及主动脉弓部和升主动脉手术。除了其对中枢神经系统的影响外，对全身脏器都有不同程度的影响，也应受到足够的重视。我们初步观察了DHCA时肺、肝、肾组织的细胞损伤情况。
材料和方法
1.试验动物 北京农业大学实验用小型猪4头，雌雄不限，体重22～25 kg。
2.实验方法 试验动物在实验前12h禁食，8h禁水，麻醉前30分钟肌肉注射硫酸阿托品(0. 03mg/kg) 。经耳静脉注射硫喷妥钠诱导麻醉(10mg/kg)。诱导成功后气管插管，呼吸机潮气量10 ～15ml/kg，频率15～18次/min。麻醉维持采用静脉滴注硫喷妥钠，静脉注射枸橼酸芬太尼 10ug/kg，Alloferin 100mmg/kg维持肌松。右股动、静脉插管，监测动脉压及中心静脉压 。动物取左侧卧位固定，右第四肋床进胸，肝素化后(右心耳注入肝素3mg/kg)经升主动 脉插动脉灌注管(16F)，近端插停跳液针，上腔静脉插管(18F)，下腔静脉插管(20F)。Terumo SX-10膜式氧合器，Sarns7000滚轴泵。预充：乳酸林格氏液500ml，706代血浆500ml，新 鲜猪血1000ml，肝素20mg，停跳液500ml全部吸回。鼻咽温降至18℃时停循环(冰袋敷头)90min，复温120min至鼻咽温36℃。静脉放血处死动物，同时经氧合器泵入生理盐水冲洗出血管内的血液，直到静脉引流管引出的液体变白。
, 百拇医药
3.标本处理及观察指标 取右侧肺下叶、肝左叶、右肾皮髓交界处组织应用Medimachine分离，经200目过筛后1500r/ min离心5min，用1ml生理盐水制成细胞悬液。用1×Binding Buffer制成1×106个/ml的细 胞悬液。各取100ul悬液移入四个5ml的试管，分别为：1号不加任何试剂；2号加5um Annexin V-FITC；3号加10ul PI；4号加5ul Annexin V-FITC和10ul PI。混合均匀后于黑暗中室温保存15min。然后在每个试管中加400ul Binding Buffer，60min内应用流式细胞仪进行测量分析。另取组织固定，电镜观察细胞损伤及超微结构变化。
4.统计分析 采用SAS软件包进行统计分析。结果用均数±标准差表示。
结 果
肺、肝、肾组织在DHCA时均发生了细胞损伤，呈现凋亡和坏死(表1)。凋亡细胞表现为磷脂酰丝氨酸转移到细胞膜外表面；核皱缩，染色质凝聚和聚集，并在核周分布，可见凋亡小体生成。线粒体及内质网扩张，线粒体内嵴断裂、消失。死亡细胞表现为核溶解，结构消失。
, 百拇医药
表1 肺、肝、肾细胞凋亡结果(%)
正常细胞
早期凋亡
坏死
死亡
肺
87.86±7.53
3.47±2.32
8.46±4.94
0.22±0.30
肺
87.00±4.94
, 百拇医药
4.58±1.31
7.63±2.97
0.80±0.68
肾
73.47±14.83
0.57±0.94
0.19±0.32
25.77±13.79
讨 论
流式细胞仪在细胞生物学中应用很广泛，可以对细胞的不同特性进行测量、分析。本实验每次测量10，000个细胞，取其某特性的平均值，这样的方法优于测量单个细胞的值。在细胞凋亡分析中，将流式细胞仪引入分析细胞损伤的不同时期及各期所占比例，以此观察重要脏器的损伤情况。随着损伤因素的开始、变化及终止，细胞凋亡情况随之变化，其各期所占比例在流式细胞仪的分析资料中显示出来，这些数据反应了细胞损伤的具体情况。
, 百拇医药
肺、肝、肾组织细胞分群较好，分析中取此群细胞。尽管如此，流式细胞仪分析的仍是以上 组织的多种细胞，因为DHCA不会单纯影响一种细胞，而是对所有细胞均有影响，尽管对不同 细胞的影响不会完全相同。
凋亡细胞有一系列形态学的变化，细胞膜的变化是其早期变化之一。位于细胞膜脂质双分子 层内表面的磷脂酰丝氨酸转移到外表面，暴露于细胞外环境中，细胞呈早期凋亡。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，和磷脂酰丝氨酸有高亲合性，可以结合到暴露的磷脂酰丝氨酸上〔1，2〕，可利用和Annexing V结合的荧光染料来测定细胞的凋亡。Annexin V和碘化吡啶均阴性的为正常细胞；Annexin V阳性、碘化吡啶阴性为早期凋亡细胞；Annexin V和碘化吡啶均阳性为坏死的细胞；Annexin V阴性、碘化吡啶阳性为死亡细胞。
低温、停循环造成的缺血、缺氧及再灌注损伤对肺、肝、肾组织的细胞均造成了损伤。从流式细胞测量术结果看，三种组织的细胞均发生了早期凋亡、坏死和死亡。细胞死亡有两种形 式：坏死和凋亡〔3〕。坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。坏死以细胞膜损害为起点，常伴死亡细胞内容物释放及炎症反应，为病理性细胞死亡。凋亡是从形态学上定义的，它可为程序性，许多情况下细胞凋亡是对来自其它细胞或微环境中的信号所作出的一种反应。鉴别细胞凋亡的形态学标准〔4，5〕包括：细胞质和细胞皱缩，浆膜起泡但完整，细胞碎裂产生凋亡小体、伴有或不伴核碎裂，核固缩，核染色质凝聚和凝集并在核周分布，无炎症反应，邻近的正常细胞或一些巨噬细胞发生吞噬作用，溶酶体尚完整。从电镜照片看，线粒体肿胀，嵴消失，内质网明显扩张。核固缩，染色质凝聚和聚集，并在 核周分布，凋亡小体产生。
, 百拇医药
结 论
DHCA不仅影响中枢神经系统，低温、缺血及缺氧对全身脏器都有损伤，因此对腹腔脏器及肺的保护也应引起足够的重视，以防术后多脏器功能衰竭。
参考文献
1.Vermes I,Haanen H,Steffens-Nakken H,et al.A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apopto tic cells using fluorescein labelled Annexin V.J Immunol Meth,1995,184:39-51.
2.Martin SJ,Reutelingsperger CP,McGahon AJ,et al.Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus:Inhibition by over expression of Bcl-2 and Abl.J Exp Med,1995,182:1545-1556.
, 百拇医药
3.Bredesen DE.Neural apopotosis.Ann Neurol,1995,38:839-851.
4.Tseng EE,Brock MV,Lange MS,et al.Neuronal nitric oxide synthase inhibi tion reduces neuronal apoptosis after hypothermic circulatory arrest.Ann Thorac Surg,1997,64:1639-1647.
5.Tseng EE,Brock MV,Lange MS,et al.Monosialogang-lioside GM1 inhibits ne urotoxicity after hypothermic circulatory arrest.Surgery,1998,124:298-306., 百拇医药
关键词：深低温停循环；细胞凋亡；脏器损伤
摘要：
目的
目的：观察深低温停循环对肺、肝、肾组织细胞凋亡的影响情况。
方法：北京农业大学实验用小型猪4头，体重22～25kg。鼻咽温降至18℃时停循环(冰袋敷头)90min，复温120min至鼻咽温36℃。取肺、肝、肾组织制成细胞悬液，Annexin V-FI TC染色，应用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。电镜观察细胞超微结构的变化。
结果：三种脏器均发生了细胞损伤，呈现凋亡和坏死。
结论：深低温停循环造成的脏器损伤可能和细胞凋亡有关。
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目前深低温停循环(DHCA)已广泛应用于复杂先天性心脏病及主动脉弓部和升主动脉手术。除了其对中枢神经系统的影响外，对全身脏器都有不同程度的影响，也应受到足够的重视。我们初步观察了DHCA时肺、肝、肾组织的细胞损伤情况。
材料和方法
1.试验动物 北京农业大学实验用小型猪4头，雌雄不限，体重22～25 kg。
2.实验方法 试验动物在实验前12h禁食，8h禁水，麻醉前30分钟肌肉注射硫酸阿托品(0. 03mg/kg) 。经耳静脉注射硫喷妥钠诱导麻醉(10mg/kg)。诱导成功后气管插管，呼吸机潮气量10 ～15ml/kg，频率15～18次/min。麻醉维持采用静脉滴注硫喷妥钠，静脉注射枸橼酸芬太尼 10ug/kg，Alloferin 100mmg/kg维持肌松。右股动、静脉插管，监测动脉压及中心静脉压 。动物取左侧卧位固定，右第四肋床进胸，肝素化后(右心耳注入肝素3mg/kg)经升主动 脉插动脉灌注管(16F)，近端插停跳液针，上腔静脉插管(18F)，下腔静脉插管(20F)。Terumo SX-10膜式氧合器，Sarns7000滚轴泵。预充：乳酸林格氏液500ml，706代血浆500ml，新 鲜猪血1000ml，肝素20mg，停跳液500ml全部吸回。鼻咽温降至18℃时停循环(冰袋敷头)90min，复温120min至鼻咽温36℃。静脉放血处死动物，同时经氧合器泵入生理盐水冲洗出血管内的血液，直到静脉引流管引出的液体变白。
, 百拇医药
3.标本处理及观察指标 取右侧肺下叶、肝左叶、右肾皮髓交界处组织应用Medimachine分离，经200目过筛后1500r/ min离心5min，用1ml生理盐水制成细胞悬液。用1×Binding Buffer制成1×106个/ml的细 胞悬液。各取100ul悬液移入四个5ml的试管，分别为：1号不加任何试剂；2号加5um Annexin V-FITC；3号加10ul PI；4号加5ul Annexin V-FITC和10ul PI。混合均匀后于黑暗中室温保存15min。然后在每个试管中加400ul Binding Buffer，60min内应用流式细胞仪进行测量分析。另取组织固定，电镜观察细胞损伤及超微结构变化。
4.统计分析 采用SAS软件包进行统计分析。结果用均数±标准差表示。
结 果
肺、肝、肾组织在DHCA时均发生了细胞损伤，呈现凋亡和坏死(表1)。凋亡细胞表现为磷脂酰丝氨酸转移到细胞膜外表面；核皱缩，染色质凝聚和聚集，并在核周分布，可见凋亡小体生成。线粒体及内质网扩张，线粒体内嵴断裂、消失。死亡细胞表现为核溶解，结构消失。
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表1 肺、肝、肾细胞凋亡结果(%)
正常细胞
早期凋亡
坏死
死亡
肺
87.86±7.53
3.47±2.32
8.46±4.94
0.22±0.30
肺
87.00±4.94
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4.58±1.31
7.63±2.97
0.80±0.68
肾
73.47±14.83
0.57±0.94
0.19±0.32
25.77±13.79
讨 论
流式细胞仪在细胞生物学中应用很广泛，可以对细胞的不同特性进行测量、分析。本实验每次测量10，000个细胞，取其某特性的平均值，这样的方法优于测量单个细胞的值。在细胞凋亡分析中，将流式细胞仪引入分析细胞损伤的不同时期及各期所占比例，以此观察重要脏器的损伤情况。随着损伤因素的开始、变化及终止，细胞凋亡情况随之变化，其各期所占比例在流式细胞仪的分析资料中显示出来，这些数据反应了细胞损伤的具体情况。
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肺、肝、肾组织细胞分群较好，分析中取此群细胞。尽管如此，流式细胞仪分析的仍是以上 组织的多种细胞，因为DHCA不会单纯影响一种细胞，而是对所有细胞均有影响，尽管对不同 细胞的影响不会完全相同。
凋亡细胞有一系列形态学的变化，细胞膜的变化是其早期变化之一。位于细胞膜脂质双分子 层内表面的磷脂酰丝氨酸转移到外表面，暴露于细胞外环境中，细胞呈早期凋亡。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，和磷脂酰丝氨酸有高亲合性，可以结合到暴露的磷脂酰丝氨酸上〔1，2〕，可利用和Annexing V结合的荧光染料来测定细胞的凋亡。Annexin V和碘化吡啶均阴性的为正常细胞；Annexin V阳性、碘化吡啶阴性为早期凋亡细胞；Annexin V和碘化吡啶均阳性为坏死的细胞；Annexin V阴性、碘化吡啶阳性为死亡细胞。
低温、停循环造成的缺血、缺氧及再灌注损伤对肺、肝、肾组织的细胞均造成了损伤。从流式细胞测量术结果看，三种组织的细胞均发生了早期凋亡、坏死和死亡。细胞死亡有两种形 式：坏死和凋亡〔3〕。坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。坏死以细胞膜损害为起点，常伴死亡细胞内容物释放及炎症反应，为病理性细胞死亡。凋亡是从形态学上定义的，它可为程序性，许多情况下细胞凋亡是对来自其它细胞或微环境中的信号所作出的一种反应。鉴别细胞凋亡的形态学标准〔4，5〕包括：细胞质和细胞皱缩，浆膜起泡但完整，细胞碎裂产生凋亡小体、伴有或不伴核碎裂，核固缩，核染色质凝聚和凝集并在核周分布，无炎症反应，邻近的正常细胞或一些巨噬细胞发生吞噬作用，溶酶体尚完整。从电镜照片看，线粒体肿胀，嵴消失，内质网明显扩张。核固缩，染色质凝聚和聚集，并在 核周分布，凋亡小体产生。
, 百拇医药
结 论
DHCA不仅影响中枢神经系统，低温、缺血及缺氧对全身脏器都有损伤，因此对腹腔脏器及肺的保护也应引起足够的重视，以防术后多脏器功能衰竭。
参考文献
1.Vermes I,Haanen H,Steffens-Nakken H,et al.A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apopto tic cells using fluorescein labelled Annexin V.J Immunol Meth,1995,184:39-51.
2.Martin SJ,Reutelingsperger CP,McGahon AJ,et al.Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus:Inhibition by over expression of Bcl-2 and Abl.J Exp Med,1995,182:1545-1556.
, 百拇医药
3.Bredesen DE.Neural apopotosis.Ann Neurol,1995,38:839-851.
4.Tseng EE,Brock MV,Lange MS,et al.Neuronal nitric oxide synthase inhibi tion reduces neuronal apoptosis after hypothermic circulatory arrest.Ann Thorac Surg,1997,64:1639-1647.
5.Tseng EE,Brock MV,Lange MS,et al.Monosialogang-lioside GM1 inhibits ne urotoxicity after hypothermic circulatory arrest.Surgery,1998,124:298-306., 百拇医药