单纯缺血预处理对兔未成熟心脏的保护作用
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体外循环杂志 2002年第2期第4卷
400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院麻醉科；阜外心血管病医院麻醉体外循环研究室 朱斌；闵苏；龙村
关键词：缺血预处理；心肌保护；未成熟
摘要：
目的
目的：研究单纯缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)对兔未成熟 心脏血再灌注损伤(I/R)的影响，并探讨相关机制。
方法：利用Langendorff模型灌注幼兔(14-21d)离体心脏，5min缺血、10min再灌注的IPC处理后，观察其在生理体温(39℃)下接受30min缺血、40min复灌的血液动力学，冠脉流出液心肌酶及心肌能量变化。
结果：复灌后IPC组与对照组在心率(HR)、冠脉流出量(CF)、左室发展压(LVDP)、左室压力 上升和下降最大变化速率(±dp/dtmax)恢复率及室性心律失常发生率无明显差别，肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)漏出量有增多趋势(P>0.05)。而IPC组在全心 停灌后心脏缺血跳动时间明显延长(P<0.01)，再灌注末心肌ATP含量显著减少(P <0.01)。
, 百拇医药
结论：单纯缺血预处理并不足以保护经历全心缺血再灌注损伤的兔未成熟心脏的功能和减少室性心律失常，反而有可能导致心肌细胞的损伤；其原因可能与全心缺血后，心脏不能很快停跳而导致能量消耗过多有关。
目前临床上常用高钾停跳液和低温对接受心外科手术的心脏提供保护，但对于结构发育异常，左室肥厚的先心病患儿，由于停跳液不能理想的达到心脏的各个部位而难以提供良好的保护。1986年，Murry在成年实验犬心肌保护研究中提出了缺血预处理概念〔1〕从而为此类手术提供了一种新的心肌保护思路。但未成熟心肌在形态结构、对缺氧的耐受力等一些生理性能方面与成熟心肌存在明显差异。因此，本实验旨在研究在脱离传统的心肌措施(如高钾、低温)前提下，单纯缺血预处理对离体灌注幼兔心脏的影响，并希望从机制上对此加以探讨。
资料与方法
1.实验仪器与试剂：多导生理记录仪(Macintosh,Quadra610,Japan,charts 3.6v/s)，超级恒温器(WC/09-05，重庆实验设备厂)，恒温循环器(HX-10555，北京四环科学仪器厂)，改良Langendorff装置，Stockert血泵(Gemany)，混合气(O2∶CO2=95%∶5%，北京普莱克斯公司)，超纯水(SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂)。Krebs-Henseleit理碳酸盐缓冲液成分(mmol/L)：NaCl 118.5、NaHCO3 25.0、KH2PO41.2、KCl4.8、MgSO47.0、H2O1.2、CaCl21.8、葡萄糖11.0，pH7.4±0.5。
, 百拇医药
2.动物模型的建立：实验用兔为本校实验动物中心提供(纯种新西兰白兔)。体重220～280g，兔龄14～21d。主动脉灌注压为7.8kPa(1kPa=7.5mmHg)。以氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(1.5g/kg)，经股静脉肝素化(150IU/kg)，快速开胸取出心脏，浸入4℃Krebs-Henseleit缓冲液，30s内主动脉插管连于Langendorff灌注装置；用39℃经混合气(O2∶CO2=95%∶5%)平衡的Krebs-Henseleit液灌注，灌注压60cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)。剪开肺动脉以通畅冠脉流出道。剪开左心耳，向左室插入与多导生理检测仪相连的带球囊导管，并将心脏移入保温(39℃)缸内。
3.实验分组及步骤：平稳灌注30min后，向球囊缓慢注入生理盐水，调整至左室舒张末压(LVEDP)为10mmHg(1mmHg=0.133kPa)。按是否行IPC将16只幼兔随机分为2组，每组8只，对照组(Con)继续灌注15min；预处理组(IPC)全心缺血5min，复灌10min行IPC。两组心脏均经历 停灌30min(保温、保湿)、缺血自动停跳和再灌注40min，复制全心I/R模型。
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4.测定指标：平稳灌注30min时，记录冠脉流量(CF)、心率(HR)、左室发展压(left ventr icular developed pressure,LVDP)、左室压力上升和下降最大变化速率(±dp/dtmax)作为基础值。记录心脏缺血跳动时间(主动脉停灌到心脏机械活动停止时间)。全程记录再 灌后左室搏动图形，行心律失常评分(arrhythmias scores,AS)；并分别把再灌后5、10、20 、30、40min的CF、HR、LVDP、±dp/dtmax测定值表达为其对基础值的恢复率。收集再灌后前10min冠脉流出液，以自动生化分析仪测定肌酸磷酸激酬酶同工酶(CK-MB)。再灌注毕，快速取下心脏，滤纸吸净心脏表面水分，剪取心尖部位约200mg组织液氮保存，用以ATP测定。
(1)心律失常评分方法：主要以室性心律失常(ventricular arrhythmias)为考察对象，参照 Curtis〔2〕和Ravingerova〔3〕等方法制定下述心律失常评分方法：
, 百拇医药
1分：室性早搏(ventricular extrasystole VE)无或VE<5次。
2分：VE≥5次。
3分：室性心动过速(ventricular tachycardias VT)一阵<60S。
4分：VT一阵≥60S或多阵累计<60S。
5分：VT多阵累计>60S。
6分：室颤(ventricular fibrillation VF)一阵<5min。
7分：VF多阵累计<5min或一阵≥5min。
8分：VF多阵累计>5min。
, 百拇医药 心律失常评分分值越高，表明发生室性心律失常的几率越大。
(2)ATP的测定：采用高效液相色谱技术。仪器与试剂：采用美国Waters公司高效液相色谱仪， 510泵，490E型紫外检测器，46mm×250mm Spherisorb ODS2柱；5’-ATP钠盐和CP均为美国Sigama公司产品，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，用水为超纯水。测定方法： 称取适量心肌组织(150mg)，加入1ml 0.4M HClO4溶液沉淀，匀浆，冰浴中提取。4000 rpm离心10min，上清液用碱调pH为中性，1000rpm离心10min。取上清液20ul进高效液相色谱仪(HPLC)分析。色谱条件：ODS反相分离柱，流动相为甲醇-KH2PO4缓冲液，流速1.2mC/min，检测波长259nm。单位mg/g.wet。
5.统计学处理：所有数据均以`X±s表示，两组之间均数比较用 成 组t检验，以SPSS 9.0软件进行统计分析。P<0.05为有显著性差异。
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结 果
1.两组平衡时资料：见表1，在缺血再灌注损伤以前两组动物的一般资 料(体重、血流动力学)无显著性差异( P>0.05)。
2.血流动力学的变化：复灌后两组CF恢复率随再灌注时间延长逐渐下降(P<0.05)，而两组HR在复灌后5min就恢复到平稳水平，两组LVDP和±dp/dt恢复则随再灌注时间延长改善(P<0.05 )。缺血预处理组的CF、HR、LVDP及±dp/dt恢复率在复灌后5、10、20、30、40min各时点较对照组均无显著性差异，其中HR和LVDP恢复率在所观察各时点要高于对照组，但两者差异无统计学意义( P>005)。此外两组之间的心律失常评分(AS)也无显著性差异(见表2)。
表1 平衡时两组动物的一般资料(`X±s)
BW(g)
, 百拇医药
CF(ml)
HR(b/min)
LVDP (mmHg)
+dp/dtmax (mmHg/s)
-dp/dtmax (mmHg/s)
Con组
252.75±2.15
13.46±2.58
237.63±28.64
104.33±10.73
1845.04±269.41
, 百拇医药
1772.86±175.45
IPC组
248.75±21.49
13.87±3.40
234.00±35.28
104.94±17.10
1804.54±285.46
1796.01±185.00
表2 两组动物之间的VA、CK-MB、及ATP值比较(`X±s )
AS
CK-MB(U/L)
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ATP(mg/wet)
IPC组
2.94±2.40
31.55±4.9
123.85±17.42
对照组
3.97±2.24
27.75±5.4
167.21±16.53
与对照组相比，*P<0.01
3.心肌酶学变化：见表2，缺血预处理组肌酸磷酸激酶 同工酶(CK-MB)漏出量高于对照组，但无统计意义(P>0.05)。
, 百拇医药
4.心肌ATP变化：见表2，缺血预处理组心肌组织ATP含量明显低于对照组(P<0.01)。
讨 论
目前IPC在未成熟心肌保护研究方面还刚刚起步，Awad研究表明小于7d 的乳鼠不能产生IPC保护效应〔4〕。而Liu则在4-7d离体灌注乳兔心脏上观察到明显的IPC效应，表现为LVDP恢复增加和CK释放减少〔5〕。Baker对7-10d兔进行类似研究，也发现IPC可改善LVDP的恢复率〔6〕。但本实验结果表明：单纯缺血预处理并不能保护接受缺血再灌未成熟兔心肌的心脏功能和减少室性心律失常，反而可能导致心肌细胞的损伤。其原因可能与主动脉停灌后，心脏缺血跳动时间显著延长(IPC组16.23±1.74min ，对照组13.50±1.82min，P<0.01)从而导致能量消耗过多有关。既往缺血预处理研究多数能得到保护性结果，故而许多学者认为缺血预处理对心肌的保护则是迄今发现最强的内源性保护〔7〕。即使有些结果阴性的实验也只是把原因归咎为实验动物种属和模型的不同，而从未提到预处理后的实验动物心脏在接受全心缺血时，其停跳是否迅速或缺血跳动时间延长(文献中单纯IPC对全心I/R研究罕用停搏液)〔8〕。本研究室另一单纯IPC对 成年大鼠心脏全心I/R作用的研究也出现与本实验相似的结果〔9〕，表明这种经过缺血预处理的心脏在接受全心缺血时其从跳动至停搏时间期明显延长。主动脉停止灌注后心脏仍较长时间搏动必然导致心肌细胞损伤和能量消耗增加。但从另一角度来说，本实验预处理过的心脏不易停止搏动本身是否意味着IPC对心肌电、机械性的保护?即使IPC组心肌细胞损伤较重、能量消耗增多，但其血流动力学指标、心律失常评分及心率恢复与对照组并无统计学差别，在复灌后各观察点HR及-dp/dtmax的恢复有好于对照组的趋势。
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本实验提示，单纯IPC不足以对未成熟心肌全心的缺血再灌注损伤提供明显保护；IPC对心肌 的保护研究有必要与停搏液等综合措施相结合来进行。
参考文献
1.Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a d elay of lethal cell injury in ischemic myocardium.Circulation,1986,74:1124-1136.
2.Curtis MJ,Walker M.Quantification of arrhythmias using scoring systems :an examination of seven scores in an in vivo model of regional myocardial ischemia.Cardiovasc Res,1988,22:656-665.
, 百拇医药
3.Ravinerova T,Tribulova N,Slezak J,et al.Brief intermediate and prolong ed ischemia in isolated crystalloid perfused rat heart:relationship between susc eptibility to arrhythmias and degree of ultrastructural injury.Mol Cell Cardiol, 1995,27:1937-1951.
4.Awad WI,Shattock MJ,Chambers DJ.Ischemic preconditioning in immature m yocardium.Circulation,1998,98:206-213.
5.Liu H,Cala PM,Anderson SE.Ischemic preconditioning:effects on pH,Na+ and Ca++ in newborn rabbit hearts during ischemia/reperfusion.J Mol Cell Cardiol,199 8,30:685-697.
, http://www.100md.com
6.Baker JE,Holman P,Gross GJ.Preconditioning in immature rabbit hearts: role of K+-ATP channels.Circulation,1999,99:1249-1254.
7.Lawson CS,Downey JM.Preconditioning:state of the rat myocardial protection.Cardiovasc Res,1993,27:542-550.
8.Mackenzie Q,Lucas C,Dominique ST,et al.The enigma of myocardial preconditioning models.J Card Surg,1994,9(Suppl):532-536.
9.潘楚雄,张炳熙,赵延.2000年中华医学会全国麻醉学会议论文摘要汇编.海口:200 0.52-53., 百拇医药
关键词：缺血预处理；心肌保护；未成熟
摘要：
目的
目的：研究单纯缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)对兔未成熟 心脏血再灌注损伤(I/R)的影响，并探讨相关机制。
方法：利用Langendorff模型灌注幼兔(14-21d)离体心脏，5min缺血、10min再灌注的IPC处理后，观察其在生理体温(39℃)下接受30min缺血、40min复灌的血液动力学，冠脉流出液心肌酶及心肌能量变化。
结果：复灌后IPC组与对照组在心率(HR)、冠脉流出量(CF)、左室发展压(LVDP)、左室压力 上升和下降最大变化速率(±dp/dtmax)恢复率及室性心律失常发生率无明显差别，肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)漏出量有增多趋势(P>0.05)。而IPC组在全心 停灌后心脏缺血跳动时间明显延长(P<0.01)，再灌注末心肌ATP含量显著减少(P <0.01)。
, 百拇医药
结论：单纯缺血预处理并不足以保护经历全心缺血再灌注损伤的兔未成熟心脏的功能和减少室性心律失常，反而有可能导致心肌细胞的损伤；其原因可能与全心缺血后，心脏不能很快停跳而导致能量消耗过多有关。
目前临床上常用高钾停跳液和低温对接受心外科手术的心脏提供保护，但对于结构发育异常，左室肥厚的先心病患儿，由于停跳液不能理想的达到心脏的各个部位而难以提供良好的保护。1986年，Murry在成年实验犬心肌保护研究中提出了缺血预处理概念〔1〕从而为此类手术提供了一种新的心肌保护思路。但未成熟心肌在形态结构、对缺氧的耐受力等一些生理性能方面与成熟心肌存在明显差异。因此，本实验旨在研究在脱离传统的心肌措施(如高钾、低温)前提下，单纯缺血预处理对离体灌注幼兔心脏的影响，并希望从机制上对此加以探讨。
资料与方法
1.实验仪器与试剂：多导生理记录仪(Macintosh,Quadra610,Japan,charts 3.6v/s)，超级恒温器(WC/09-05，重庆实验设备厂)，恒温循环器(HX-10555，北京四环科学仪器厂)，改良Langendorff装置，Stockert血泵(Gemany)，混合气(O2∶CO2=95%∶5%，北京普莱克斯公司)，超纯水(SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂)。Krebs-Henseleit理碳酸盐缓冲液成分(mmol/L)：NaCl 118.5、NaHCO3 25.0、KH2PO41.2、KCl4.8、MgSO47.0、H2O1.2、CaCl21.8、葡萄糖11.0，pH7.4±0.5。
, 百拇医药
2.动物模型的建立：实验用兔为本校实验动物中心提供(纯种新西兰白兔)。体重220～280g，兔龄14～21d。主动脉灌注压为7.8kPa(1kPa=7.5mmHg)。以氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(1.5g/kg)，经股静脉肝素化(150IU/kg)，快速开胸取出心脏，浸入4℃Krebs-Henseleit缓冲液，30s内主动脉插管连于Langendorff灌注装置；用39℃经混合气(O2∶CO2=95%∶5%)平衡的Krebs-Henseleit液灌注，灌注压60cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)。剪开肺动脉以通畅冠脉流出道。剪开左心耳，向左室插入与多导生理检测仪相连的带球囊导管，并将心脏移入保温(39℃)缸内。
3.实验分组及步骤：平稳灌注30min后，向球囊缓慢注入生理盐水，调整至左室舒张末压(LVEDP)为10mmHg(1mmHg=0.133kPa)。按是否行IPC将16只幼兔随机分为2组，每组8只，对照组(Con)继续灌注15min；预处理组(IPC)全心缺血5min，复灌10min行IPC。两组心脏均经历 停灌30min(保温、保湿)、缺血自动停跳和再灌注40min，复制全心I/R模型。
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4.测定指标：平稳灌注30min时，记录冠脉流量(CF)、心率(HR)、左室发展压(left ventr icular developed pressure,LVDP)、左室压力上升和下降最大变化速率(±dp/dtmax)作为基础值。记录心脏缺血跳动时间(主动脉停灌到心脏机械活动停止时间)。全程记录再 灌后左室搏动图形，行心律失常评分(arrhythmias scores,AS)；并分别把再灌后5、10、20 、30、40min的CF、HR、LVDP、±dp/dtmax测定值表达为其对基础值的恢复率。收集再灌后前10min冠脉流出液，以自动生化分析仪测定肌酸磷酸激酬酶同工酶(CK-MB)。再灌注毕，快速取下心脏，滤纸吸净心脏表面水分，剪取心尖部位约200mg组织液氮保存，用以ATP测定。
(1)心律失常评分方法：主要以室性心律失常(ventricular arrhythmias)为考察对象，参照 Curtis〔2〕和Ravingerova〔3〕等方法制定下述心律失常评分方法：
, 百拇医药
1分：室性早搏(ventricular extrasystole VE)无或VE<5次。
2分：VE≥5次。
3分：室性心动过速(ventricular tachycardias VT)一阵<60S。
4分：VT一阵≥60S或多阵累计<60S。
5分：VT多阵累计>60S。
6分：室颤(ventricular fibrillation VF)一阵<5min。
7分：VF多阵累计<5min或一阵≥5min。
8分：VF多阵累计>5min。
, 百拇医药 心律失常评分分值越高，表明发生室性心律失常的几率越大。
(2)ATP的测定：采用高效液相色谱技术。仪器与试剂：采用美国Waters公司高效液相色谱仪， 510泵，490E型紫外检测器，46mm×250mm Spherisorb ODS2柱；5’-ATP钠盐和CP均为美国Sigama公司产品，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，用水为超纯水。测定方法： 称取适量心肌组织(150mg)，加入1ml 0.4M HClO4溶液沉淀，匀浆，冰浴中提取。4000 rpm离心10min，上清液用碱调pH为中性，1000rpm离心10min。取上清液20ul进高效液相色谱仪(HPLC)分析。色谱条件：ODS反相分离柱，流动相为甲醇-KH2PO4缓冲液，流速1.2mC/min，检测波长259nm。单位mg/g.wet。
5.统计学处理：所有数据均以`X±s表示，两组之间均数比较用 成 组t检验，以SPSS 9.0软件进行统计分析。P<0.05为有显著性差异。
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结 果
1.两组平衡时资料：见表1，在缺血再灌注损伤以前两组动物的一般资 料(体重、血流动力学)无显著性差异( P>0.05)。
2.血流动力学的变化：复灌后两组CF恢复率随再灌注时间延长逐渐下降(P<0.05)，而两组HR在复灌后5min就恢复到平稳水平，两组LVDP和±dp/dt恢复则随再灌注时间延长改善(P<0.05 )。缺血预处理组的CF、HR、LVDP及±dp/dt恢复率在复灌后5、10、20、30、40min各时点较对照组均无显著性差异，其中HR和LVDP恢复率在所观察各时点要高于对照组，但两者差异无统计学意义( P>005)。此外两组之间的心律失常评分(AS)也无显著性差异(见表2)。
表1 平衡时两组动物的一般资料(`X±s)
BW(g)
, 百拇医药
CF(ml)
HR(b/min)
LVDP (mmHg)
+dp/dtmax (mmHg/s)
-dp/dtmax (mmHg/s)
Con组
252.75±2.15
13.46±2.58
237.63±28.64
104.33±10.73
1845.04±269.41
, 百拇医药
1772.86±175.45
IPC组
248.75±21.49
13.87±3.40
234.00±35.28
104.94±17.10
1804.54±285.46
1796.01±185.00
表2 两组动物之间的VA、CK-MB、及ATP值比较(`X±s )
AS
CK-MB(U/L)
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ATP(mg/wet)
IPC组
2.94±2.40
31.55±4.9
123.85±17.42
对照组
3.97±2.24
27.75±5.4
167.21±16.53
与对照组相比，*P<0.01
3.心肌酶学变化：见表2，缺血预处理组肌酸磷酸激酶 同工酶(CK-MB)漏出量高于对照组，但无统计意义(P>0.05)。
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4.心肌ATP变化：见表2，缺血预处理组心肌组织ATP含量明显低于对照组(P<0.01)。
讨 论
目前IPC在未成熟心肌保护研究方面还刚刚起步，Awad研究表明小于7d 的乳鼠不能产生IPC保护效应〔4〕。而Liu则在4-7d离体灌注乳兔心脏上观察到明显的IPC效应，表现为LVDP恢复增加和CK释放减少〔5〕。Baker对7-10d兔进行类似研究，也发现IPC可改善LVDP的恢复率〔6〕。但本实验结果表明：单纯缺血预处理并不能保护接受缺血再灌未成熟兔心肌的心脏功能和减少室性心律失常，反而可能导致心肌细胞的损伤。其原因可能与主动脉停灌后，心脏缺血跳动时间显著延长(IPC组16.23±1.74min ，对照组13.50±1.82min，P<0.01)从而导致能量消耗过多有关。既往缺血预处理研究多数能得到保护性结果，故而许多学者认为缺血预处理对心肌的保护则是迄今发现最强的内源性保护〔7〕。即使有些结果阴性的实验也只是把原因归咎为实验动物种属和模型的不同，而从未提到预处理后的实验动物心脏在接受全心缺血时，其停跳是否迅速或缺血跳动时间延长(文献中单纯IPC对全心I/R研究罕用停搏液)〔8〕。本研究室另一单纯IPC对 成年大鼠心脏全心I/R作用的研究也出现与本实验相似的结果〔9〕，表明这种经过缺血预处理的心脏在接受全心缺血时其从跳动至停搏时间期明显延长。主动脉停止灌注后心脏仍较长时间搏动必然导致心肌细胞损伤和能量消耗增加。但从另一角度来说，本实验预处理过的心脏不易停止搏动本身是否意味着IPC对心肌电、机械性的保护?即使IPC组心肌细胞损伤较重、能量消耗增多，但其血流动力学指标、心律失常评分及心率恢复与对照组并无统计学差别，在复灌后各观察点HR及-dp/dtmax的恢复有好于对照组的趋势。
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本实验提示，单纯IPC不足以对未成熟心肌全心的缺血再灌注损伤提供明显保护；IPC对心肌 的保护研究有必要与停搏液等综合措施相结合来进行。
参考文献
1.Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a d elay of lethal cell injury in ischemic myocardium.Circulation,1986,74:1124-1136.
2.Curtis MJ,Walker M.Quantification of arrhythmias using scoring systems :an examination of seven scores in an in vivo model of regional myocardial ischemia.Cardiovasc Res,1988,22:656-665.
, 百拇医药
3.Ravinerova T,Tribulova N,Slezak J,et al.Brief intermediate and prolong ed ischemia in isolated crystalloid perfused rat heart:relationship between susc eptibility to arrhythmias and degree of ultrastructural injury.Mol Cell Cardiol, 1995,27:1937-1951.
4.Awad WI,Shattock MJ,Chambers DJ.Ischemic preconditioning in immature m yocardium.Circulation,1998,98:206-213.
5.Liu H,Cala PM,Anderson SE.Ischemic preconditioning:effects on pH,Na+ and Ca++ in newborn rabbit hearts during ischemia/reperfusion.J Mol Cell Cardiol,199 8,30:685-697.
, http://www.100md.com
6.Baker JE,Holman P,Gross GJ.Preconditioning in immature rabbit hearts: role of K+-ATP channels.Circulation,1999,99:1249-1254.
7.Lawson CS,Downey JM.Preconditioning:state of the rat myocardial protection.Cardiovasc Res,1993,27:542-550.
8.Mackenzie Q,Lucas C,Dominique ST,et al.The enigma of myocardial preconditioning models.J Card Surg,1994,9(Suppl):532-536.
9.潘楚雄,张炳熙,赵延.2000年中华医学会全国麻醉学会议论文摘要汇编.海口:200 0.52-53., 百拇医药