血液超极化停搏对离体兔心脏保护的研究
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体外循环杂志 2002年第1期第4卷
563003 贵州，遵义医学院麻醉学教研室 秦榜勇；喻田；余志豪
关键词：超极化停搏；Pinacidil；血液；心肌缺血/再灌注损伤
摘要：
目的
目的：探讨ATP敏感性钾通道开放剂Pinacidil血液超极化停搏对离体兔心脏的保护作用。
方法：选用兔48只，制作离体心脏模型，随机分为六组：常温高钾组(A组)，常温高钾含血组(B)，低温高钾组(C组)，低温高钾含血组(D组)，常温血液超级化组(E组)，低温血液超极化组(F组)，每组8只。离体兔心以Langendorff模型灌注充氧的Krebs-Henseleit(K-H)液稳 定10分钟后，分别灌注不同的停搏液停跳，缺氧45分钟，恢复灌注20分钟。A组：灌注常温( 37℃)高K+16mmol/L-1)St.Thomas液；B组：灌注含血St.Thomas液(血与晶体比例 为1∶1)，余同A组；C组：灌注低温(20℃)St.Thomas液，余同A组；D组：灌注低温(20℃)含 血St.Thomas液(血与晶体比例为1∶1)，余同A组。E组：灌注常温(37℃)含血超极化液(K+5mmol·L-1，Pinacidil 50umol·L-1)(血与晶体比例为1∶1)，余同B组。F组 ：灌注低温(20℃)含血超极化液，余同E组。对比观察六组停复跳时间，停跳前后心率、心 律及复跳后情况，左室收缩力及左室内压(LVP)，心肌腺苷酸含量、MDA含量及光镜结果。
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结果：1.E、F两组停跳时间均较其余各组延长，与A、B、C、D组比较有非常显著差异( P<0.01＝，E、F两组之间无显著差异；高钾含血组较高钾组停跳时间延长，组间比较有显著差 异(P<0.05或P<0.01＝。2.E、F两组复跳所需时间 最短，与A、B、C、D组比较有非常显著差异(P<0.01＝；B组复跳时间最长，与A、C、D组比较也有显著差异(P<0.05或P<0.01＝。3.E、F两组缺氧前后心率无明显差异，且无心律失常的发生，复跳后均规则有力； A、B、C、D组复跳后心率均有所减慢，再灌注20分钟与停跳前比较有显著差异(P<0.05或P<0.01＝，且均有2～3例发生心律紊乱。4.A、B、C、D组再灌注15分钟时左室内压(LVP)及左室收缩力均显著低于K-H液平衡后水平。E、F组上述两项指标至再灌注20分钟时，已恢复至K-H液平衡后水平；E、F两组同期比较无显著性差异。5.E、F两组的ATP、TAN含量及EC值显著高于A、B、C、D组同期值(P<0.01＝。6.E组MDA含量显著低于A、C两组(P<0.05＝，F 组与A、B、C、D组MDA含量比较也有显著差异(P<0.01＝，E组MFA含量高于F组(P<0.05＝。7.光镜下E、F两组心肌组织结构保存良好，未发生变性及坏死；A、B、C、D组均有部分变 性及坏死。
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结论：ATP敏感性钾通道开放剂(KCOs)Pinacidil诱导的血液超极化停搏，能够降低心肌ATP 的消耗，减少脂质过氧化物的形成，促进离体心脏功能的恢复，对离体心脏的保护效果明显优于传统的高钾去极化停搏。
自从Noma〔1〕发现心肌细胞膜上存在一种被称作ATP-敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP通道)以来，人们对KATP通道进行了深入的研究。喻田等〔2〕报道了离体兔心ATP-敏感性钾通道剂 (ATP-sensitive potassium channel opener,KCOs)Pinacidil诱导的晶体超极化停搏具有确 切的心肌保护效果，也优于高钾去极化停搏液。作者应用离体兔心Langendorff灌注模型，比较观察大剂量钾通道开放剂Pinacidil(50靘ol/L)诱导的血液超极化停搏在不同温度下对 缺血/再灌注心肌的保护效果，以探讨血液超极化保护作用的机理。
材料与方法
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一、材料
健康家兔48只，雌雄兼用，体重2.0～2.5kg，由本校实验动物中心提供。5′-腺苷三磷酸钠盐(ATP)、5′-腺苷二磷酸钠盐(ADP)及5′-腺苷一磷酸钠盐(AMP) 。
标准品及Pinacidil均为Sigma公司产品，丙二醛(MDA)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。其余试剂均为国产分析纯。
二、方法
1.离体心脏灌注模型的制备：兔肝素化后5分钟击头部致昏，开胸迅速取出心脏，置4℃充氧Krebs-Henseleit(K-H)液中，液面下主动脉插管，连接于改良的Langendorff灌注装置上，灌注37℃充氧(2L·min-1)K-H液，灌注压为8.8kPa(1kPa＝7.5mmHg)。K-H液成分 (mmol·L-1) ：NaCl 118.00，KCl 4.75，CaCl2 1.27，KH2PO4 1.19，MgCl2 1.19,NaHCO3 24.80,glucose 8.00,pH7.4。以LMS-2B型二导生理记录仪记录左室收缩力及左室内压。
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2.实验分组及步骤：离体心脏K-H液灌注心脏平衡10min后，随机分组：常温高钾组(A组，n ＝8)，心脏单次灌注37℃的St.Thomas停搏液(10ml·kg-1，灌注压8.8kPa)，其成分 (mmol·L-1) ：NaCl 110.0，KCI 16.0，CaCl2 1.2，MgCl2 16.0，NaHCO3 10.0，pH7.8； 常温高钾含血组(B组，n＝8)，心脏单次灌注37℃高K+(16mmol·L-1)含血St.Thomas液(比例为1：1) ，余同A组；低温高钾组(C组，n＝8)，心脏单次灌注20℃的St.Thomas停搏液，余同A组；低 温高钾含血组(D组，n＝8)，心脏单次灌注20℃高K+(16mmol·L-1)含血St.Thomas 液(比例为1 ：1)，余同A组：常温血液超极化组(E组，n＝8)，心脏单次灌注37℃含血超极化液(K+5mmol·L-1，Pinacidil 50umol·L-1)(比例为1∶1)，余同B组；低温血液超极化组(F组，n＝8)，心脏单次灌注20℃含血超极化液(K+5mmol·L-1,Pinacidil 50u mol·L-1)(比例为1∶1)，余同E组 。心脏停跳期间停止灌注45min，继以37℃充氧K-H液恢复灌注20min。实验结束时，取三块左室心尖部全层心肌组织，其中一块放入液氮中储存，备高效液相色谱仪(日本岛津公司LC- 10A)检测ATP、ADP及AMP含量，并计算总腺苷酸(TAN)及细胞能荷(EC)〔3〕。一块放置于低温冰箱(-20℃)保存，采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定心肌组织中丙二醛(MDA)的含量 。另一块浸泡于3.6%的甲醛溶液中备作光镜检查。
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3.观察指标：(1)诱导停跳时间：从开始灌注停跳液到心脏机械活动停止的时间；(2)复跳时间：从恢复灌注K-H液到心脏开始跳动的时间；(3)功能指标：停跳前、后各组心率、左心室压力和心肌收缩力的变化；(4)心肌组织腺苷酸含量；(5)心肌组织MDA含量。(6)心肌光镜 形态学观察。
4.统计学处理：采用SPSS10.0统计软件，实验数据以均数±标准差(` X±s表示，组间行单因素方差分析q检验，组内行配对t检验，P<0.05认为差异有显著性。
表1 6组心脏停、复跳所需时间(n＝8，` X±s)
组别
停跳时间(s)
复跳时间(s)
A组
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44.38±11.78
68.13±12.52
B组
112.25±12.46△△
95.00±16.04△
C组
33.75±10.61
48.75±8.76
D组
71.25±11.26△
38.13+4.58△△
E组
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553.75±47.49△△
20.00±5.98△△
F组
358.75±40.16△△
27.50±8.45△△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01
结 果
一、停、复跳时间 血液超极化的E、F两组停跳所需时间均较其余各组延长，而复跳所需时间最短，分别是与A、B、C、D组比较有非常显著差异(P<0.01＝；在A 、B、C、D四组中，以B组停复跳所需时间最长，与其余各组比较也有显著差异(P<0.05或P<0.01＝，见表1。
, 百拇医药 二、心功能的影响 E、F两组缺氧45min后心率、心肌收缩力及左心室内压恢复较快，至再灌注20min，除E组左室内压低于缺氧前外，其余指标与缺氧前相比均无显著差异。A、B、C 、D组再灌注20min与停跳前比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。其中尤以左室内压(LVP)及左室收缩力恢复较慢，至再灌注20min时仍显著低于K-H液平衡10分钟水平，见表2 。
三、心肌组织腺苷酸含量 E、F组心肌ATP、TAN及EC的含量显著高于A、B、C、D组(P<0.05或P<0.01＝，A、B、C、D组之间含量无显著差异， 见表3。
四、心肌组织MDA含量 心肌再灌注20min时，组织内MDA含量以F组最低，与A、B、C、D组比较有显著性差异(P<0.01＝，与E组比较也有统计学差异(P<0.05)；而A 、C两组MDA含量最高，与E组比较也有显著性差异(P<005＝，见表4。
五、心肌光镜形态学观察 心肌组织切片HE染色结果如下：A组：心肌肿胀变性，大面积出现胞浆浊肿及空泡变，部分发生溶解及坏死。B组：部分出现胞浆浊肿及空泡变，少数发生溶解及坏死，余同A组。C组：心内膜水肿，有少量炎性细胞浸润，余同A组。D组：部分出现胞浆浊肿及空泡空，余同A组。E组、F组：大部分心肌结构完整，少数心肌出现胞浆浊肿及空泡变，未发生溶解及坏死。
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表2 6组心肌缺血前后心功能的变化(n＝8，` X± s)
项目
K-H稳定10min
再灌注10min
再灌注20min
心率(次.min-1)
A组
120.13±6.10
112.86±6.17*
102.75±13.27**
B组
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125.00±10.69
117.00±6.52△
110.75±11.31**
C组
122.50±15.81
112.50±15.81
99.63±10.54*
D组
126.88±7.04
116.13±13.65
107.50±12.82*
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E组
123.75±11.88
124.13±12.55△
120.63±10.50△△
F组
121.50±13.29
128.00±5.83△△
118.38±8.31△△
心肌收缩力(g)
A组
0.36±0.04
0.23±0.06**
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0.22±0.03
B组
0.34±0.04
0.02±0.06**
0.25±0.05**
C组
0.35±0.04
0.23±0.04**
0.25±0.05**
D组
0.34±0.05
0.22±0.04**
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0.26±0.03**
E组
0.35±0.05
0.29±0.03△*
0.31±0.04△△
F组
0.37±0.04
0.32±0.05△△
0.35±0.03△△*
左心室内压(kPa)
A组
8.01±0.20
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6.24±0.57**
6.28±0.45**
B组
7.93±0.44
6.38±0.42**
6.74±0.57△**
C组
7.90±0.33
6.29±0.39**
6.62±0.43**
D组
7.96±0.39
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6.36±0.29**
6.69±0.31△**
E组
8.05±0.45
7.24±0.44△△**
7.70±0.25△△*
F组
8.04±0.42
7.40±0.57△△
7.96±0.26△△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01； 组内比较，*P<0.05，**P<0.01。
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表3 心肌组织腺苷酸含量(umol/g.wet)及能荷变化(n＝8，` X±s)
组别
ATP
ADP
AMP
TAN
EC
A组
1.04±0.23
0.17±0.06
0.34±0.12
1.55±0.32
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0.73±0.07
B组
0.94±0.14
0.20±0.03
0.42±0.20
1.56±0.32
0.67±0.09
C组
0.99±0.13
0.22±0.08
0.38±0.11
1.58±0.14
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0.69±0.07
D组
1.05±0.28
0.17±0.04
0.44±0.14
1.66±0.21
0.73±0.10
E组
1.55±0.20△△
0.22±0.07
0.41±0.09
2.18±0.32△△
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0.76±0.03
F组
1.44±0.25△△
0.24±0.06△
0.31±0.06△△
1.99±0.29△△
0.78±0.04△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01
表4 心肌MDA含量的变化(umol/gwet)` X±s)
A组
B组
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C组
D组
E组
F组
61.93±11.10
56.48±11.97
62.45±13.02
57.04±11.82
49.90±14.37△
37.82±7.72△△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01
讨 论
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我们的实验结果表明：1.含Pinacidil(50umol·L-1)的血液超极化停搏液停跳所需时间比高钾晶体或含血组长，其中以常温组尤为明显。但该组复跳最为迅速，而低温超极化组 复跳速度仅快于高钾去极化停跳的A、B、C、D组。2.E、F组心肌ATP含量及EC值均高于其余四组，表明血液超极化停搏能够显著降低心肌缺血/再灌注期高能磷酸化合物的消耗，即增强心肌对缺血/再灌注损伤的耐受力。3.再灌注后血液超极化E、F组心肌组织MDA含量低于高钾晶体或含血去极化组，提示血液超极化停搏期间或再灌注早期，氧自由基的生成降低。 4.血液超极化E、F组心肌细胞结构受损较轻，大部分心肌结构完整，且空泡变性较为少见 ，该现象说明血液超极化对心肌组织有较好的保护作用。5.血液超极化E、F组心率、心肌收缩力及左心室内压等心功能恢复较其余去极化组快，这与心肌ATP含量、MDA含量及光镜结 果相吻合。6.常温血液超极化停搏与低温血液超极化停搏对离体兔心缺氧心肌的保护效果类同，Lawton等〔4〕也有相同报道。
传统的心脏去极化停搏是以高K+停搏液灌注心脏，由于心肌细胞膜内外之间的K+浓度梯度降低，膜内电位向零靠近，膜电位发生去极化。去极化停搏的主要缺点是去极化电位引起持续的代谢活动和发生在细胞膜内外的离子转运。这些活动需要消耗能量。由于细胞外高K +加速膜的去极化，导致Na+进入细胞内，细胞内Na+经Na+-Ca2+泵与Ca2 +交换。此交换伴随着Ca2+进入细胞内。最终导致细胞内Ca2+超载〔5，6，7 〕。细胞内Ca2+超载将引起心肌细胞挛缩，能量消耗增加，胞质和膜联结的酶系统激活，细胞内第二信使调节紊乱，线粒体能量生成受损及再灌注心律失常，对心肌保护产生不利的影响。本实验高钾晶体或含血去极化组各项指标均较血液超极化组效果差，也证明了这一点。
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大量KCOs作用于心肌细胞膜上的KATP通道，K+外流使膜电位低于-90mv，细胞发生超极化。超极化状态下由于改变了动作电位时程(APD)，Ca2+内流明显减少，心肌收缩力下降，这种机械活动的减弱保存了三磷酸腺苷(ATP)〔8〕；同时膜电位处于一个超极化的水平，离子交换处于最大平衡且净离子流量小，几乎没有离子通道的开放。因此能 量需求是最小的〔9〕。本实验血液超极化组ATP含量及EC值均高于去极化组，且再灌 注后恢复快，心跳规则有力，而对照组恢复差，心跳乏力，证明了血液超极化组能减少心肌细胞的能量消耗，提高心肌能量储备能力，减轻细胞内Ca2+超载。由于细胞内Ca 2+浓度降低以及KCOs对线粒体膜完整性的保护作用，从而减少心肌细胞线粒体膜及呼吸链上的氧自由基的释放或外漏，血液超极化组脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量低于高钾晶体或含 血去极化组，也证实了这一点。另外，血液还能为缺血心肌提供氧及其它代谢底物，血液中也含有丰富的酸碱缓冲物质，有较高的胶体渗透压，因而有利于减轻组织细胞的酸中毒及心肌细胞水肿。此外，我们的实验及一些报道都观察到KCOs能增加再灌注早期冠脉血流〔 10〕，这有益于缺血后心功能的恢复。本实验观察到血液超极化组再灌注心功能的恢复及 光镜结果明显优于去极化组，也说明了这一点。
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实验的结果显示，Pinacidil血液超极化停搏对离体兔心脏模型有确切的心肌保护作用。由于实验排除了神经、心脏前后负荷以及心外体液因素的影响，其结果仅能反映Pinacidil对心脏的直接药理效应，而与临床心脏手术期间体外循环情况相差较远，且Pinacidil对胰、脑及外周循环等多器官都有生物学作用。因此，我们认为有必要进一步探讨血液超极化对 在体及体外循环下的心肌保护效果，为临床研究以及最终的临床应用提供进一步的实验依据 。
参考文献
1.Noma A:ATP-regulated potassium channels in cardiac muscle.Nature ,1983,305:147-148.
2.喻田，刘兴奎，余志豪，等。钾通道开放剂诱导超极化停跳对离体心脏的保护作 用。中华麻醉学杂志,2000,6：365-368.
, 百拇医药
3.高鸿，余志豪，喻田，等.高效液相色谱法测定心肌组织腺苷酸及意义.遵义医学 院学报,1997：20：36-38.
4.Lawton JS,Harrington CC,Allen CT,et al.Myocardial protective with pinacidil cardioplegia in the blood-perfused heart.Ann Thorac Surg,1996,61:1680-1688.
5.Blaustein MP,Dipolo Rreeves JP.Sodium-Calcium exchange.NY Acad Sci,199 1,69:639.
6.Cohen NM,Ledderer WJ.Changes in the cadium current of rat heart ventri cular myocytes during development.J Physiol,1988,406:115-146.
, http://www.100md.com
7.Gettes LS,Casio WE.Effects of acute ischemia on cardiac electrophysiology.The heart and cardiovascular system,1992,2021-2054.
8.Grover GJ,Sleph PG.Protective effect of KATP openers in ischemic rat hearts treated with a potassium cardioplegic solution.J Cardiovase Pharmacol,1995 ,26:698-706.
9.Damiano RJ.The electrophysiology of ischemia and cadioplegia:implicati ons for myocardial protection.J Cardiac Surg,1995,10(Suppl):101-9.
10.Lawton JS,Hsia PW,Allen CT,et al.Myocardioal protection in the acutely injured heart:Hyperpolarizing versus depolarizing hypothermic cardioplegia.J T horac Cardiovasc Surg,1997,113:567-75., http://www.100md.com
关键词：超极化停搏；Pinacidil；血液；心肌缺血/再灌注损伤
摘要：
目的
目的：探讨ATP敏感性钾通道开放剂Pinacidil血液超极化停搏对离体兔心脏的保护作用。
方法：选用兔48只，制作离体心脏模型，随机分为六组：常温高钾组(A组)，常温高钾含血组(B)，低温高钾组(C组)，低温高钾含血组(D组)，常温血液超级化组(E组)，低温血液超极化组(F组)，每组8只。离体兔心以Langendorff模型灌注充氧的Krebs-Henseleit(K-H)液稳 定10分钟后，分别灌注不同的停搏液停跳，缺氧45分钟，恢复灌注20分钟。A组：灌注常温( 37℃)高K+16mmol/L-1)St.Thomas液；B组：灌注含血St.Thomas液(血与晶体比例 为1∶1)，余同A组；C组：灌注低温(20℃)St.Thomas液，余同A组；D组：灌注低温(20℃)含 血St.Thomas液(血与晶体比例为1∶1)，余同A组。E组：灌注常温(37℃)含血超极化液(K+5mmol·L-1，Pinacidil 50umol·L-1)(血与晶体比例为1∶1)，余同B组。F组 ：灌注低温(20℃)含血超极化液，余同E组。对比观察六组停复跳时间，停跳前后心率、心 律及复跳后情况，左室收缩力及左室内压(LVP)，心肌腺苷酸含量、MDA含量及光镜结果。
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结果：1.E、F两组停跳时间均较其余各组延长，与A、B、C、D组比较有非常显著差异( P<0.01＝，E、F两组之间无显著差异；高钾含血组较高钾组停跳时间延长，组间比较有显著差 异(P<0.05或P<0.01＝。2.E、F两组复跳所需时间 最短，与A、B、C、D组比较有非常显著差异(P<0.01＝；B组复跳时间最长，与A、C、D组比较也有显著差异(P<0.05或P<0.01＝。3.E、F两组缺氧前后心率无明显差异，且无心律失常的发生，复跳后均规则有力； A、B、C、D组复跳后心率均有所减慢，再灌注20分钟与停跳前比较有显著差异(P<0.05或P<0.01＝，且均有2～3例发生心律紊乱。4.A、B、C、D组再灌注15分钟时左室内压(LVP)及左室收缩力均显著低于K-H液平衡后水平。E、F组上述两项指标至再灌注20分钟时，已恢复至K-H液平衡后水平；E、F两组同期比较无显著性差异。5.E、F两组的ATP、TAN含量及EC值显著高于A、B、C、D组同期值(P<0.01＝。6.E组MDA含量显著低于A、C两组(P<0.05＝，F 组与A、B、C、D组MDA含量比较也有显著差异(P<0.01＝，E组MFA含量高于F组(P<0.05＝。7.光镜下E、F两组心肌组织结构保存良好，未发生变性及坏死；A、B、C、D组均有部分变 性及坏死。
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结论：ATP敏感性钾通道开放剂(KCOs)Pinacidil诱导的血液超极化停搏，能够降低心肌ATP 的消耗，减少脂质过氧化物的形成，促进离体心脏功能的恢复，对离体心脏的保护效果明显优于传统的高钾去极化停搏。
自从Noma〔1〕发现心肌细胞膜上存在一种被称作ATP-敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP通道)以来，人们对KATP通道进行了深入的研究。喻田等〔2〕报道了离体兔心ATP-敏感性钾通道剂 (ATP-sensitive potassium channel opener,KCOs)Pinacidil诱导的晶体超极化停搏具有确 切的心肌保护效果，也优于高钾去极化停搏液。作者应用离体兔心Langendorff灌注模型，比较观察大剂量钾通道开放剂Pinacidil(50靘ol/L)诱导的血液超极化停搏在不同温度下对 缺血/再灌注心肌的保护效果，以探讨血液超极化保护作用的机理。
材料与方法
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一、材料
健康家兔48只，雌雄兼用，体重2.0～2.5kg，由本校实验动物中心提供。5′-腺苷三磷酸钠盐(ATP)、5′-腺苷二磷酸钠盐(ADP)及5′-腺苷一磷酸钠盐(AMP) 。
标准品及Pinacidil均为Sigma公司产品，丙二醛(MDA)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。其余试剂均为国产分析纯。
二、方法
1.离体心脏灌注模型的制备：兔肝素化后5分钟击头部致昏，开胸迅速取出心脏，置4℃充氧Krebs-Henseleit(K-H)液中，液面下主动脉插管，连接于改良的Langendorff灌注装置上，灌注37℃充氧(2L·min-1)K-H液，灌注压为8.8kPa(1kPa＝7.5mmHg)。K-H液成分 (mmol·L-1) ：NaCl 118.00，KCl 4.75，CaCl2 1.27，KH2PO4 1.19，MgCl2 1.19,NaHCO3 24.80,glucose 8.00,pH7.4。以LMS-2B型二导生理记录仪记录左室收缩力及左室内压。
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2.实验分组及步骤：离体心脏K-H液灌注心脏平衡10min后，随机分组：常温高钾组(A组，n ＝8)，心脏单次灌注37℃的St.Thomas停搏液(10ml·kg-1，灌注压8.8kPa)，其成分 (mmol·L-1) ：NaCl 110.0，KCI 16.0，CaCl2 1.2，MgCl2 16.0，NaHCO3 10.0，pH7.8； 常温高钾含血组(B组，n＝8)，心脏单次灌注37℃高K+(16mmol·L-1)含血St.Thomas液(比例为1：1) ，余同A组；低温高钾组(C组，n＝8)，心脏单次灌注20℃的St.Thomas停搏液，余同A组；低 温高钾含血组(D组，n＝8)，心脏单次灌注20℃高K+(16mmol·L-1)含血St.Thomas 液(比例为1 ：1)，余同A组：常温血液超极化组(E组，n＝8)，心脏单次灌注37℃含血超极化液(K+5mmol·L-1，Pinacidil 50umol·L-1)(比例为1∶1)，余同B组；低温血液超极化组(F组，n＝8)，心脏单次灌注20℃含血超极化液(K+5mmol·L-1,Pinacidil 50u mol·L-1)(比例为1∶1)，余同E组 。心脏停跳期间停止灌注45min，继以37℃充氧K-H液恢复灌注20min。实验结束时，取三块左室心尖部全层心肌组织，其中一块放入液氮中储存，备高效液相色谱仪(日本岛津公司LC- 10A)检测ATP、ADP及AMP含量，并计算总腺苷酸(TAN)及细胞能荷(EC)〔3〕。一块放置于低温冰箱(-20℃)保存，采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定心肌组织中丙二醛(MDA)的含量 。另一块浸泡于3.6%的甲醛溶液中备作光镜检查。
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3.观察指标：(1)诱导停跳时间：从开始灌注停跳液到心脏机械活动停止的时间；(2)复跳时间：从恢复灌注K-H液到心脏开始跳动的时间；(3)功能指标：停跳前、后各组心率、左心室压力和心肌收缩力的变化；(4)心肌组织腺苷酸含量；(5)心肌组织MDA含量。(6)心肌光镜 形态学观察。
4.统计学处理：采用SPSS10.0统计软件，实验数据以均数±标准差(` X±s表示，组间行单因素方差分析q检验，组内行配对t检验，P<0.05认为差异有显著性。
表1 6组心脏停、复跳所需时间(n＝8，` X±s)
组别
停跳时间(s)
复跳时间(s)
A组
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44.38±11.78
68.13±12.52
B组
112.25±12.46△△
95.00±16.04△
C组
33.75±10.61
48.75±8.76
D组
71.25±11.26△
38.13+4.58△△
E组
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553.75±47.49△△
20.00±5.98△△
F组
358.75±40.16△△
27.50±8.45△△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01
结 果
一、停、复跳时间 血液超极化的E、F两组停跳所需时间均较其余各组延长，而复跳所需时间最短，分别是与A、B、C、D组比较有非常显著差异(P<0.01＝；在A 、B、C、D四组中，以B组停复跳所需时间最长，与其余各组比较也有显著差异(P<0.05或P<0.01＝，见表1。
, 百拇医药 二、心功能的影响 E、F两组缺氧45min后心率、心肌收缩力及左心室内压恢复较快，至再灌注20min，除E组左室内压低于缺氧前外，其余指标与缺氧前相比均无显著差异。A、B、C 、D组再灌注20min与停跳前比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。其中尤以左室内压(LVP)及左室收缩力恢复较慢，至再灌注20min时仍显著低于K-H液平衡10分钟水平，见表2 。
三、心肌组织腺苷酸含量 E、F组心肌ATP、TAN及EC的含量显著高于A、B、C、D组(P<0.05或P<0.01＝，A、B、C、D组之间含量无显著差异， 见表3。
四、心肌组织MDA含量 心肌再灌注20min时，组织内MDA含量以F组最低，与A、B、C、D组比较有显著性差异(P<0.01＝，与E组比较也有统计学差异(P<0.05)；而A 、C两组MDA含量最高，与E组比较也有显著性差异(P<005＝，见表4。
五、心肌光镜形态学观察 心肌组织切片HE染色结果如下：A组：心肌肿胀变性，大面积出现胞浆浊肿及空泡变，部分发生溶解及坏死。B组：部分出现胞浆浊肿及空泡变，少数发生溶解及坏死，余同A组。C组：心内膜水肿，有少量炎性细胞浸润，余同A组。D组：部分出现胞浆浊肿及空泡空，余同A组。E组、F组：大部分心肌结构完整，少数心肌出现胞浆浊肿及空泡变，未发生溶解及坏死。
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表2 6组心肌缺血前后心功能的变化(n＝8，` X± s)
项目
K-H稳定10min
再灌注10min
再灌注20min
心率(次.min-1)
A组
120.13±6.10
112.86±6.17*
102.75±13.27**
B组
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125.00±10.69
117.00±6.52△
110.75±11.31**
C组
122.50±15.81
112.50±15.81
99.63±10.54*
D组
126.88±7.04
116.13±13.65
107.50±12.82*
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E组
123.75±11.88
124.13±12.55△
120.63±10.50△△
F组
121.50±13.29
128.00±5.83△△
118.38±8.31△△
心肌收缩力(g)
A组
0.36±0.04
0.23±0.06**
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0.22±0.03
B组
0.34±0.04
0.02±0.06**
0.25±0.05**
C组
0.35±0.04
0.23±0.04**
0.25±0.05**
D组
0.34±0.05
0.22±0.04**
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0.26±0.03**
E组
0.35±0.05
0.29±0.03△*
0.31±0.04△△
F组
0.37±0.04
0.32±0.05△△
0.35±0.03△△*
左心室内压(kPa)
A组
8.01±0.20
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6.24±0.57**
6.28±0.45**
B组
7.93±0.44
6.38±0.42**
6.74±0.57△**
C组
7.90±0.33
6.29±0.39**
6.62±0.43**
D组
7.96±0.39
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6.36±0.29**
6.69±0.31△**
E组
8.05±0.45
7.24±0.44△△**
7.70±0.25△△*
F组
8.04±0.42
7.40±0.57△△
7.96±0.26△△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01； 组内比较，*P<0.05，**P<0.01。
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表3 心肌组织腺苷酸含量(umol/g.wet)及能荷变化(n＝8，` X±s)
组别
ATP
ADP
AMP
TAN
EC
A组
1.04±0.23
0.17±0.06
0.34±0.12
1.55±0.32
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0.73±0.07
B组
0.94±0.14
0.20±0.03
0.42±0.20
1.56±0.32
0.67±0.09
C组
0.99±0.13
0.22±0.08
0.38±0.11
1.58±0.14
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0.69±0.07
D组
1.05±0.28
0.17±0.04
0.44±0.14
1.66±0.21
0.73±0.10
E组
1.55±0.20△△
0.22±0.07
0.41±0.09
2.18±0.32△△
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0.76±0.03
F组
1.44±0.25△△
0.24±0.06△
0.31±0.06△△
1.99±0.29△△
0.78±0.04△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01
表4 心肌MDA含量的变化(umol/gwet)` X±s)
A组
B组
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C组
D组
E组
F组
61.93±11.10
56.48±11.97
62.45±13.02
57.04±11.82
49.90±14.37△
37.82±7.72△△
组间比较，△P<0.05，△△P<0.01
讨 论
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我们的实验结果表明：1.含Pinacidil(50umol·L-1)的血液超极化停搏液停跳所需时间比高钾晶体或含血组长，其中以常温组尤为明显。但该组复跳最为迅速，而低温超极化组 复跳速度仅快于高钾去极化停跳的A、B、C、D组。2.E、F组心肌ATP含量及EC值均高于其余四组，表明血液超极化停搏能够显著降低心肌缺血/再灌注期高能磷酸化合物的消耗，即增强心肌对缺血/再灌注损伤的耐受力。3.再灌注后血液超极化E、F组心肌组织MDA含量低于高钾晶体或含血去极化组，提示血液超极化停搏期间或再灌注早期，氧自由基的生成降低。 4.血液超极化E、F组心肌细胞结构受损较轻，大部分心肌结构完整，且空泡变性较为少见 ，该现象说明血液超极化对心肌组织有较好的保护作用。5.血液超极化E、F组心率、心肌收缩力及左心室内压等心功能恢复较其余去极化组快，这与心肌ATP含量、MDA含量及光镜结 果相吻合。6.常温血液超极化停搏与低温血液超极化停搏对离体兔心缺氧心肌的保护效果类同，Lawton等〔4〕也有相同报道。
传统的心脏去极化停搏是以高K+停搏液灌注心脏，由于心肌细胞膜内外之间的K+浓度梯度降低，膜内电位向零靠近，膜电位发生去极化。去极化停搏的主要缺点是去极化电位引起持续的代谢活动和发生在细胞膜内外的离子转运。这些活动需要消耗能量。由于细胞外高K +加速膜的去极化，导致Na+进入细胞内，细胞内Na+经Na+-Ca2+泵与Ca2 +交换。此交换伴随着Ca2+进入细胞内。最终导致细胞内Ca2+超载〔5，6，7 〕。细胞内Ca2+超载将引起心肌细胞挛缩，能量消耗增加，胞质和膜联结的酶系统激活，细胞内第二信使调节紊乱，线粒体能量生成受损及再灌注心律失常，对心肌保护产生不利的影响。本实验高钾晶体或含血去极化组各项指标均较血液超极化组效果差，也证明了这一点。
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大量KCOs作用于心肌细胞膜上的KATP通道，K+外流使膜电位低于-90mv，细胞发生超极化。超极化状态下由于改变了动作电位时程(APD)，Ca2+内流明显减少，心肌收缩力下降，这种机械活动的减弱保存了三磷酸腺苷(ATP)〔8〕；同时膜电位处于一个超极化的水平，离子交换处于最大平衡且净离子流量小，几乎没有离子通道的开放。因此能 量需求是最小的〔9〕。本实验血液超极化组ATP含量及EC值均高于去极化组，且再灌 注后恢复快，心跳规则有力，而对照组恢复差，心跳乏力，证明了血液超极化组能减少心肌细胞的能量消耗，提高心肌能量储备能力，减轻细胞内Ca2+超载。由于细胞内Ca 2+浓度降低以及KCOs对线粒体膜完整性的保护作用，从而减少心肌细胞线粒体膜及呼吸链上的氧自由基的释放或外漏，血液超极化组脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量低于高钾晶体或含 血去极化组，也证实了这一点。另外，血液还能为缺血心肌提供氧及其它代谢底物，血液中也含有丰富的酸碱缓冲物质，有较高的胶体渗透压，因而有利于减轻组织细胞的酸中毒及心肌细胞水肿。此外，我们的实验及一些报道都观察到KCOs能增加再灌注早期冠脉血流〔 10〕，这有益于缺血后心功能的恢复。本实验观察到血液超极化组再灌注心功能的恢复及 光镜结果明显优于去极化组，也说明了这一点。
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实验的结果显示，Pinacidil血液超极化停搏对离体兔心脏模型有确切的心肌保护作用。由于实验排除了神经、心脏前后负荷以及心外体液因素的影响，其结果仅能反映Pinacidil对心脏的直接药理效应，而与临床心脏手术期间体外循环情况相差较远，且Pinacidil对胰、脑及外周循环等多器官都有生物学作用。因此，我们认为有必要进一步探讨血液超极化对 在体及体外循环下的心肌保护效果，为临床研究以及最终的临床应用提供进一步的实验依据 。
参考文献
1.Noma A:ATP-regulated potassium channels in cardiac muscle.Nature ,1983,305:147-148.
2.喻田，刘兴奎，余志豪，等。钾通道开放剂诱导超极化停跳对离体心脏的保护作 用。中华麻醉学杂志,2000,6：365-368.
, 百拇医药
3.高鸿，余志豪，喻田，等.高效液相色谱法测定心肌组织腺苷酸及意义.遵义医学 院学报,1997：20：36-38.
4.Lawton JS,Harrington CC,Allen CT,et al.Myocardial protective with pinacidil cardioplegia in the blood-perfused heart.Ann Thorac Surg,1996,61:1680-1688.
5.Blaustein MP,Dipolo Rreeves JP.Sodium-Calcium exchange.NY Acad Sci,199 1,69:639.
6.Cohen NM,Ledderer WJ.Changes in the cadium current of rat heart ventri cular myocytes during development.J Physiol,1988,406:115-146.
, http://www.100md.com
7.Gettes LS,Casio WE.Effects of acute ischemia on cardiac electrophysiology.The heart and cardiovascular system,1992,2021-2054.
8.Grover GJ,Sleph PG.Protective effect of KATP openers in ischemic rat hearts treated with a potassium cardioplegic solution.J Cardiovase Pharmacol,1995 ,26:698-706.
9.Damiano RJ.The electrophysiology of ischemia and cadioplegia:implicati ons for myocardial protection.J Cardiac Surg,1995,10(Suppl):101-9.
10.Lawton JS,Hsia PW,Allen CT,et al.Myocardioal protection in the acutely injured heart:Hyperpolarizing versus depolarizing hypothermic cardioplegia.J T horac Cardiovasc Surg,1997,113:567-75., http://www.100md.com