抑肽酶对家兔全脑缺血再灌注损伤白细胞介素-8的影响
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体外循环杂志 2002年第1期第4卷
434000 湖北荆州市第一人民医院麻醉科研究生；武汉大学人民医院 肖学钧；范瑞新；黄焕雷
关键词：抑肽酶；脑损伤；再灌注；白细胞介素-8；炎症
摘要：
目的目的：观察抑肽酶对家兔全脑缺血再灌注期血清白细胞介素-8(IL-8)合成 和释放的影响，并探讨其脑保护机制。
方法：利用“六血管”阻断建立全脑缺血模型，24只 家兔随机分为假手术组(A组)，缺血再灌注组(B组)和抑肽酶组(C组)，每组8只。C组缺血30m in再灌注4h，缺血前静注抑肽酶3000KIU·kg-1，随后微量泵输注抑肽酶10000KI U·kg-1·h-1直至实验结束，B组为缺血再灌注组，A组仅分离血管不阻 断血流。分别在缺血前15min(I0)及再灌注30min(R1)、2h(R2)和4h(R3)取颈内静脉血，测定血清IL-8浓度，实验结束取皮层HE染色，光镜观察白细胞浸润及神经元损伤程度。
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结果：C组IL-8随再灌注时间延长无显著性差异。B组由R1时的0.89ng·L-1迅速上升至R3时的1.46ng·L-1，分别增加2.28、2.97、3.74倍，同C组和A组相比有显著性差异；光镜下C组白细胞浸润及神经元损伤程度较B组明显减轻。
结论：抑肽酶能有效抑制IL-8的合成和释放，这可能是抑肽酶减轻脑缺血再灌注损伤的重要机制。
白细胞介素-8 Interleukin-8(IL-8)是一种促进白细胞 激活的细胞因子 ，它与脑缺血再灌注损伤有密切联系〔1〕。Levy等〔2〕对2549例心脏手术进 行回顾性研究发现抑肽酶可使神经精神障碍发生率显著降低，这个现象反映抑肽酶对神经细 胞产生保护作用。本实验利用“六血管”式脑缺血再灌注模型观察抑肽酶对家兔全脑缺血再 灌注期IL-8的影响，以探讨其脑保护机制。
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资料与方法
脑缺血再灌注模型建立 实验动物家兔(质量分数)1%戊巴比妥钠30mg· kg-1静脉麻醉下，气管切开机械通气，保持呼吸末二氧化碳分压在35～45mmHg(1mmHg ＝0.133kPa)。全身肝素化，股动脉插管，多导联生理记录仪监测平均动脉压、中心静脉压 、心率、呼吸末二氧化碳分压、心电图和体温，保持鼓膜温度在37～39℃，右颈内静脉逆行置管于颈静脉球处，供采血用。按“六血管”式复制家兔全脑缺血模型。观察期静滴平衡盐液 10ml·kg-1·h-1。
动物分组及采血时点 健康家兔24只，体重2.0～2.5kg，实验前禁食12h，自由饮水。随机分为假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)和抑肽酶(C组)，每组8只。C组缺血30min再灌注4h，在缺血前10min静注抑肽酶30000KIU·kg-1。继而用Craseby3500微量泵(英国 Graseby公司)持续注入10000KIU·kg-1·h-1(每ml生理盐水含 抑肽酶10000KIU)直至实验结束。B组为单纯缺血再灌注组。A组仅暴露血管，不夹闭，余与B 组相同。分别于缺血前15min(I0)、再灌注30min(R1)、2h(R2)和4h(R3)四个时点采血。
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观察指标 测定颈内静脉血清IL-8和血浆丙二醛malondialdehyde(MDA)、超氧化物歧化 酶superoxidedismutase(SOD)。IL-8用放免法测定，试剂盒由东亚免疫技术研究所提供。M DA、SOD试剂购于南京聚力生物医学工程研究所，用比色法测定。实验结束前取皮层组织 ，伊红染色，光镜观察白细胞浸润和神经元损伤程度。
统计学处理 所有数据进入SPSS8.0软件，用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐，采用方差分析，组间及组内比较采用q检验；若方差不齐，用Dunnett'C进行统计分析。P<0.05为差异有显著性。
表1 各时段三组颈内静脉血清IL-8浓度的变化(ng·L -1`X±s)
时点
A
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B
C
I0
0.45±0.11
0.39±0.09
0.48±0.15
R1
0.43±0.14
0.89±0.10*
0.56±0.12△
R2
, 百拇医药
0.48±0.12
1.16±0.13*
0.68±0.14△
R3
0.51±0.10
1.46±0.23**
0.80±0.17△
IL-8(interleukin-8白细胞介素-8) 与A组比*P<0.05，**P<001；与B组比△P<0.05
表2 各时段三组颈内静脉血浆MDA浓度、SOD活性变化(` X±s)
, 百拇医药
指标
MDA(nmol/L)
SOD(NU/L)
A
B
C
A
B
C
I0
4.12±0.06
3.89 ±0.83
4.01±0.21
, 百拇医药
108±18
125±14
117±15
R1
4.14±0.48
6.05±0.80**
4.82±0.36△
111±12
71±8.5*
91±10*△
R2
, 百拇医药
4.27±0.43
6.41±0.65**
4.60±0.41△
106±17
62±9.7*
84±12*△
R3
4.02±0.45
6.93±0.33**
4.54±0.39△
, 百拇医药
109±15
69±7.2*
87±7.0*△
丙二醛malondialdehyde(MDA)、超氧化物歧化酶superoxide dismutase(SOD) 与A组比*P<0.05，**P<0.01；与B组比 △P<0.05
结 果
一、血清IL-8的变化 C组IL-8在R1～R3各时点同I0比无显著 性差异。B组由R1时的0.89ng·L-1迅速上升至R3时的1.46ng·L〔-1〕 ，同A、C组比有高度显著性差异(P<0.01，表1)。
, 百拇医药
二、血浆MDA、SOD的变化 MDA在C组R1～R3无明显变化，较B组相应对点显著降低(P<0.05)，而B组R1～R3较I0及A组各时点显著升高(P <0.01)。SOD在C组R1～R3较B组同期明显增加(P<0.05，表 2)。
三、病理学结果 光镜观察C组皮层轻度水肿、神经元核固缩较少，白细胞聚积、浸润少， 无血管套。B组皮层水肿，神经元核固缩多见，有白细胞浸润灶和血管套形成。A组皮层神经 细胞结构正常。
讨 论
IL-8是一种由白细胞及内皮细胞等多种细胞在缺血缺氧等诱导作用下合成与释放 的多源性细胞因子〔3〕，是在组织缺血再灌注损伤过程中炎症的启动因素，促进白 细胞激活和氧自由基大量产生，破坏血脑屏障，形成缺血——细胞因子——炎症——组织损 伤恶性循环〔4〕。Muksaida等〔5〕报道阻断IL-8释放可明显减轻炎症，阻止白细胞浸润和减轻脑缺血再灌注损伤，这些研究表明IL-8在脑缺血再灌注过程中起着重要作用。
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本实验结果显示，C组IL-8水平在R1～R3时无明显变化，B组则随再灌注时间延长成倍增加，分别为2.28、2.97和3.74倍，显著高于I0及C组和A组同期值。这些结果表明抑肽酶影响了IL-8的合成和释放。根据光镜结果，C组无明显白细胞浸润、聚积和血管套现象，显示白细胞无明显激活。B组却不同，可见白细胞浸润灶和血管套形成，反映大量白细胞激活。另外，Weigand等〔6〕证实脑缺血再灌注时白细胞激活程度与MDA含量密切相关，白细胞激活是自由基产生的一个重要来源，而MDA是氧自由基的代谢产物，它可间接反 映自由基的产量，C组R1～R3的MDA产生显著低于B组，而前者SOD含量又高于后者。B组MDA明显升高，反映氧自由基产物显著增加。自由基增加又可直接加速IL-8合成和释放。由此可见，IL-8、白细胞激活和氧自由基相互交织在一起共同介导脑缺血再灌注损伤。C组未见白细胞激活，与MDA含量较低相吻合，说明抑肽酶能抑制白细胞激活，减少自由基的生成，降低MDA产生。又因IL-8本身能耐受抑肽酶的降解，使其不断聚集增加，并促进氧自由基产生。自由基增加又加重炎症和促进IL-8等细胞因子释放〔7〕，同时IL-8又 可促进自由基增加和炎症的发生、发展，从而形成恶性循环和放大效应〔8〕。C组核 固缩的细胞较少，B组损伤严重，这种不同的病理学改变或许是B、C两组IL-8和MDA差异所致。从上述IL-8与白细胞激活、IL-8与MDA以及病理改变三方面看，抑肽酶能抑制IL-8的产生和释放，阻止白细胞激活，减少氧自由基生成，提高SOD活性，增强其清除氧自由基能力。其机制可能与它阻断氧自由基与IL-8之间的恶性循环有关，这可能是抑肽酶保护脑再 灌注损伤的重要机制。
, 百拇医药
参考文献
1.曹学兵，孙圣刚，黄怀均，等CINC/IL-8与脑缺血再灌注损伤.国外医学 ·神经病学神经外科学分册，1999，26：155-157.
2.Levy J,Ramsay J,Murkin J.Aprotinin reduces the incidence of stroke following cardiac surgery.Circulation,1996,94:535-538.]
3.Hofman FM,Chen P,Jeyaseelan R,et al.Endothelin-1 induces production of the neutrophil cells.Blood,1998,92:3064-3072.
4.Matsumoto T,Ikeda K,Mukaida N,et al.Prevention of cerebral edema and infarct in cerebral reperfusion injury by an antibody to interleukin-8.Lab Invest ,1997,77:119-125.
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5.Muksaiad N,Matsumoto T.Yokoi K,et al.Inhibition of neutrophil-mediated acute inflammation injury by antibody against interleukin-8.Inflamm Res,199 8,47:S151-157.
6.Weigand MA,Laipple A,Plascke,et al.Concentration changes of malondi aldehyde across the cerebral vascular bed and shedding of L-selectin during caro tid endarterectomy.Stroke,1999,30:306-311.
7.Helen F,Anne M,Nigel R,et al.The effect of midazolam and propofol o ninterleukin-8 from human polymophonuclear leukocytes.Anesth Analg,1998,86:1289- 1293.
8.Suzuki S,Konno H,Nakamura S,et al.Role of cytokines in hepatic ischemia and reperfusion injury.Nippon Geka Gakkai Zasshi,1999,100:325-330., http://www.100md.com
关键词：抑肽酶；脑损伤；再灌注；白细胞介素-8；炎症
摘要：
目的目的：观察抑肽酶对家兔全脑缺血再灌注期血清白细胞介素-8(IL-8)合成 和释放的影响，并探讨其脑保护机制。
方法：利用“六血管”阻断建立全脑缺血模型，24只 家兔随机分为假手术组(A组)，缺血再灌注组(B组)和抑肽酶组(C组)，每组8只。C组缺血30m in再灌注4h，缺血前静注抑肽酶3000KIU·kg-1，随后微量泵输注抑肽酶10000KI U·kg-1·h-1直至实验结束，B组为缺血再灌注组，A组仅分离血管不阻 断血流。分别在缺血前15min(I0)及再灌注30min(R1)、2h(R2)和4h(R3)取颈内静脉血，测定血清IL-8浓度，实验结束取皮层HE染色，光镜观察白细胞浸润及神经元损伤程度。
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结果：C组IL-8随再灌注时间延长无显著性差异。B组由R1时的0.89ng·L-1迅速上升至R3时的1.46ng·L-1，分别增加2.28、2.97、3.74倍，同C组和A组相比有显著性差异；光镜下C组白细胞浸润及神经元损伤程度较B组明显减轻。
结论：抑肽酶能有效抑制IL-8的合成和释放，这可能是抑肽酶减轻脑缺血再灌注损伤的重要机制。
白细胞介素-8 Interleukin-8(IL-8)是一种促进白细胞 激活的细胞因子 ，它与脑缺血再灌注损伤有密切联系〔1〕。Levy等〔2〕对2549例心脏手术进 行回顾性研究发现抑肽酶可使神经精神障碍发生率显著降低，这个现象反映抑肽酶对神经细 胞产生保护作用。本实验利用“六血管”式脑缺血再灌注模型观察抑肽酶对家兔全脑缺血再 灌注期IL-8的影响，以探讨其脑保护机制。
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资料与方法
脑缺血再灌注模型建立 实验动物家兔(质量分数)1%戊巴比妥钠30mg· kg-1静脉麻醉下，气管切开机械通气，保持呼吸末二氧化碳分压在35～45mmHg(1mmHg ＝0.133kPa)。全身肝素化，股动脉插管，多导联生理记录仪监测平均动脉压、中心静脉压 、心率、呼吸末二氧化碳分压、心电图和体温，保持鼓膜温度在37～39℃，右颈内静脉逆行置管于颈静脉球处，供采血用。按“六血管”式复制家兔全脑缺血模型。观察期静滴平衡盐液 10ml·kg-1·h-1。
动物分组及采血时点 健康家兔24只，体重2.0～2.5kg，实验前禁食12h，自由饮水。随机分为假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)和抑肽酶(C组)，每组8只。C组缺血30min再灌注4h，在缺血前10min静注抑肽酶30000KIU·kg-1。继而用Craseby3500微量泵(英国 Graseby公司)持续注入10000KIU·kg-1·h-1(每ml生理盐水含 抑肽酶10000KIU)直至实验结束。B组为单纯缺血再灌注组。A组仅暴露血管，不夹闭，余与B 组相同。分别于缺血前15min(I0)、再灌注30min(R1)、2h(R2)和4h(R3)四个时点采血。
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观察指标 测定颈内静脉血清IL-8和血浆丙二醛malondialdehyde(MDA)、超氧化物歧化 酶superoxidedismutase(SOD)。IL-8用放免法测定，试剂盒由东亚免疫技术研究所提供。M DA、SOD试剂购于南京聚力生物医学工程研究所，用比色法测定。实验结束前取皮层组织 ，伊红染色，光镜观察白细胞浸润和神经元损伤程度。
统计学处理 所有数据进入SPSS8.0软件，用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐，采用方差分析，组间及组内比较采用q检验；若方差不齐，用Dunnett'C进行统计分析。P<0.05为差异有显著性。
表1 各时段三组颈内静脉血清IL-8浓度的变化(ng·L -1`X±s)
时点
A
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B
C
I0
0.45±0.11
0.39±0.09
0.48±0.15
R1
0.43±0.14
0.89±0.10*
0.56±0.12△
R2
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0.48±0.12
1.16±0.13*
0.68±0.14△
R3
0.51±0.10
1.46±0.23**
0.80±0.17△
IL-8(interleukin-8白细胞介素-8) 与A组比*P<0.05，**P<001；与B组比△P<0.05
表2 各时段三组颈内静脉血浆MDA浓度、SOD活性变化(` X±s)
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指标
MDA(nmol/L)
SOD(NU/L)
A
B
C
A
B
C
I0
4.12±0.06
3.89 ±0.83
4.01±0.21
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108±18
125±14
117±15
R1
4.14±0.48
6.05±0.80**
4.82±0.36△
111±12
71±8.5*
91±10*△
R2
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4.27±0.43
6.41±0.65**
4.60±0.41△
106±17
62±9.7*
84±12*△
R3
4.02±0.45
6.93±0.33**
4.54±0.39△
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109±15
69±7.2*
87±7.0*△
丙二醛malondialdehyde(MDA)、超氧化物歧化酶superoxide dismutase(SOD) 与A组比*P<0.05，**P<0.01；与B组比 △P<0.05
结 果
一、血清IL-8的变化 C组IL-8在R1～R3各时点同I0比无显著 性差异。B组由R1时的0.89ng·L-1迅速上升至R3时的1.46ng·L〔-1〕 ，同A、C组比有高度显著性差异(P<0.01，表1)。
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二、血浆MDA、SOD的变化 MDA在C组R1～R3无明显变化，较B组相应对点显著降低(P<0.05)，而B组R1～R3较I0及A组各时点显著升高(P <0.01)。SOD在C组R1～R3较B组同期明显增加(P<0.05，表 2)。
三、病理学结果 光镜观察C组皮层轻度水肿、神经元核固缩较少，白细胞聚积、浸润少， 无血管套。B组皮层水肿，神经元核固缩多见，有白细胞浸润灶和血管套形成。A组皮层神经 细胞结构正常。
讨 论
IL-8是一种由白细胞及内皮细胞等多种细胞在缺血缺氧等诱导作用下合成与释放 的多源性细胞因子〔3〕，是在组织缺血再灌注损伤过程中炎症的启动因素，促进白 细胞激活和氧自由基大量产生，破坏血脑屏障，形成缺血——细胞因子——炎症——组织损 伤恶性循环〔4〕。Muksaida等〔5〕报道阻断IL-8释放可明显减轻炎症，阻止白细胞浸润和减轻脑缺血再灌注损伤，这些研究表明IL-8在脑缺血再灌注过程中起着重要作用。
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本实验结果显示，C组IL-8水平在R1～R3时无明显变化，B组则随再灌注时间延长成倍增加，分别为2.28、2.97和3.74倍，显著高于I0及C组和A组同期值。这些结果表明抑肽酶影响了IL-8的合成和释放。根据光镜结果，C组无明显白细胞浸润、聚积和血管套现象，显示白细胞无明显激活。B组却不同，可见白细胞浸润灶和血管套形成，反映大量白细胞激活。另外，Weigand等〔6〕证实脑缺血再灌注时白细胞激活程度与MDA含量密切相关，白细胞激活是自由基产生的一个重要来源，而MDA是氧自由基的代谢产物，它可间接反 映自由基的产量，C组R1～R3的MDA产生显著低于B组，而前者SOD含量又高于后者。B组MDA明显升高，反映氧自由基产物显著增加。自由基增加又可直接加速IL-8合成和释放。由此可见，IL-8、白细胞激活和氧自由基相互交织在一起共同介导脑缺血再灌注损伤。C组未见白细胞激活，与MDA含量较低相吻合，说明抑肽酶能抑制白细胞激活，减少自由基的生成，降低MDA产生。又因IL-8本身能耐受抑肽酶的降解，使其不断聚集增加，并促进氧自由基产生。自由基增加又加重炎症和促进IL-8等细胞因子释放〔7〕，同时IL-8又 可促进自由基增加和炎症的发生、发展，从而形成恶性循环和放大效应〔8〕。C组核 固缩的细胞较少，B组损伤严重，这种不同的病理学改变或许是B、C两组IL-8和MDA差异所致。从上述IL-8与白细胞激活、IL-8与MDA以及病理改变三方面看，抑肽酶能抑制IL-8的产生和释放，阻止白细胞激活，减少氧自由基生成，提高SOD活性，增强其清除氧自由基能力。其机制可能与它阻断氧自由基与IL-8之间的恶性循环有关，这可能是抑肽酶保护脑再 灌注损伤的重要机制。
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参考文献
1.曹学兵，孙圣刚，黄怀均，等CINC/IL-8与脑缺血再灌注损伤.国外医学 ·神经病学神经外科学分册，1999，26：155-157.
2.Levy J,Ramsay J,Murkin J.Aprotinin reduces the incidence of stroke following cardiac surgery.Circulation,1996,94:535-538.]
3.Hofman FM,Chen P,Jeyaseelan R,et al.Endothelin-1 induces production of the neutrophil cells.Blood,1998,92:3064-3072.
4.Matsumoto T,Ikeda K,Mukaida N,et al.Prevention of cerebral edema and infarct in cerebral reperfusion injury by an antibody to interleukin-8.Lab Invest ,1997,77:119-125.
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6.Weigand MA,Laipple A,Plascke,et al.Concentration changes of malondi aldehyde across the cerebral vascular bed and shedding of L-selectin during caro tid endarterectomy.Stroke,1999,30:306-311.
7.Helen F,Anne M,Nigel R,et al.The effect of midazolam and propofol o ninterleukin-8 from human polymophonuclear leukocytes.Anesth Analg,1998,86:1289- 1293.
8.Suzuki S,Konno H,Nakamura S,et al.Role of cytokines in hepatic ischemia and reperfusion injury.Nippon Geka Gakkai Zasshi,1999,100:325-330., http://www.100md.com