线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道在预处理心肌保护中的作用
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体外循环杂志 2002年第1期第4卷
100037 北京，中国医学科学院阜外心血管病医院麻醉与体外循环研究室 魏珂；闵苏；龙村
关键词：
摘要：
预处理对心肌的保护已成为国内外心血管领域研究的热点预处理对心肌的保护已成为国内外心血管领域研究的热点。预处理保护的机制复杂，包括一系列内源性物质的生成及信号的传导，其中三磷酸敏感
性钾通道(KATP)在其中发挥了重要作用。既往认为肌膜上的(KATP)通道(sarco lemmal/surface KATP channel,sKATP)是预处理的终末效应器，但最近的研究明位于线粒体内膜上的KATP通道(mitochondrial KATP channel,mitoKATP)在心肌保护中可能发挥着更重要的作用〔1〕。
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1
线粒体KATP通道的结构特点
K+通道实际是一种对K+有选择性通透效应的跨膜蛋白，是迄今发现的离子通道家族里种类最多的一类通道〔2〕。现在认为sKATP是由四个内向整流钾通道(Kir6.X家
族)亚单位和四个硫脲类受体(SUR)组成的八聚体。Kir6.X家族已发现两组成员：Kir6.1和Ki r6.2，SUR也发现两种：SUR1和SUR2，SUR2又有两种不同的剪接体形式即SUR2A和SUR2B。KATP在各个组织中的表达分布是不同的。心肌细胞膜上的KATP通道由SUR2A/K ir6.2组成，而SUR1/Kir6.2、SUR2B/Kir6.2则分别存在于胰腺β细胞和平滑肌细胞〔3，4〕。Inoue发现ATP耗竭能激活mitoKATP，较之sKATP，mitoKATP具有更小的单通道电导〔5〕。线粒体内膜KATP通道可能也是由 SUR和Kir组成。Susuki利用免疫定位的方法发现Kir6.1存在于线粒体〔6〕，而Liu的研究则表明，在众多的SUR和Kir亚单位组合中，只有SUR1/ ir6.1符合mitoKATP通道的药理学特性。
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2.mitoKATP通道与心肌保护
Garlid等首先在离体鼠心的实验中发现KATP通道开放剂二氮嗪(diazoxide)能对局部
缺血再灌注心肌提供保护作用，所用剂量明显小于开放sKATP通道的剂量，而与开放m itoKATP通道的剂量相符，且该保护作用能被mitoKATP通道的特异性阻断剂5-H D所抑制，提示二氮嗪通过开放mitoKATP通道而非sKATP通道发挥作用〔7〕。同时Gdrlid还证明二氮嗪开放mitoKATP通道的效能较其开放sKATP通道的效能强2000倍。目前普遍将二氮嗪作为mitoKATP通道的特异性激活剂。最近的研究在人心肌上也证实了mitoKATP通道的作用，Bell发现mitoKATP通道开放参与了缺血预处理及阿片受体激动剂预处理对人心房肌小梁的保护〔8〕。
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2.1
线粒体KATP通道与早期保护
对缺血预处理的研究发现预处理具有双相保护时程，即早期保护和延迟保护，现已证明mito KATP通道在这两个阶段都发挥了重要作用。早期保护发生迅速，持续约1～2小时。其发生机制目前认为主要是短暂缺血后，缺血区心肌细胞和血管内皮细胞释放一系列内源性物质，如腺苷、去甲肾上腺素等，激活心肌细胞表面的受体，在酶蛋白调节系统的参与下，经过一系列信号传导，最后通过终末效应器发挥保护作用。在众多的终末效应器中，sKATP通道被认为是其中之一。当该通道开放后，能在心肌细胞复极2期促进K+外流，缩短动作电位时程，减慢Ca2+内流，减少了细胞内钙超载的发生，并且还通过抑制心肌收缩而减少能量消耗、维持ATP水平。对sKATP通道的作用仍有争议，Yao等在狗心脏实验中发现动作电位缩短与心肌保护之间并无直接联系〔9〕，而Grover也在随后的实验
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中发现小剂量的KATP通道开放剂cromakalim即能明显减少缺血再灌注心肌的梗塞面积
，而该剂量对动作电位并无影响〔10〕。mitoKATP通道在预处理早期保护中的
作用机制仍有待进一步研究。Pain发现在缺血前30分钟单独给予二氮嗪能明显减少缺血后心肌梗塞面积，二氮嗪与5-HD同时合用保护作用消失，但若在二氮嗪作用一段时间后再给予5- HD则对保护作用无影响，因此推测二氮嗪引起的mitoKATP通道开放仅是早期保护的一个启动因子〔11〕。而Fryer则观察到无论在二氮嗪给药前或后给予5-HD均能阻断其
保护作用，认为mitoKATP通道在心肌保护的启动和调节过程中都发挥作用。
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2.2线粒体KATP通道与延迟保护
延迟保护又称第二保护窗口，出现于预处理后24小时左右。其发生与酪氨酸激酶和蛋白激酶 C(protein kinase C,PKC)的激活，热休克蛋白72、诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS)的表达，以及NO的生成有关。最近的研究在缺血、热休克蛋白、腺苷受体激动剂、MLA预处理诱导的延迟保护作用中都发现有mitoKATP通道开放的参与〔12〕。Takashi发现在缺血前24小时给予单剂量的二氮嗪能对心肌提供保护，且无论在二氮嗪给药前或在缺血前10分钟给予5-HD均能阻断前者的作用，提示与早期保护相似，线粒体KATP通道既可触发也可介导保护作用〔13〕。
3
线粒体KATP通道在心肌保护中的作用机制
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线粒体KATP通道开放对缺血-再灌注心肌的保护机制现仍不十分清楚，可能与以下几个方面有关。
3.1线粒体Ca2+调节
在神经细胞和心肌细胞中均发现线粒体具有很强的缓冲细胞内Ca2+浓度的能力。Ohata在成年兔心肌细胞中发现，伴随心肌兴奋-收缩藕联过程线粒体内有快速的Ca2+转移
，即肌肉收缩时线粒体吸收Ca2+而在舒张过程中则释放Ca2+入胞浆〔14〕。线粒体内膜电位差是驱动Ca2+内流的主要动力。按照化学渗透学说，线粒体内膜
电位的形成主要与质子泵有关。线粒体三羧酸循环产生的NADH和FADH2在氧化过程中，其高能电子在呼吸链(电子内传递链)上传递，释放的能量使质子(H+)通过内膜上的质子泵从内膜的基质侧移至膜间腔。因内膜对H+不能自由通透，从而在内膜两侧形成电化学质子梯度，膜内为(+)，膜外(-)。在心肌收缩时，肌浆内Ca2+浓度上升，在电位差的作用下，Ca2+通过线粒体内膜上的单向Ca2+通道进入线粒体基质；肌肉舒张时，线粒体可能通过Na+-Ca2+交换的方式将Ca2+释入胞浆。线粒体KATP通道开放使K+内流进入线粒体，降低了跨膜电位差，膜去极化后减小Ca2+内流动力，抑制了Ca2+内流，从而有效防止线粒体内钙超载的〔15〕。线粒体钙超载能破坏电子传递链的复合物Ⅰ，影响ATP的合成，增加细胞毒性自由基的释放，增加线粒体渗透性，最终导致细胞的损伤和死亡〔16〕。Holmuhamedov等在游离心肌线粒体上发现KATP通道开放剂能抑制线粒体对Ca2+的摄取，且抑制作用与开放剂剂量呈依赖性关系。同时，Holmuhamedov还发现二氮嗪能引起线粒体内积聚的Ca2+释放，但该作
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用与mitoKATP通道的开放无关〔17〕。
另一方面，由于进入线粒体的Ca2+减少，引起胞浆内Ca2+浓度增加。既往发现在缺钙—复钙、增加细胞外Ca2+浓度或激活β肾上腺素受体后都能一过性增加胞内 Ca2+浓度，引起PKC激活，对心肌产生预处理保护〔18～20〕。目前推测
线粒体KATP通道开放也能通过短暂增加心肌收缩时肌浆Ca2+浓度而诱发保护作用。Wang发现PKC抑制剂chelerythrine能阻断二氮嗪的心肌保护作用，证实了上述观点〔21〕。
3.2
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线粒体膨胀
mitoKATP通道开放后，伴随K+内流线粒体内渗透压升高，胞浆水分进入线粒体内引起线粒体基质肿胀。线粒体基质体积对其能量生成的调节有重要作用。Halestrap的研究表明线粒体体积适当增加(10%以内)能激活脂肪酸氧化和电子转移，促进ATP的生成〔22〕。Fryer等通过游离线粒体的方法发现，经缺血预处理或二氮嗪预处理的心肌缺血后其线粒体合成ATP的能力与未经预处理的心肌相比有明显提高，这种提高能被5-HD所抑制，提示与mitoKATP开放有关〔23〕。虽然适度的体积增加能促进能量生成，但若线粒体过度膨胀则会导致功能减退或损伤，研究表明线粒体内存在着调节其体积稳定的因素。Galid认为在KATP通道开放阳离子内流的同时伴随阴离子的外流，其通道也存在于线
粒体内膜，称内膜阴离子通道(inner membrane anion channel,IMAC)〔24〕，IMAC被认为是防止线粒体过度膨胀的安全瓣。阳离子内流和阴离子外流达到平衡才能使线粒体处于最佳的体积，从而在缺血再灌注过程中保护自由功能。
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3.3
自由基的生成
在缺血-再灌注过程中氧自由基的生成主要有两个来源，其一是黄嘌呤氧化酶途径。缺血时，ATP快速水解成ADP和AMP，AMP经过嘌呤代谢途径最后转变成黄嘌呤，黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶氧化的过程中生成氧自由基。线粒体呼吸链是自由基的另一来源。Vandenhoek在离体心肌细胞的缺血-再灌注模型中证实线粒体电子转移与ROS的生成有关〔25〕。ROS在线粒体中产生的部位估计在辅酶Q(泛醌)，当缺氧抑制呼吸链时，辅酶Q被还原成半泛醌，后者在再灌注过程中与氧发生反应生成氧自由基。氧自由基一经生成在体内发生连锁反应，生成多种具有高活性的氧还原中间产物，统称为活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。ROS对呼吸链组成成分有直接作用，其中主要是复合物Ⅰ、复合物Ⅲ、ATP酶及腺苷转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT)〔26〕，ROS可能通过改变蛋白内含硫基团的结构，使呼吸链活性受损。ROS在缺血-再灌注过程中能引起细胞损伤，但最近发现ROS同时也是预处理信号传导过程中的一个启动因子。在缺血、腺苷、乙酰胆碱诱导的预处理中都发现在早期有ROS生成增加，而5-HD能拮抗这种效应，提示minK〔ATP〕通道开放能增加线粒体
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内ROS的生成，刺激ROS在线粒体内积聚而启动心肌保护作用〔27〕。研究还发现，在再灌注时minKATP通道开放又能降低ROS的生成，减少POS对细胞的不可逆损伤。Vanden在再灌注起始时给予KATP通道开放剂pinacidil，发现再灌注后ROS明显减少，该作用也能被5-HD所抑制〔28〕。因此，mitoKATP通道开放既能增加也能减少ROS的生成于开放的时机。
mitoKATP通道在心肌的预处理保护中发挥了重要作用，但仍有许多问题尚待解决。如在已知的可能的机制中，究竟是何种途径发挥着主导作用？sK ATP通道是否参与心肌保护，与线粒体KATP通道之间有无联系？mitoKATP通道的确切结构及有无较二氮嗪特异性更高的开放剂等。相信随着对线粒体KATP通道研究的深入，将会有助于对整个预处理机制的了解，并为缺血心肌的保护提供一种新的手段。
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参考文献
1.Wang S,James C,Liu Y.Dual roles of mitochondrial KATP chan nels in diazoxide-mediated protection in isolated rabbit hearts.Am J Physiol Heart Circ 2001,280:H246-H256.
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28.Vanden Hoek TL,Becker LB,Shao ZH,et al.Preconditioning in cardiomyocytes protects by attenuating oxidant stress at reperfusion.Circ Res,2000,86:541-5 48., 百拇医药
关键词：
摘要：
预处理对心肌的保护已成为国内外心血管领域研究的热点预处理对心肌的保护已成为国内外心血管领域研究的热点。预处理保护的机制复杂，包括一系列内源性物质的生成及信号的传导，其中三磷酸敏感
性钾通道(KATP)在其中发挥了重要作用。既往认为肌膜上的(KATP)通道(sarco lemmal/surface KATP channel,sKATP)是预处理的终末效应器，但最近的研究明位于线粒体内膜上的KATP通道(mitochondrial KATP channel,mitoKATP)在心肌保护中可能发挥着更重要的作用〔1〕。
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线粒体KATP通道的结构特点
K+通道实际是一种对K+有选择性通透效应的跨膜蛋白，是迄今发现的离子通道家族里种类最多的一类通道〔2〕。现在认为sKATP是由四个内向整流钾通道(Kir6.X家
族)亚单位和四个硫脲类受体(SUR)组成的八聚体。Kir6.X家族已发现两组成员：Kir6.1和Ki r6.2，SUR也发现两种：SUR1和SUR2，SUR2又有两种不同的剪接体形式即SUR2A和SUR2B。KATP在各个组织中的表达分布是不同的。心肌细胞膜上的KATP通道由SUR2A/K ir6.2组成，而SUR1/Kir6.2、SUR2B/Kir6.2则分别存在于胰腺β细胞和平滑肌细胞〔3，4〕。Inoue发现ATP耗竭能激活mitoKATP，较之sKATP，mitoKATP具有更小的单通道电导〔5〕。线粒体内膜KATP通道可能也是由 SUR和Kir组成。Susuki利用免疫定位的方法发现Kir6.1存在于线粒体〔6〕，而Liu的研究则表明，在众多的SUR和Kir亚单位组合中，只有SUR1/ ir6.1符合mitoKATP通道的药理学特性。
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2.mitoKATP通道与心肌保护
Garlid等首先在离体鼠心的实验中发现KATP通道开放剂二氮嗪(diazoxide)能对局部
缺血再灌注心肌提供保护作用，所用剂量明显小于开放sKATP通道的剂量，而与开放m itoKATP通道的剂量相符，且该保护作用能被mitoKATP通道的特异性阻断剂5-H D所抑制，提示二氮嗪通过开放mitoKATP通道而非sKATP通道发挥作用〔7〕。同时Gdrlid还证明二氮嗪开放mitoKATP通道的效能较其开放sKATP通道的效能强2000倍。目前普遍将二氮嗪作为mitoKATP通道的特异性激活剂。最近的研究在人心肌上也证实了mitoKATP通道的作用，Bell发现mitoKATP通道开放参与了缺血预处理及阿片受体激动剂预处理对人心房肌小梁的保护〔8〕。
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2.1
线粒体KATP通道与早期保护
对缺血预处理的研究发现预处理具有双相保护时程，即早期保护和延迟保护，现已证明mito KATP通道在这两个阶段都发挥了重要作用。早期保护发生迅速，持续约1～2小时。其发生机制目前认为主要是短暂缺血后，缺血区心肌细胞和血管内皮细胞释放一系列内源性物质，如腺苷、去甲肾上腺素等，激活心肌细胞表面的受体，在酶蛋白调节系统的参与下，经过一系列信号传导，最后通过终末效应器发挥保护作用。在众多的终末效应器中，sKATP通道被认为是其中之一。当该通道开放后，能在心肌细胞复极2期促进K+外流，缩短动作电位时程，减慢Ca2+内流，减少了细胞内钙超载的发生，并且还通过抑制心肌收缩而减少能量消耗、维持ATP水平。对sKATP通道的作用仍有争议，Yao等在狗心脏实验中发现动作电位缩短与心肌保护之间并无直接联系〔9〕，而Grover也在随后的实验
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中发现小剂量的KATP通道开放剂cromakalim即能明显减少缺血再灌注心肌的梗塞面积
，而该剂量对动作电位并无影响〔10〕。mitoKATP通道在预处理早期保护中的
作用机制仍有待进一步研究。Pain发现在缺血前30分钟单独给予二氮嗪能明显减少缺血后心肌梗塞面积，二氮嗪与5-HD同时合用保护作用消失，但若在二氮嗪作用一段时间后再给予5- HD则对保护作用无影响，因此推测二氮嗪引起的mitoKATP通道开放仅是早期保护的一个启动因子〔11〕。而Fryer则观察到无论在二氮嗪给药前或后给予5-HD均能阻断其
保护作用，认为mitoKATP通道在心肌保护的启动和调节过程中都发挥作用。
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2.2线粒体KATP通道与延迟保护
延迟保护又称第二保护窗口，出现于预处理后24小时左右。其发生与酪氨酸激酶和蛋白激酶 C(protein kinase C,PKC)的激活，热休克蛋白72、诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS)的表达，以及NO的生成有关。最近的研究在缺血、热休克蛋白、腺苷受体激动剂、MLA预处理诱导的延迟保护作用中都发现有mitoKATP通道开放的参与〔12〕。Takashi发现在缺血前24小时给予单剂量的二氮嗪能对心肌提供保护，且无论在二氮嗪给药前或在缺血前10分钟给予5-HD均能阻断前者的作用，提示与早期保护相似，线粒体KATP通道既可触发也可介导保护作用〔13〕。
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线粒体KATP通道在心肌保护中的作用机制
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线粒体KATP通道开放对缺血-再灌注心肌的保护机制现仍不十分清楚，可能与以下几个方面有关。
3.1线粒体Ca2+调节
在神经细胞和心肌细胞中均发现线粒体具有很强的缓冲细胞内Ca2+浓度的能力。Ohata在成年兔心肌细胞中发现，伴随心肌兴奋-收缩藕联过程线粒体内有快速的Ca2+转移
，即肌肉收缩时线粒体吸收Ca2+而在舒张过程中则释放Ca2+入胞浆〔14〕。线粒体内膜电位差是驱动Ca2+内流的主要动力。按照化学渗透学说，线粒体内膜
电位的形成主要与质子泵有关。线粒体三羧酸循环产生的NADH和FADH2在氧化过程中，其高能电子在呼吸链(电子内传递链)上传递，释放的能量使质子(H+)通过内膜上的质子泵从内膜的基质侧移至膜间腔。因内膜对H+不能自由通透，从而在内膜两侧形成电化学质子梯度，膜内为(+)，膜外(-)。在心肌收缩时，肌浆内Ca2+浓度上升，在电位差的作用下，Ca2+通过线粒体内膜上的单向Ca2+通道进入线粒体基质；肌肉舒张时，线粒体可能通过Na+-Ca2+交换的方式将Ca2+释入胞浆。线粒体KATP通道开放使K+内流进入线粒体，降低了跨膜电位差，膜去极化后减小Ca2+内流动力，抑制了Ca2+内流，从而有效防止线粒体内钙超载的〔15〕。线粒体钙超载能破坏电子传递链的复合物Ⅰ，影响ATP的合成，增加细胞毒性自由基的释放，增加线粒体渗透性，最终导致细胞的损伤和死亡〔16〕。Holmuhamedov等在游离心肌线粒体上发现KATP通道开放剂能抑制线粒体对Ca2+的摄取，且抑制作用与开放剂剂量呈依赖性关系。同时，Holmuhamedov还发现二氮嗪能引起线粒体内积聚的Ca2+释放，但该作
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用与mitoKATP通道的开放无关〔17〕。
另一方面，由于进入线粒体的Ca2+减少，引起胞浆内Ca2+浓度增加。既往发现在缺钙—复钙、增加细胞外Ca2+浓度或激活β肾上腺素受体后都能一过性增加胞内 Ca2+浓度，引起PKC激活，对心肌产生预处理保护〔18～20〕。目前推测
线粒体KATP通道开放也能通过短暂增加心肌收缩时肌浆Ca2+浓度而诱发保护作用。Wang发现PKC抑制剂chelerythrine能阻断二氮嗪的心肌保护作用，证实了上述观点〔21〕。
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线粒体膨胀
mitoKATP通道开放后，伴随K+内流线粒体内渗透压升高，胞浆水分进入线粒体内引起线粒体基质肿胀。线粒体基质体积对其能量生成的调节有重要作用。Halestrap的研究表明线粒体体积适当增加(10%以内)能激活脂肪酸氧化和电子转移，促进ATP的生成〔22〕。Fryer等通过游离线粒体的方法发现，经缺血预处理或二氮嗪预处理的心肌缺血后其线粒体合成ATP的能力与未经预处理的心肌相比有明显提高，这种提高能被5-HD所抑制，提示与mitoKATP开放有关〔23〕。虽然适度的体积增加能促进能量生成，但若线粒体过度膨胀则会导致功能减退或损伤，研究表明线粒体内存在着调节其体积稳定的因素。Galid认为在KATP通道开放阳离子内流的同时伴随阴离子的外流，其通道也存在于线
粒体内膜，称内膜阴离子通道(inner membrane anion channel,IMAC)〔24〕，IMAC被认为是防止线粒体过度膨胀的安全瓣。阳离子内流和阴离子外流达到平衡才能使线粒体处于最佳的体积，从而在缺血再灌注过程中保护自由功能。
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3.3
自由基的生成
在缺血-再灌注过程中氧自由基的生成主要有两个来源，其一是黄嘌呤氧化酶途径。缺血时，ATP快速水解成ADP和AMP，AMP经过嘌呤代谢途径最后转变成黄嘌呤，黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶氧化的过程中生成氧自由基。线粒体呼吸链是自由基的另一来源。Vandenhoek在离体心肌细胞的缺血-再灌注模型中证实线粒体电子转移与ROS的生成有关〔25〕。ROS在线粒体中产生的部位估计在辅酶Q(泛醌)，当缺氧抑制呼吸链时，辅酶Q被还原成半泛醌，后者在再灌注过程中与氧发生反应生成氧自由基。氧自由基一经生成在体内发生连锁反应，生成多种具有高活性的氧还原中间产物，统称为活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)。ROS对呼吸链组成成分有直接作用，其中主要是复合物Ⅰ、复合物Ⅲ、ATP酶及腺苷转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT)〔26〕，ROS可能通过改变蛋白内含硫基团的结构，使呼吸链活性受损。ROS在缺血-再灌注过程中能引起细胞损伤，但最近发现ROS同时也是预处理信号传导过程中的一个启动因子。在缺血、腺苷、乙酰胆碱诱导的预处理中都发现在早期有ROS生成增加，而5-HD能拮抗这种效应，提示minK〔ATP〕通道开放能增加线粒体
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内ROS的生成，刺激ROS在线粒体内积聚而启动心肌保护作用〔27〕。研究还发现，在再灌注时minKATP通道开放又能降低ROS的生成，减少POS对细胞的不可逆损伤。Vanden在再灌注起始时给予KATP通道开放剂pinacidil，发现再灌注后ROS明显减少，该作用也能被5-HD所抑制〔28〕。因此，mitoKATP通道开放既能增加也能减少ROS的生成于开放的时机。
mitoKATP通道在心肌的预处理保护中发挥了重要作用，但仍有许多问题尚待解决。如在已知的可能的机制中，究竟是何种途径发挥着主导作用？sK ATP通道是否参与心肌保护，与线粒体KATP通道之间有无联系？mitoKATP通道的确切结构及有无较二氮嗪特异性更高的开放剂等。相信随着对线粒体KATP通道研究的深入，将会有助于对整个预处理机制的了解，并为缺血心肌的保护提供一种新的手段。
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