三甲氧苄嗪改善HTK液和UW液心脏保存效果的实验研究
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体外循环杂志 2001年第2期第3卷
100037 中国医学科学院阜外心血管病医院麻醉体外循环研究室 史世勇
关键词：UW液；HTK液；三甲氧苄嗪(TMZ)；心脏保存
摘要：
目的目的：研究UW液和HTK液(两种心脏保存液)在分别加入三甲氧苄嗪(TMZ)后(TMZ-10-6M)对心脏保存效果的影响。
方法：以改良的Langendorff离体鼠心灌注模型，观察UW液、HTK液分别加入TMZ后(TMZ-10-6M)，离体鼠心在4℃保存6小时后血流动力学、冠脉流出液心肌酶漏出量、心肌含水量、心肌ATP、MDA含量、心肌超微结构的变化。
结果：UW液和HTK液加入TMZ组与未加入TMZ组相比，前者复灌后心功能恢复率明显增高(P<0.01)；心肌含水量及丙二醋含量较低(P<0.05)；心肌酶漏出量明显减少(P<0.01)；心肌ATP水平得到很好地维持(P<0.01)；心肌超微结构尤其是线粒体结构改变轻，损伤小；上述各项指标尤以HTK+TMZ组为最佳。
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结论：1.TMZ加入UW液和HTK液后(TMZ-10-6M)可明显改善缺血心肌的功能。2.TMZ可明显减少心肌含水量、心肌酶漏出量及心肌组织MDA含量，与TMZ抑制脂质过氧化，减轻氧自由基对心肌的损害有关。3.TMZ可通过维持心肌线粒体功能，增加ATP合成，改善缺血后心肌组织的能量代谢；同时它还可以减轻氧自由基对心肌的损害，从整体上促进了心功能的恢复，从根本上改善了UW液和HTK液的心脏保存效果。4.在4℃的条件下，HTK液+TMZ的心脏保存效果明显优于UW液+TMZ的心脏保存效果。
自从1967年人类完成第一例同种心脏移植手术以来，心脏移植在全世界已广泛开展。如何找到更有效的抗心肌缺血的方法，并进而延长离体心脏的保存时限，提高心脏保存液的保存效果日益成为人们研究的目标。近年来越来越多的实验表明心脏经过低温缺血保存后，其功能的恢复在很大程度上与能否维持心肌内高能磷酸盐的水平，使线粒体在较低的氧分压下也能发挥作用，保护细胞膜的稳定并纠正细胞内酸中毒有关。三甲氧苄嗪又称曲美它嗪(trimetazidine，TMZ)，是一种严格意义上的细胞保护剂，在细胞水平发挥抗缺血的作用，而不引起血流动力学的改变或血管的舒缩。本研究的目的是通过改良的Langendorff离体鼠心灌注模型，观察TMZ分别加入UW液、HTK液在4℃保存心脏6小时后，对心功能恢复、心肌组织化学变化及心脏形态结构变化的影响，探讨TMZ的作用机制，进而为临床心脏保存提供理论依据。
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材料和方法
一、实验仪器 ADInstruments生理记录仪，德国Stockert Ⅱ型双头滚压泵，恒温循环器，电子天平，数显电热鼓风干燥箱，高效液相色谱仪，自动生化分析仪，低温离心机，电动高速组织匀浆器FSH-2，721型分光光度计。
二、药品及试剂 UW液，购自美国，用于使心脏停跳和保存心脏。HTK液，购自德国，用于使心脏停跳和保存心脏。TMZ购自法国，分别直接加入UW液和HTK液中，配成浓度为10-6M的溶液备用。K-H缓冲液，自行配制，成分为NaCl 118,KCl 4.7，KH2PO4 1.2，MgSO4·H2O 1.2，NaHCO3 25，CaCl2 2.5，葡萄糖11.1，单位mmol·L-1。MDA试剂盒，由北京邦定公司提供。
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三、实验动物及分组 选用Wistar大白鼠32只，雌雄各半，体重350至450克，由北京通利实验动物养殖场提供。随机分为4组(UW组、UW+TMZ组、HTK组、HTK+TMZ组)，每组8只。
四、主要实验流程
1.改良Langendorff离体鼠心灌注模型的建立。大白鼠称体重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg-1·kg-1)麻醉，经股静脉肝素化3mg-1·kg-1。迅速开胸，切断主动脉，取出心脏，立即放入0～4℃K-H缓冲液中，冲洗掉残留在主动脉内的血液。主动脉插管后，迅速移至Langendorff灌注装置上，用K-H液灌注，灌注压为75cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)，K-H液经40μm孔径的过滤器过滤，整个灌注期间用95%O.2和5%CO2混合气平衡，灌注温度维持在37℃。肺动脉根部切开，使冠状动脉回流液引流充分。灌注1分钟后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将带有测压导管的心室球囊送入左心室，测压导管的另一端连续多导生理记录仪。离体鼠心功能稳定后，向心室球囊内缓慢注射适量生理盐水(40～60μl)，使左室舒张末压为10mmHg(1mmHg=0.133kPa)。平衡15分钟后，心脏搏动达到稳定状态，测定血流动力学基础值(CF、LVEDP、LVESP、LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax)。
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2.离体鼠心的低温保存。降低温度至30℃以下，经主动脉灌注4℃的不同心脏停跳液(UW液、HTK液、UW液+TMZ、HTK液+TMZ)，根据冠脉流量调节灌注速度及剂量，灌注压为75cmHgH2O，把恒温循环器温度降至4℃，分别低温保存6小时。为减小实验误差，心脏在低温保存时不从Langendorff灌注装置上取下。
3.离体鼠心的复灌。6小时后，复温至37℃，重新开始灌注，60分钟后复灌结束。期间每隔15分钟测定一次血流动力学指标，共测定4次。
五、各项检测及观察指标 复灌结束后，滤纸吸净心脏表面水分，称重，分别进行心肌含水量、心肌ATP含量、MDA含量的测定；分别于停搏前及复灌后15分钟，留取冠脉流出液5ml，用自动生化分析仪迅速测定磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、磷酸肌酸激酶同功酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶同功酶(LDH1)的含量；实验结束后迅速取左心室全层心肌，放入10%福尔马林溶液中固定72小时，用于石蜡包埋，HE染色，然后光镜观察心肌组织结构；同时迅速取左心室心内膜下心肌，分割成0.5～1mm3大小的小块，放入3%戊二醛磷酸缓冲液内进行预固定，用于制作电镜标本，透射电镜观察心肌超微结构变化。
, 百拇医药
六、统计学处理 数据用均数±标准差(` x±s)表示，两组间用独立t检验，多组间用单因素方差分析(one way anova)，用SPSS 10.0软件处理， P<0.05认为差别有显著性。
结 果
一、血流动力学恢复率：缺血前心功能基础值在各组间无显著性差异(P>0.05)，复灌后各组心功能恢复率见表1。
二、心肌含水量，ATP含量及丙二醛含量各组间差异显著(见表2)。
表1 心功能基础值及复灌后恢复率(Mean±SD)
缺血前
复灌15分(%)
复灌30分(%)
, 百拇医药
复灌45分(%)
复灌60分(%)
UW组
CF
18±2
47±6
42±7
35±5
31±5
LVESP
119±11
53±8
47±9
, 百拇医药
41±7
32±6
LVEDP
19±2
51±8
43±7
36±7
26±6
LVDP
100±10
51±8
49±9
37±9
, 百拇医药
30±9
+dp/dt max
2601±56
30±6
25±7
20±6
18±4
-dp/dt max
1989±28
33±7
28±9
24±9
22±8
, 百拇医药
UW+TMZ组
CF
17±2
51±8
49±11
43±11
34±8
LVESP
118±9
67±7*
66±9*
55±7*
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43±5*
LVEDP
19±2
67±4*
66±4*
55±4*
40±2*
LVDP
98±9
67±8*
67±11*
, 百拇医药
56±8*
44±7*
+dp/dt max
2582±37
67±6*
68±5*
54±6*
41±4*
-dp/dt max
1972±21
64±9*
, 百拇医药
65±9*
51±7*
41±4*
HTK组
CF
17±1
58±7*
54±6*
46±6*
42±6*
LVESP
, 百拇医药
114±9
69±9*
68±7*
61±10*
58±9*
LVEDP
18±1
70±9*
69±6*
58±9*
50±10*
, 百拇医药
LVDP
96±8
69±9*
68±8*
62±12*
60±10*
+dp/dt max
2601±38
61±6*
63±7*
55±9*
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45±11*
-dp/dt max
1969±23
58±8*
58±8*
48±7*
38±6*
HTK+TMZ组
CF
17±2
69±11△▲▲
, 百拇医药
64±9△▲
57±9△▲
51±7△▲▲
LVESP
113±7
89±15△△▲▲
88±17△△▲▲
78±16△▲▲
66±22▲
LVEDP
, 百拇医药 17±1
85±7△△▲▲
84±11△△▲▲
72±10△▲▲
62±9△▲▲
LVDP
94±8
88±14△△▲▲
86±13△△▲
71±14▲
59±19
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+dp/dt max
2560±32
81±11△△▲▲
81±10△△▲▲
62±4▲▲
50±5▲▲
-dp/dt max
1987±36
81±11△△▲
81±10△△▲
, 百拇医药
62±4
50±5
注：※与UW组相比，*P<0.05。与UW组相比， P<0.01。△与HTK组相比， P<0.05。△△与HTK组相比，P<0.01。▲与UW+TMZ组相比， P<0.05。▲▲与UW+TMZ相比，P<0.01。CF的单位为ml/min；+dp/dt max的单位为mmHg/s;LVEDP，LVESP和LVDP的单位为mmHg。
表2 各组心肌含水量、ATP、丙二醛含量变化(Mean±SD)
组别
心肌含水量(%)
ATP(μmol/g pr)
, 百拇医药
MDA(nmol/mg pr)
UW组
84.93±2.12
0.0200±0.0034
8.75±0.73
UW+TMZ组
80.86±1.37※
0.0286±0.0045*
5.91±0.57*
HTK组
80.43±4.96*
, 百拇医药
0.0304±0.0072
6.41±0.58*
HTK+TMZ组
77.08±2.80
0.0394±0.0084△▲▲
3.97±0.51△△▲▲
四、形态学观察：
含有10-6 M TMZ的两组，心肌水肿较轻，肌纤维排列整齐，线粒体结构完整，无破坏；而无10-6M TMZ的两组，心肌水肿较重，肌纤维排列紊乱，线粒体结构破坏。
, http://www.100md.com 讨 论
在低温缺血条件下保存较长时间的心肌组织恢复血流灌注后，可导致进行性组织损伤，由原来的可逆性损伤变成不可逆性损伤，使心脏作功能力降低，血流动力学恶化。因此，观察心脏保存液对心功能的影响是评价心脏保存液对心脏保存效果的重要内容。
从本研究的结果我们发现：TMZ加入UW液、HTK液后(TMZ-10-6M)，明显增加了心功能各项指标，尤其是LVDP、±dp/dtmax的恢复率，这与Boucher〔1〕的发现相似。我们还发现HTK+TMZ组的心功能恢复率高于TMZ+UW组；各组心功能恢复率以复灌后15分、30分最
高，复灌后45分、60分逐渐降低，可能与复灌后心肌进行性损伤有关。另外，UW+TMZ组及HTK+TMZ组各项心功能指标的恢复率中以冠脉流量的恢复率为最低，而且TMZ加入UW液后虽然增加了冠脉流量的恢复率，但无统计学意义(P>0.05)，TMZ加入HTK液后增加了冠脉流量的恢复率(P<0.05)，但明显低于其它心功能指标恢复率的增加，这说明TMZ(10-6M)明显改善了心功能，但对冠脉流量的作用是有限的，与Freny〔2〕、Sonia〔3〕的观察结果完全一致。
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ATP的合成主要依赖线粒体的功能，线粒体产生ATP及利用ATP的能力高，ATP的水平也高。在生理情况下，心肌主要通过线粒体的氧化磷酸化过程产生能量，来维持细胞正常的功能。能量的供需平衡只有在有氧环境下才能得到维持。心肌缺血时氧供应不足，心肌内氧化产能障碍，而糖酵解产能只能满足部分能量需求，造成心肌内能量缺乏，使一些依赖于能量的重要代谢过程发生紊乱：如心肌收缩与舒张、磷脂膜的稳定、离子的平衡等。缺血后心肌内储存的能量物质(ATP、CP)分解增加，来维持组织的结构、功能、代谢。高能磷酸盐的含量可作为判定心肌缺血程度的重要指标，长时间缺血后心脏机械功能的恢复与心肌组织ATP的含量也密切相关，在缺血心肌细胞内ATP含量如低于1～2μmol/g·pr组织将发生不可逆损伤。因此，改善线粒体功能，增加心肌内高能磷酸盐的储备、降低缺血心肌对高能磷酸盐的消耗对于缺血心肌的恢复是十分重要的。
本研究显示加入TMZ组的鼠心在复灌60分后心肌内ATP的含量明显高于未加入TMZ组的心肌ATP含量，透射电镜观察也显示加入TMZ组的心肌线粒体排列均匀，结构完整，无肿胀，这说明TMZ具有维持线粒体功能，促进ATP合成，改善缺血后心肌组织能量代谢的作用。
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Guarnieri〔4〕通过实验发现：离体心肌线粒体在10-5 M TMZ作用下，线粒体外Ca2+浓度为25～100nM时，尤其是50nM时，增加了Ca2+的摄取和基质钙的浓度，并促进了ATP的合成。线粒体Ca2+的转运主要包括基质Ca2+浓度的调节，而且酮戊二酸脱氢酶对Ca2+的激活敏感，因此TMZ通过激活线粒体Ca2+的转运，抑制Ca2+外流，增加基质Ca2+浓度，可加强酮戊二酸脱氢酶的活性，保护酮戊二酸线粒体呼吸作用，促进线粒体NADH的形成和ATP的合成。
Sonia〔2〕通过离体鼠心实验也发现：在用10-6 M TMZ灌注的鼠心，ATP的周转率明显地降低了，而缺血期间ATP的周转率是反映能量需求的指标，这说明TMZ是通过减少缺血期间能量的消耗，使ATP更好地保留了，产生了一个“节省”能量的效果。另外，Lavanchy〔5〕通过实验证明，在TMZ作用下氧化磷酸化的恢复比对照组更为迅速，TMZ可通过线粒体发挥细胞保护作用，更加有效地利用缺血条件下的残余氧，维持高能磷酸盐的水平。 许多研究结果表明，心肌长时间缺血恢复灌注后，会产生大量氧自由基，破坏组织细胞引起心肌酶漏出、心肌水肿，使心功能减退。本研究观察了TMZ对氧自由基的作用，和无TMZ组相比，TMZ组的心肌含水量及心肌酶漏出量都明显低于无TMZ组，TMZ明显降低了心肌组织中MDA的含量，光镜示TMZ组心肌仅有轻度水肿，细胞无明显破坏，这表明TMZ具有抑制脂质过氧化产物的积聚，减轻氧自由基对心肌损害的作用。
, 百拇医药
其它多项研究也已表明TMZ是氧自由基的清除剂，Guarnieri〔6〕通过实验发现TMZ能够保持线粒体的活性，从而最大限度地发挥作用，减少线粒体氧自由基的产生。Parini〔7〕也证实TMZ明显地减轻了氧自由基对人红细胞两个极为严重的损害：细胞内钾的丢失和脂质过氧化。
另外，氧自由基和钙在心肌缺血损伤中有一定联系。氧自由基破坏生物膜，使膜对钙通透性增加，细胞内钙增多。而细胞内钙是黄嘌呤氧化酶大量产生的条件，钙增多，自由基产生也增多。在生理条件下，TMZ引起平台期电位水平的下降，表明它对Ca2+的通透性有抑制作用，随后Kiyosue证实〔8〕，TMZ能够减少钙电流的最大幅度，以阻断缓慢内流，减少细胞内钙的浓度。由此可以推测TMZ有可能通过减少细胞内Ca2+的积聚起到减轻自由基损伤的作用。
总之，TMZ作为一种细胞保护因子可通过维持心肌线粒体功能，增加ATP合成，改善缺血后心肌组织的能量代谢；同时它还可以减轻氧自由基对心肌的损害，从整体上促进了心功能的恢复，从根本上改善了UW液和HTK液的心脏保存效果。
, 百拇医药
参考文献
1.Boucher FR,Hearse DJ,Opie LH.Effects of trimetazidine on ischemic contracture in isolated perfused rat hearts.J Cardiovasc Pharm,1994,24:45-49.2.Mody FV,Singh BN,Dphil,et al.Trimetazidine-induced enhancement of myocardial glucose utilization in normal and ischemic myocardial tissue:an evaluation by position emission tomography.Am J Cardiol,1998,82:42-49.
3.Sonia A,Chierchia SL,Margonato V,et al.Effects of trimetazidine on metabolic and functional recovery of postischemic rat hearts.Cardiovasc Drugs Ther,1998,12:543-549.
, 百拇医药
4.Guarnieri C,Finelli C,Zini M,et al.Effects of trimetazidine on the calcium transport and oxidative phosphorylation of isolated rat heart mitochondria.Basic Res Cardiol,1997,92:90-95.
5.Lavanchy N,Martin J,Rossi A.Anti-ischemic effects of trimetatazidine:31P-NMR spectroscopy in the isolated rat heart.Arch Int Pharmacodyn,1987,286:97-110.
6.Guarnieri C,Muscari C.Beneficial effects of trimetazidine on mitochondrial function and superoxide production in the cardial muscle.Cardiovasc Drugs Ther,1990,4:814-815.
7.Maridonneau-Parini I,Harpey C.Trimetazidine protects the human red blood cell against oxygen free radical damage.Cardiovasc Drugs Ther,1990,4:818-819.8.Kiyosue T,Nakamura S,Arita M.Effects of trimetazidine on action potentials and membrane currents of guinea-pig ventricular myocytes.J Mol Cell Cardiol,1986,18:1301-1311., http://www.100md.com
关键词：UW液；HTK液；三甲氧苄嗪(TMZ)；心脏保存
摘要：
目的目的：研究UW液和HTK液(两种心脏保存液)在分别加入三甲氧苄嗪(TMZ)后(TMZ-10-6M)对心脏保存效果的影响。
方法：以改良的Langendorff离体鼠心灌注模型，观察UW液、HTK液分别加入TMZ后(TMZ-10-6M)，离体鼠心在4℃保存6小时后血流动力学、冠脉流出液心肌酶漏出量、心肌含水量、心肌ATP、MDA含量、心肌超微结构的变化。
结果：UW液和HTK液加入TMZ组与未加入TMZ组相比，前者复灌后心功能恢复率明显增高(P<0.01)；心肌含水量及丙二醋含量较低(P<0.05)；心肌酶漏出量明显减少(P<0.01)；心肌ATP水平得到很好地维持(P<0.01)；心肌超微结构尤其是线粒体结构改变轻，损伤小；上述各项指标尤以HTK+TMZ组为最佳。
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结论：1.TMZ加入UW液和HTK液后(TMZ-10-6M)可明显改善缺血心肌的功能。2.TMZ可明显减少心肌含水量、心肌酶漏出量及心肌组织MDA含量，与TMZ抑制脂质过氧化，减轻氧自由基对心肌的损害有关。3.TMZ可通过维持心肌线粒体功能，增加ATP合成，改善缺血后心肌组织的能量代谢；同时它还可以减轻氧自由基对心肌的损害，从整体上促进了心功能的恢复，从根本上改善了UW液和HTK液的心脏保存效果。4.在4℃的条件下，HTK液+TMZ的心脏保存效果明显优于UW液+TMZ的心脏保存效果。
自从1967年人类完成第一例同种心脏移植手术以来，心脏移植在全世界已广泛开展。如何找到更有效的抗心肌缺血的方法，并进而延长离体心脏的保存时限，提高心脏保存液的保存效果日益成为人们研究的目标。近年来越来越多的实验表明心脏经过低温缺血保存后，其功能的恢复在很大程度上与能否维持心肌内高能磷酸盐的水平，使线粒体在较低的氧分压下也能发挥作用，保护细胞膜的稳定并纠正细胞内酸中毒有关。三甲氧苄嗪又称曲美它嗪(trimetazidine，TMZ)，是一种严格意义上的细胞保护剂，在细胞水平发挥抗缺血的作用，而不引起血流动力学的改变或血管的舒缩。本研究的目的是通过改良的Langendorff离体鼠心灌注模型，观察TMZ分别加入UW液、HTK液在4℃保存心脏6小时后，对心功能恢复、心肌组织化学变化及心脏形态结构变化的影响，探讨TMZ的作用机制，进而为临床心脏保存提供理论依据。
, http://www.100md.com
材料和方法
一、实验仪器 ADInstruments生理记录仪，德国Stockert Ⅱ型双头滚压泵，恒温循环器，电子天平，数显电热鼓风干燥箱，高效液相色谱仪，自动生化分析仪，低温离心机，电动高速组织匀浆器FSH-2，721型分光光度计。
二、药品及试剂 UW液，购自美国，用于使心脏停跳和保存心脏。HTK液，购自德国，用于使心脏停跳和保存心脏。TMZ购自法国，分别直接加入UW液和HTK液中，配成浓度为10-6M的溶液备用。K-H缓冲液，自行配制，成分为NaCl 118,KCl 4.7，KH2PO4 1.2，MgSO4·H2O 1.2，NaHCO3 25，CaCl2 2.5，葡萄糖11.1，单位mmol·L-1。MDA试剂盒，由北京邦定公司提供。
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三、实验动物及分组 选用Wistar大白鼠32只，雌雄各半，体重350至450克，由北京通利实验动物养殖场提供。随机分为4组(UW组、UW+TMZ组、HTK组、HTK+TMZ组)，每组8只。
四、主要实验流程
1.改良Langendorff离体鼠心灌注模型的建立。大白鼠称体重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg-1·kg-1)麻醉，经股静脉肝素化3mg-1·kg-1。迅速开胸，切断主动脉，取出心脏，立即放入0～4℃K-H缓冲液中，冲洗掉残留在主动脉内的血液。主动脉插管后，迅速移至Langendorff灌注装置上，用K-H液灌注，灌注压为75cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)，K-H液经40μm孔径的过滤器过滤，整个灌注期间用95%O.2和5%CO2混合气平衡，灌注温度维持在37℃。肺动脉根部切开，使冠状动脉回流液引流充分。灌注1分钟后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将带有测压导管的心室球囊送入左心室，测压导管的另一端连续多导生理记录仪。离体鼠心功能稳定后，向心室球囊内缓慢注射适量生理盐水(40～60μl)，使左室舒张末压为10mmHg(1mmHg=0.133kPa)。平衡15分钟后，心脏搏动达到稳定状态，测定血流动力学基础值(CF、LVEDP、LVESP、LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax)。
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2.离体鼠心的低温保存。降低温度至30℃以下，经主动脉灌注4℃的不同心脏停跳液(UW液、HTK液、UW液+TMZ、HTK液+TMZ)，根据冠脉流量调节灌注速度及剂量，灌注压为75cmHgH2O，把恒温循环器温度降至4℃，分别低温保存6小时。为减小实验误差，心脏在低温保存时不从Langendorff灌注装置上取下。
3.离体鼠心的复灌。6小时后，复温至37℃，重新开始灌注，60分钟后复灌结束。期间每隔15分钟测定一次血流动力学指标，共测定4次。
五、各项检测及观察指标 复灌结束后，滤纸吸净心脏表面水分，称重，分别进行心肌含水量、心肌ATP含量、MDA含量的测定；分别于停搏前及复灌后15分钟，留取冠脉流出液5ml，用自动生化分析仪迅速测定磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、磷酸肌酸激酶同功酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶同功酶(LDH1)的含量；实验结束后迅速取左心室全层心肌，放入10%福尔马林溶液中固定72小时，用于石蜡包埋，HE染色，然后光镜观察心肌组织结构；同时迅速取左心室心内膜下心肌，分割成0.5～1mm3大小的小块，放入3%戊二醛磷酸缓冲液内进行预固定，用于制作电镜标本，透射电镜观察心肌超微结构变化。
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六、统计学处理 数据用均数±标准差(` x±s)表示，两组间用独立t检验，多组间用单因素方差分析(one way anova)，用SPSS 10.0软件处理， P<0.05认为差别有显著性。
结 果
一、血流动力学恢复率：缺血前心功能基础值在各组间无显著性差异(P>0.05)，复灌后各组心功能恢复率见表1。
二、心肌含水量，ATP含量及丙二醛含量各组间差异显著(见表2)。
表1 心功能基础值及复灌后恢复率(Mean±SD)
缺血前
复灌15分(%)
复灌30分(%)
, 百拇医药
复灌45分(%)
复灌60分(%)
UW组
CF
18±2
47±6
42±7
35±5
31±5
LVESP
119±11
53±8
47±9
, 百拇医药
41±7
32±6
LVEDP
19±2
51±8
43±7
36±7
26±6
LVDP
100±10
51±8
49±9
37±9
, 百拇医药
30±9
+dp/dt max
2601±56
30±6
25±7
20±6
18±4
-dp/dt max
1989±28
33±7
28±9
24±9
22±8
, 百拇医药
UW+TMZ组
CF
17±2
51±8
49±11
43±11
34±8
LVESP
118±9
67±7*
66±9*
55±7*
, http://www.100md.com
43±5*
LVEDP
19±2
67±4*
66±4*
55±4*
40±2*
LVDP
98±9
67±8*
67±11*
, 百拇医药
56±8*
44±7*
+dp/dt max
2582±37
67±6*
68±5*
54±6*
41±4*
-dp/dt max
1972±21
64±9*
, 百拇医药
65±9*
51±7*
41±4*
HTK组
CF
17±1
58±7*
54±6*
46±6*
42±6*
LVESP
, 百拇医药
114±9
69±9*
68±7*
61±10*
58±9*
LVEDP
18±1
70±9*
69±6*
58±9*
50±10*
, 百拇医药
LVDP
96±8
69±9*
68±8*
62±12*
60±10*
+dp/dt max
2601±38
61±6*
63±7*
55±9*
, http://www.100md.com
45±11*
-dp/dt max
1969±23
58±8*
58±8*
48±7*
38±6*
HTK+TMZ组
CF
17±2
69±11△▲▲
, 百拇医药
64±9△▲
57±9△▲
51±7△▲▲
LVESP
113±7
89±15△△▲▲
88±17△△▲▲
78±16△▲▲
66±22▲
LVEDP
, 百拇医药 17±1
85±7△△▲▲
84±11△△▲▲
72±10△▲▲
62±9△▲▲
LVDP
94±8
88±14△△▲▲
86±13△△▲
71±14▲
59±19
, http://www.100md.com
+dp/dt max
2560±32
81±11△△▲▲
81±10△△▲▲
62±4▲▲
50±5▲▲
-dp/dt max
1987±36
81±11△△▲
81±10△△▲
, 百拇医药
62±4
50±5
注：※与UW组相比，*P<0.05。与UW组相比， P<0.01。△与HTK组相比， P<0.05。△△与HTK组相比，P<0.01。▲与UW+TMZ组相比， P<0.05。▲▲与UW+TMZ相比，P<0.01。CF的单位为ml/min；+dp/dt max的单位为mmHg/s;LVEDP，LVESP和LVDP的单位为mmHg。
表2 各组心肌含水量、ATP、丙二醛含量变化(Mean±SD)
组别
心肌含水量(%)
ATP(μmol/g pr)
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MDA(nmol/mg pr)
UW组
84.93±2.12
0.0200±0.0034
8.75±0.73
UW+TMZ组
80.86±1.37※
0.0286±0.0045*
5.91±0.57*
HTK组
80.43±4.96*
, 百拇医药
0.0304±0.0072
6.41±0.58*
HTK+TMZ组
77.08±2.80
0.0394±0.0084△▲▲
3.97±0.51△△▲▲
四、形态学观察：
含有10-6 M TMZ的两组，心肌水肿较轻，肌纤维排列整齐，线粒体结构完整，无破坏；而无10-6M TMZ的两组，心肌水肿较重，肌纤维排列紊乱，线粒体结构破坏。
, http://www.100md.com 讨 论
在低温缺血条件下保存较长时间的心肌组织恢复血流灌注后，可导致进行性组织损伤，由原来的可逆性损伤变成不可逆性损伤，使心脏作功能力降低，血流动力学恶化。因此，观察心脏保存液对心功能的影响是评价心脏保存液对心脏保存效果的重要内容。
从本研究的结果我们发现：TMZ加入UW液、HTK液后(TMZ-10-6M)，明显增加了心功能各项指标，尤其是LVDP、±dp/dtmax的恢复率，这与Boucher〔1〕的发现相似。我们还发现HTK+TMZ组的心功能恢复率高于TMZ+UW组；各组心功能恢复率以复灌后15分、30分最
高，复灌后45分、60分逐渐降低，可能与复灌后心肌进行性损伤有关。另外，UW+TMZ组及HTK+TMZ组各项心功能指标的恢复率中以冠脉流量的恢复率为最低，而且TMZ加入UW液后虽然增加了冠脉流量的恢复率，但无统计学意义(P>0.05)，TMZ加入HTK液后增加了冠脉流量的恢复率(P<0.05)，但明显低于其它心功能指标恢复率的增加，这说明TMZ(10-6M)明显改善了心功能，但对冠脉流量的作用是有限的，与Freny〔2〕、Sonia〔3〕的观察结果完全一致。
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ATP的合成主要依赖线粒体的功能，线粒体产生ATP及利用ATP的能力高，ATP的水平也高。在生理情况下，心肌主要通过线粒体的氧化磷酸化过程产生能量，来维持细胞正常的功能。能量的供需平衡只有在有氧环境下才能得到维持。心肌缺血时氧供应不足，心肌内氧化产能障碍，而糖酵解产能只能满足部分能量需求，造成心肌内能量缺乏，使一些依赖于能量的重要代谢过程发生紊乱：如心肌收缩与舒张、磷脂膜的稳定、离子的平衡等。缺血后心肌内储存的能量物质(ATP、CP)分解增加，来维持组织的结构、功能、代谢。高能磷酸盐的含量可作为判定心肌缺血程度的重要指标，长时间缺血后心脏机械功能的恢复与心肌组织ATP的含量也密切相关，在缺血心肌细胞内ATP含量如低于1～2μmol/g·pr组织将发生不可逆损伤。因此，改善线粒体功能，增加心肌内高能磷酸盐的储备、降低缺血心肌对高能磷酸盐的消耗对于缺血心肌的恢复是十分重要的。
本研究显示加入TMZ组的鼠心在复灌60分后心肌内ATP的含量明显高于未加入TMZ组的心肌ATP含量，透射电镜观察也显示加入TMZ组的心肌线粒体排列均匀，结构完整，无肿胀，这说明TMZ具有维持线粒体功能，促进ATP合成，改善缺血后心肌组织能量代谢的作用。
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Guarnieri〔4〕通过实验发现：离体心肌线粒体在10-5 M TMZ作用下，线粒体外Ca2+浓度为25～100nM时，尤其是50nM时，增加了Ca2+的摄取和基质钙的浓度，并促进了ATP的合成。线粒体Ca2+的转运主要包括基质Ca2+浓度的调节，而且酮戊二酸脱氢酶对Ca2+的激活敏感，因此TMZ通过激活线粒体Ca2+的转运，抑制Ca2+外流，增加基质Ca2+浓度，可加强酮戊二酸脱氢酶的活性，保护酮戊二酸线粒体呼吸作用，促进线粒体NADH的形成和ATP的合成。
Sonia〔2〕通过离体鼠心实验也发现：在用10-6 M TMZ灌注的鼠心，ATP的周转率明显地降低了，而缺血期间ATP的周转率是反映能量需求的指标，这说明TMZ是通过减少缺血期间能量的消耗，使ATP更好地保留了，产生了一个“节省”能量的效果。另外，Lavanchy〔5〕通过实验证明，在TMZ作用下氧化磷酸化的恢复比对照组更为迅速，TMZ可通过线粒体发挥细胞保护作用，更加有效地利用缺血条件下的残余氧，维持高能磷酸盐的水平。 许多研究结果表明，心肌长时间缺血恢复灌注后，会产生大量氧自由基，破坏组织细胞引起心肌酶漏出、心肌水肿，使心功能减退。本研究观察了TMZ对氧自由基的作用，和无TMZ组相比，TMZ组的心肌含水量及心肌酶漏出量都明显低于无TMZ组，TMZ明显降低了心肌组织中MDA的含量，光镜示TMZ组心肌仅有轻度水肿，细胞无明显破坏，这表明TMZ具有抑制脂质过氧化产物的积聚，减轻氧自由基对心肌损害的作用。
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其它多项研究也已表明TMZ是氧自由基的清除剂，Guarnieri〔6〕通过实验发现TMZ能够保持线粒体的活性，从而最大限度地发挥作用，减少线粒体氧自由基的产生。Parini〔7〕也证实TMZ明显地减轻了氧自由基对人红细胞两个极为严重的损害：细胞内钾的丢失和脂质过氧化。
另外，氧自由基和钙在心肌缺血损伤中有一定联系。氧自由基破坏生物膜，使膜对钙通透性增加，细胞内钙增多。而细胞内钙是黄嘌呤氧化酶大量产生的条件，钙增多，自由基产生也增多。在生理条件下，TMZ引起平台期电位水平的下降，表明它对Ca2+的通透性有抑制作用，随后Kiyosue证实〔8〕，TMZ能够减少钙电流的最大幅度，以阻断缓慢内流，减少细胞内钙的浓度。由此可以推测TMZ有可能通过减少细胞内Ca2+的积聚起到减轻自由基损伤的作用。
总之，TMZ作为一种细胞保护因子可通过维持心肌线粒体功能，增加ATP合成，改善缺血后心肌组织的能量代谢；同时它还可以减轻氧自由基对心肌的损害，从整体上促进了心功能的恢复，从根本上改善了UW液和HTK液的心脏保存效果。
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参考文献
1.Boucher FR,Hearse DJ,Opie LH.Effects of trimetazidine on ischemic contracture in isolated perfused rat hearts.J Cardiovasc Pharm,1994,24:45-49.2.Mody FV,Singh BN,Dphil,et al.Trimetazidine-induced enhancement of myocardial glucose utilization in normal and ischemic myocardial tissue:an evaluation by position emission tomography.Am J Cardiol,1998,82:42-49.
3.Sonia A,Chierchia SL,Margonato V,et al.Effects of trimetazidine on metabolic and functional recovery of postischemic rat hearts.Cardiovasc Drugs Ther,1998,12:543-549.
, 百拇医药
4.Guarnieri C,Finelli C,Zini M,et al.Effects of trimetazidine on the calcium transport and oxidative phosphorylation of isolated rat heart mitochondria.Basic Res Cardiol,1997,92:90-95.
5.Lavanchy N,Martin J,Rossi A.Anti-ischemic effects of trimetatazidine:31P-NMR spectroscopy in the isolated rat heart.Arch Int Pharmacodyn,1987,286:97-110.
6.Guarnieri C,Muscari C.Beneficial effects of trimetazidine on mitochondrial function and superoxide production in the cardial muscle.Cardiovasc Drugs Ther,1990,4:814-815.
7.Maridonneau-Parini I,Harpey C.Trimetazidine protects the human red blood cell against oxygen free radical damage.Cardiovasc Drugs Ther,1990,4:818-819.8.Kiyosue T,Nakamura S,Arita M.Effects of trimetazidine on action potentials and membrane currents of guinea-pig ventricular myocytes.J Mol Cell Cardiol,1986,18:1301-1311., http://www.100md.com