供肺保存和再灌期间的肺表面活性物质变化
http://www.100md.com
体外循环杂志 2000年第4期第2卷
471003 洛阳医专附属医院心脏外科;430022武汉同济医大协和医院心外科 张国报；叶世；杨辰
关键词：供肺保存；肺表面活性物质变化
摘要：
目的目的：探讨供肺保存和再灌期间的肺表面活性物质变化。
方法：实验动物分为对照组(非缺血保存组)和实验组(缺血保存组)，对保存和再灌注期间的肺组织和支气管肺泡灌洗液中的肺表面活性物质磷脂进行了分析。
结果：实验组保存后肺组织总磷脂(TPL)和卵磷脂(PC)含量明显降低，卵磷脂占总磷脂的比例(PC/TPL)降低，卵磷脂与鞘磷脂比(L/S)降低。实验组再灌注后肺组织和支气管肺泡灌洗液中的TPL、PC、PC/TPL、L/S均明显低于对照组。
, http://www.100md.com 结论：肺表面活性物质(SAM)改变是缺血和再灌注肺损伤的敏感指标，热缺血、冷保存和再灌注对SAM磷脂的含量、构成及功能都有损害。
临床肺移植的发展受到供肺来源不足的制约，临床上公认的供肺保存安全缺血时间不超过4～6小时[1]。肺缺血保存和再灌注可导致术后不同程度的肺功能不全，主要表现为肺气体交换功能降低、气道压升高、肺顺应性下降、肺水肿等[2、3]。以上表现与成人呼吸窘迫综合征(ARDS)病人的临床和病理生理有相似之处。已经证实ARDS的发生发展过程中，肺表面活性物质(SAM)组成和功能都发生了改变。在此，我们的实验将探讨供肺保存和再灌注期间SAM的组成、功能是否也发生了改变。
材料和方法
供肺获取和再灌流：健康新西兰白兔12只，雌雄不拘，体重2.5～2.8kg，随机分为对照组和实验组，每组各6只。动物用3%戊巴比妥(30mg/kg)静脉麻醉并肝素化(1400U/kg)，颈部气管切开、插管接呼吸机(潮气量TV 12ml/kg、呼吸频率RR 22/min、呼气末正压PEEP 2cmH2O(1cmH2O=0.098kPa))、吸入氧浓度FiO20.21)，颈动脉插管快速放血75～100ml(另加肝素2100U)备用。同时胸骨正中入路暴露心脏，经右室流出道行肺动脉插管，用置于30cm高度、预冷4℃的低钾右旋糖酐液(LPD)冲洗肺循环，切开左室以保持引流通畅。冲洗期间继续肺通气。冲洗完毕，完整游离出心肺组织，吸气末结扎气管使肺处于膨胀状态。实验组供肺置于含4℃LPD液的塑料袋中，塑料袋再置入含有4℃LPD液的容器中，于4℃环境中保存24小时后进行离体肺循环灌流。对照组肺不经保存用于立即再灌流。
, 百拇医药
标本采取和磷脂分析：对照组在供肺获取后、实验组在供肺保存后分别取右肺组织标本用于肺组织表面活性物质磷脂分析[4]。两组均在灌流结束后取左肺上叶组织用于肺组织表面活性物质磷脂分析，左肺下叶行支气管肺泡灌洗(14ml生理盐水/kg，灌洗时应使肺脏完全膨胀，每次灌洗后收集灌洗液再灌洗，反复共五次，最后收集灌洗液、记录所得灌洗液ml数)。灌洗液低速离心去除细胞碎片，取灌洗液2ml加甲醇2ml，涡混30秒，加入氯仿4ml，涡混30秒，静置后分上、中、下三层，吸出下层置另一试管，浴槽中蒸干，得黄色油滴状物即磷脂。磷脂点样，薄层层析采用10cm×20cm硅胶板(青岛海洋化工厂)直立上行展开，钼酸显色。组织卵磷脂、支气管肺泡灌洗液(BALF)卵磷脂含量、卵磷脂和鞘磷脂比(L/S)等指标采用岛津双波长色谱扫描仪CS930进行薄层扫描定量，波长620nm，双波长直线扫描。总磷脂定量采用三氯醋酸-硫酸亚铁法[5]。支气管肺泡灌洗行泡沫稳定指数(FSI)测定[6]。
结 果
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保存对肺表面活性物质的影响：与对照组未经保存肺相比，实验组经冷缺血保存后肺组织总磷脂(TPL)和卵磷脂(PC)含量明显降低，卵磷脂占总磷脂的比例(PC/TPL)降低，卵磷脂与鞘磷脂比(L/S)降低(见表1)。
表1 保存末两组肺组织中卵磷脂(PC)、总磷
PC(mg/g肺组织)
TPL(mg/g肺组织)
PC/TPL
L/S
对照组
6.40±1.87
7.38±1.89
, 百拇医药 0.86±0.07
6.10±0.19
实验组
1.26±0.43*
3.52±0.68*
0.35±0.09*
3.27±0.44*
注 与对照组相比： *P<0.01
再灌流对肺表面活性物质的影响：对照组再灌注后肺组织中的TPL、PC、PC/TPL较再灌前降低。实验组再灌注后肺组织中的TPL、PC、PC/TPL、L/S下降更明显，与对照组比较有显著性差异(见表2)。实验组再灌后支气管肺泡灌洗液中的TPL、PC、PC/TPL、L/S也明显低于对照组(见表3)。灌流后FSI也低于对照组(实验组0.487±0.026，对照组0.534±0.004，二者比较P<0.01)。
, 百拇医药
表2 两组灌流末肺组织中卵磷脂(PC)、总磷脂(TPL)
PC(mg/g肺组织)
TPL(mg/g肺组织)
PC/TPL
L/S
对照组
0.79±0.10#
2.68±0.14#
0.30±0.03#
5.84±2.34
实验组
, 百拇医药 0.21±0.07**
1.87±0.14**
0.12±0.04**
2.29±0.29**
注: 与同组灌流前相比：#P<0.01，余注解同上。
与对照组相比：*P<0.05 **P<0.01
表3 两组灌流末支气管肺泡灌洗液(BALF)中卵磷脂(PC)、总磷脂(TPL)含量及PC/TPL、FSI变化
PC(mg/g体重)
TPL(mg/g体重)
PC/TPL
, 百拇医药
L/S
对照组
4.85±0.74
5.79±0.75
0.85±0.13
0.534±0.004
实验组
1.92±0.61***
3.93±0.33**
0.48±0.11**
0.487±0.026
注 与对照组相比：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
, 百拇医药
讨 论
肺缺血保存和再灌注损伤是引起肺移植术后肺功能不全的主要原因。再植反应(PRR，pulmonary reimplantation response)是肺缺血再灌注损伤后的常见表现。Sleiman等[3]在临床上观察到24例再植反应，表现为非心源性的肺水肿、低氧血症、胸片上有肺泡或间质阴影，但无细菌感染或排斥征象。Hachida等[2]在犬肺移植实验中发现，术后2～4天出现短暂的肺功能下降，表现为PaO2降低和肺顺应性下降。再植反应与缺血再灌注损伤引起肺血管内皮损害、血管渗透性增高导致水肿有关。Kaplan等[7]发现肺移植后肺血管渗透性增高，保存时间越长，血管渗透性越高。Prop等[8]等发现，延长动作供肺缺血时间，术后肺水肿的发生率增高。
肺表面活性物质(SAM)能降低表面张力，在维持肺泡稳定性，防止肺泡萎陷和防止肺水肿等方面有重要作用。SAM主要是由肺泡Ⅱ型细胞产生的，含80%～90%的磷脂和其它少量的中性脂、蛋白质、糖等。能起降低表面张力、稳定肺泡作用的主要是卵磷脂(即磷脂酰胆碱，PC)，占SAM的60%～70%，是磷脂的主要成分。评价肺表面活性物质(SAM)的方法是对其进行生化分析(磷脂分析)和物理检查(表面张力测定)。磷脂分析包括对总磷脂(TPL)和卵磷脂(PC)的含量、卵磷脂占总磷脂的百分比(PC/TPL)，卵磷脂与鞘磷脂的比(L/S)等的测定。支气管肺泡灌洗液(BALF)的泡沫稳定指数(FSI)与BALF中的磷脂含量之间有较好的相关性，可用于评价BALF中磷脂降低表面张力的能力。我们在实验中发现对照组肺未经保存，仅经过热缺血阶段，但再灌注后肺组织中的TPL、PC、PC/TPL、L/S等均较灌注前降低，可见肺表面活性物质(SAM)改变是缺血和再灌注肺损伤的敏感指标。实验组肺经过热缺血阶段和冷保存阶段后，其肺组织中的TPL、PC、PC/TPL、L/S已明显低于保存前，再灌注后进一步降低，其BALF中上述指标的含量也低于对照组。缺血和再灌注后实验组支气管肺灌洗液中(BALF)的FSI明显低于对照组，这说明BALF中表面活性物质的功能受到影响，即降低表面张力的能力有所下降。这表明无论是热缺血、冷保存和再灌注对SAM磷脂的含量、构成及功能都有损害。甚至Andrade等[9]还发现除了冷存过程外，单纯肺动脉冲洗过程就引起肺表面活性物质的变化，表现为BALF中L/S降低，卵磷脂减少。SAM是由肺泡Ⅱ型细胞合成和分泌的，保存后肺组织中磷脂含量降低，其原因可能是缺血使肺泡Ⅱ型细胞磷脂的合成及再摄取受阻，或磷脂排泌到肺泡中进一步降解，从而导致肺组织内SAM含量减少，进一步影响到BALF中的SAM水平。PC/TPL及L/S的降低，提示在缺血和再灌注中，肺表面活性物质(SAM)的主要成分(如PC)降解更快，或PC转化为其它的非活性脂类(如SM等)。 可见如何保护肺泡Ⅱ型细胞，促使肺泡Ⅱ型细胞合成SAM或补充外源性的SAM用于提高BALF中SAM水平等措施，可能有利于改善肺保存和再灌注后的肺功能，这将对防治肺移植后的肺功能不全有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1.Kirk AJ,Colquhoun IW,Dark JH et al.Lung preservation:a review of current practice and future directions.Ann Thorac Surg,1993,56:990.
2.Hachida M,Morton DL.Lung function after prolonged lung preservation.J Thorac Cardiovasc Surg,1989,97:911.
3.Sleiman C,Mal H,Fournier M,et al.Pulmonary reimplantation response in single-lung transplantation.Eur Respir J,1995,8:5.
, 百拇医药
4.Bligh EG,Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purification.Can J Biochem Physol,1959,37:911.
5.朱忠勇，陈之航.临床医学检验.上海：上海科学技术出版社，1978.403?04.
6.Statland BE,Freer DE.Evaluation of two assays of functional surfactant in amniotic fluid:surface-tension lowering ability and the foam stability index test.Clin Chem,1979,25:1770.
7.Kaplan JD,Trulock EP,Cooper JD,et al. Pulmonary vascular permeability after lung transplantation.A position emission tomographic study.Am Rev Respir Dis,1992,145(4 Pt 1):954.
8.Prop J,Ehrie MG,Crapo JD,et al.Reimplantation response in isografted rat lungs.Analysis of causal factors.J Thorac Cardiovasc Surg,1984,87:702.
9.Andrade RS,Solien EE,Wangensteen OD,et al.Surfactant dysfunction in lung preservation.Transplantation,1995,60:536., 百拇医药
关键词：供肺保存；肺表面活性物质变化
摘要：
目的目的：探讨供肺保存和再灌期间的肺表面活性物质变化。
方法：实验动物分为对照组(非缺血保存组)和实验组(缺血保存组)，对保存和再灌注期间的肺组织和支气管肺泡灌洗液中的肺表面活性物质磷脂进行了分析。
结果：实验组保存后肺组织总磷脂(TPL)和卵磷脂(PC)含量明显降低，卵磷脂占总磷脂的比例(PC/TPL)降低，卵磷脂与鞘磷脂比(L/S)降低。实验组再灌注后肺组织和支气管肺泡灌洗液中的TPL、PC、PC/TPL、L/S均明显低于对照组。
, http://www.100md.com 结论：肺表面活性物质(SAM)改变是缺血和再灌注肺损伤的敏感指标，热缺血、冷保存和再灌注对SAM磷脂的含量、构成及功能都有损害。
临床肺移植的发展受到供肺来源不足的制约，临床上公认的供肺保存安全缺血时间不超过4～6小时[1]。肺缺血保存和再灌注可导致术后不同程度的肺功能不全，主要表现为肺气体交换功能降低、气道压升高、肺顺应性下降、肺水肿等[2、3]。以上表现与成人呼吸窘迫综合征(ARDS)病人的临床和病理生理有相似之处。已经证实ARDS的发生发展过程中，肺表面活性物质(SAM)组成和功能都发生了改变。在此，我们的实验将探讨供肺保存和再灌注期间SAM的组成、功能是否也发生了改变。
材料和方法
供肺获取和再灌流：健康新西兰白兔12只，雌雄不拘，体重2.5～2.8kg，随机分为对照组和实验组，每组各6只。动物用3%戊巴比妥(30mg/kg)静脉麻醉并肝素化(1400U/kg)，颈部气管切开、插管接呼吸机(潮气量TV 12ml/kg、呼吸频率RR 22/min、呼气末正压PEEP 2cmH2O(1cmH2O=0.098kPa))、吸入氧浓度FiO20.21)，颈动脉插管快速放血75～100ml(另加肝素2100U)备用。同时胸骨正中入路暴露心脏，经右室流出道行肺动脉插管，用置于30cm高度、预冷4℃的低钾右旋糖酐液(LPD)冲洗肺循环，切开左室以保持引流通畅。冲洗期间继续肺通气。冲洗完毕，完整游离出心肺组织，吸气末结扎气管使肺处于膨胀状态。实验组供肺置于含4℃LPD液的塑料袋中，塑料袋再置入含有4℃LPD液的容器中，于4℃环境中保存24小时后进行离体肺循环灌流。对照组肺不经保存用于立即再灌流。
, 百拇医药
标本采取和磷脂分析：对照组在供肺获取后、实验组在供肺保存后分别取右肺组织标本用于肺组织表面活性物质磷脂分析[4]。两组均在灌流结束后取左肺上叶组织用于肺组织表面活性物质磷脂分析，左肺下叶行支气管肺泡灌洗(14ml生理盐水/kg，灌洗时应使肺脏完全膨胀，每次灌洗后收集灌洗液再灌洗，反复共五次，最后收集灌洗液、记录所得灌洗液ml数)。灌洗液低速离心去除细胞碎片，取灌洗液2ml加甲醇2ml，涡混30秒，加入氯仿4ml，涡混30秒，静置后分上、中、下三层，吸出下层置另一试管，浴槽中蒸干，得黄色油滴状物即磷脂。磷脂点样，薄层层析采用10cm×20cm硅胶板(青岛海洋化工厂)直立上行展开，钼酸显色。组织卵磷脂、支气管肺泡灌洗液(BALF)卵磷脂含量、卵磷脂和鞘磷脂比(L/S)等指标采用岛津双波长色谱扫描仪CS930进行薄层扫描定量，波长620nm，双波长直线扫描。总磷脂定量采用三氯醋酸-硫酸亚铁法[5]。支气管肺泡灌洗行泡沫稳定指数(FSI)测定[6]。
结 果
, http://www.100md.com
保存对肺表面活性物质的影响：与对照组未经保存肺相比，实验组经冷缺血保存后肺组织总磷脂(TPL)和卵磷脂(PC)含量明显降低，卵磷脂占总磷脂的比例(PC/TPL)降低，卵磷脂与鞘磷脂比(L/S)降低(见表1)。
表1 保存末两组肺组织中卵磷脂(PC)、总磷
PC(mg/g肺组织)
TPL(mg/g肺组织)
PC/TPL
L/S
对照组
6.40±1.87
7.38±1.89
, 百拇医药 0.86±0.07
6.10±0.19
实验组
1.26±0.43*
3.52±0.68*
0.35±0.09*
3.27±0.44*
注 与对照组相比： *P<0.01
再灌流对肺表面活性物质的影响：对照组再灌注后肺组织中的TPL、PC、PC/TPL较再灌前降低。实验组再灌注后肺组织中的TPL、PC、PC/TPL、L/S下降更明显，与对照组比较有显著性差异(见表2)。实验组再灌后支气管肺泡灌洗液中的TPL、PC、PC/TPL、L/S也明显低于对照组(见表3)。灌流后FSI也低于对照组(实验组0.487±0.026，对照组0.534±0.004，二者比较P<0.01)。
, 百拇医药
表2 两组灌流末肺组织中卵磷脂(PC)、总磷脂(TPL)
PC(mg/g肺组织)
TPL(mg/g肺组织)
PC/TPL
L/S
对照组
0.79±0.10#
2.68±0.14#
0.30±0.03#
5.84±2.34
实验组
, 百拇医药 0.21±0.07**
1.87±0.14**
0.12±0.04**
2.29±0.29**
注: 与同组灌流前相比：#P<0.01，余注解同上。
与对照组相比：*P<0.05 **P<0.01
表3 两组灌流末支气管肺泡灌洗液(BALF)中卵磷脂(PC)、总磷脂(TPL)含量及PC/TPL、FSI变化
PC(mg/g体重)
TPL(mg/g体重)
PC/TPL
, 百拇医药
L/S
对照组
4.85±0.74
5.79±0.75
0.85±0.13
0.534±0.004
实验组
1.92±0.61***
3.93±0.33**
0.48±0.11**
0.487±0.026
注 与对照组相比：*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
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讨 论
肺缺血保存和再灌注损伤是引起肺移植术后肺功能不全的主要原因。再植反应(PRR，pulmonary reimplantation response)是肺缺血再灌注损伤后的常见表现。Sleiman等[3]在临床上观察到24例再植反应，表现为非心源性的肺水肿、低氧血症、胸片上有肺泡或间质阴影，但无细菌感染或排斥征象。Hachida等[2]在犬肺移植实验中发现，术后2～4天出现短暂的肺功能下降，表现为PaO2降低和肺顺应性下降。再植反应与缺血再灌注损伤引起肺血管内皮损害、血管渗透性增高导致水肿有关。Kaplan等[7]发现肺移植后肺血管渗透性增高，保存时间越长，血管渗透性越高。Prop等[8]等发现，延长动作供肺缺血时间，术后肺水肿的发生率增高。
肺表面活性物质(SAM)能降低表面张力，在维持肺泡稳定性，防止肺泡萎陷和防止肺水肿等方面有重要作用。SAM主要是由肺泡Ⅱ型细胞产生的，含80%～90%的磷脂和其它少量的中性脂、蛋白质、糖等。能起降低表面张力、稳定肺泡作用的主要是卵磷脂(即磷脂酰胆碱，PC)，占SAM的60%～70%，是磷脂的主要成分。评价肺表面活性物质(SAM)的方法是对其进行生化分析(磷脂分析)和物理检查(表面张力测定)。磷脂分析包括对总磷脂(TPL)和卵磷脂(PC)的含量、卵磷脂占总磷脂的百分比(PC/TPL)，卵磷脂与鞘磷脂的比(L/S)等的测定。支气管肺泡灌洗液(BALF)的泡沫稳定指数(FSI)与BALF中的磷脂含量之间有较好的相关性，可用于评价BALF中磷脂降低表面张力的能力。我们在实验中发现对照组肺未经保存，仅经过热缺血阶段，但再灌注后肺组织中的TPL、PC、PC/TPL、L/S等均较灌注前降低，可见肺表面活性物质(SAM)改变是缺血和再灌注肺损伤的敏感指标。实验组肺经过热缺血阶段和冷保存阶段后，其肺组织中的TPL、PC、PC/TPL、L/S已明显低于保存前，再灌注后进一步降低，其BALF中上述指标的含量也低于对照组。缺血和再灌注后实验组支气管肺灌洗液中(BALF)的FSI明显低于对照组，这说明BALF中表面活性物质的功能受到影响，即降低表面张力的能力有所下降。这表明无论是热缺血、冷保存和再灌注对SAM磷脂的含量、构成及功能都有损害。甚至Andrade等[9]还发现除了冷存过程外，单纯肺动脉冲洗过程就引起肺表面活性物质的变化，表现为BALF中L/S降低，卵磷脂减少。SAM是由肺泡Ⅱ型细胞合成和分泌的，保存后肺组织中磷脂含量降低，其原因可能是缺血使肺泡Ⅱ型细胞磷脂的合成及再摄取受阻，或磷脂排泌到肺泡中进一步降解，从而导致肺组织内SAM含量减少，进一步影响到BALF中的SAM水平。PC/TPL及L/S的降低，提示在缺血和再灌注中，肺表面活性物质(SAM)的主要成分(如PC)降解更快，或PC转化为其它的非活性脂类(如SM等)。 可见如何保护肺泡Ⅱ型细胞，促使肺泡Ⅱ型细胞合成SAM或补充外源性的SAM用于提高BALF中SAM水平等措施，可能有利于改善肺保存和再灌注后的肺功能，这将对防治肺移植后的肺功能不全有重要意义。
, 百拇医药
参考文献
1.Kirk AJ,Colquhoun IW,Dark JH et al.Lung preservation:a review of current practice and future directions.Ann Thorac Surg,1993,56:990.
2.Hachida M,Morton DL.Lung function after prolonged lung preservation.J Thorac Cardiovasc Surg,1989,97:911.
3.Sleiman C,Mal H,Fournier M,et al.Pulmonary reimplantation response in single-lung transplantation.Eur Respir J,1995,8:5.
, 百拇医药
4.Bligh EG,Dyer WJ. A rapid method of total lipid extraction and purification.Can J Biochem Physol,1959,37:911.
5.朱忠勇，陈之航.临床医学检验.上海：上海科学技术出版社，1978.403?04.
6.Statland BE,Freer DE.Evaluation of two assays of functional surfactant in amniotic fluid:surface-tension lowering ability and the foam stability index test.Clin Chem,1979,25:1770.
7.Kaplan JD,Trulock EP,Cooper JD,et al. Pulmonary vascular permeability after lung transplantation.A position emission tomographic study.Am Rev Respir Dis,1992,145(4 Pt 1):954.
8.Prop J,Ehrie MG,Crapo JD,et al.Reimplantation response in isografted rat lungs.Analysis of causal factors.J Thorac Cardiovasc Surg,1984,87:702.
9.Andrade RS,Solien EE,Wangensteen OD,et al.Surfactant dysfunction in lung preservation.Transplantation,1995,60:536., 百拇医药