血栓病患者血浆中腺苷三磷酸双磷酸酶活性的研究
天津市天和医院；天津300050 张晶；黄梅；李俊海；王宏林；于国涛；何菊；张秀军
关键词：
摘要：介入医学、器官移植的兴起和发展在给广大患者带来福音的同时，医源性血管损伤导致血栓形成或血管再狭窄亦随之发生，这也是治疗的远期效果不理想的重要因素之一。如何预防和早期发现血栓形成，已成为临床亟待解决的问题。本研究探讨血栓形成的机制及临床早期诊断的有效指标。
1 资料与方法
1.1 临床资料：实验组75例为发病5日内，未经任何治疗；临床表现及血管超声多普勒确诊为肢体静脉血栓形成60例，肢体动脉栓塞者15例；男40例，女35例；年龄32~71岁，平均56.67岁。正常对照组100例为无高血压、冠心病、糖尿病、脑梗死及肢体血栓形成病史的健康献血员；男58例，女42例；年龄20~59岁，平均41.23岁。
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1.2 样本收集：实验组患者入院后采集血样本；正常对照组在天津市血液中心采集新鲜血样本30例，在本院采集志愿者新鲜血样本70例。取血浆0.5 ml置于2 ml，加入0.5 ml Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，置旋涡混合器上混匀提取，离心取上清液，加入甲醇：乙醚(1∶1)1 ml混匀提取以除去脂溶性物质，再经离心后取出水层，用0.45微孔滤膜过滤后，取20 μl进样。
1.4 检测方法：Kromasil C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，流动相0.005 mol/L庚烷磺酸钠水溶液-甲醇(70∶30)，流速1.0 ml/min，紫外检测波长254 nm，灵敏度0.005(AUFS)，进样量20 μl。
1.4.1 标准曲线的测定：取ADP、AMP的标准品，用流动相分别将其配制成10、50、100、200、500 mg/L 5个不同浓度的溶液，按分析方法进样，分析得到其相应的出峰时间。ADP的保留时间为4.557分钟，AMP的保留时间为7.350分钟。用检测得到的峰面积对浓度进行线性回归分析，得出线性方程：ADP：Y=-606.08+671.2749Xr =0.999 9AMP：Y=-3027.11+902.323 9Xr=0.999 8
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1.4.2 重现性及样品测定：取同一待测样品，分6次各进样20 μl，间隔30~60分钟。统计分析得到6次分析的RSD变异系数为3.05%，说明分析方法稳定可靠，仪器性能稳定。
1.4.3 回收率试验：用标准品为添加参照进行回收试验，按样品制备项下操作，连续检测，得到2个不同浓度样品管中ADP和AMP的峰面积，利用公式〔回收率=(样品测定峰面积-对照测定峰面积)/ 标准品测定峰面积〕
计算回收率，ADP回收率为87%~105%,平均为95%；AMP回收率为87%~102%，平均为94%。试验方法稳定可靠。
2 结果
100例正常人和75例血栓病患者的ADP和AMP测定结果见表1。
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3 讨论
3.1 血栓形成是多种因素综合的结果。血栓形成包括血小板黏附、聚集、以及血液凝固。其中，血小板黏附、聚集是血栓形成的关键，而且是导致血栓形成的最早反应之一〔1〕。体内能够引起血小板聚集的物质起主要作用的是血栓素A2(TXA2)和ADP〔2〕。ADP是重要的血小板激活剂，ADP酶广泛存在于人体各器官组织中。ADP酶在Ca2+、Mg2+存在的情况下活性增高〔3-5〕。ADP酶可水解ATP、ADP，但不水解AMP，因此能通过直接降低血液中ADP浓度及间接升高AMP的浓度起到对抗ADP介导的血小板聚集，从而抑制血小板依赖性血栓的形成〔6,7〕。ADP酶在体内外均有很强的抗血小板聚集的作用，在抑制ADP介导的血小板依赖性血栓形成过程中起着重要的作用〔8,9〕，在保持血液流动性以及机体出血与血栓形成的动态平衡中起着非常重要的调节作用〔10,11〕。国外研究还发现，在血管内皮损伤、再灌注缺血及异种移植物的排斥期，血管壁的ADP酶的活性降低，造成局部ADP水平升高〔3,7,12〕。以上是导致血栓形成的重要因素之一。
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3.2 本研究通过测定正常人及血栓病患者血浆中ADP、AMP浓度，分析结果得出：血栓病患者血浆中ADP浓度明显高于正常人，AMP浓度明显低于正常人。表明血栓病患者血浆中ADP酶的活性减低，同时由于ADP升高必然消耗血浆中内源性ADP酶，使血管壁ADP酶的活性减低，ADP介导的血小板聚集抑制作用减弱，从而导致血栓形成。因此，血浆ADP和AMP浓度的测定可为血栓性疾病的早期诊断及评价治疗效果提供有意义的指标。
3.3 酶活性的测定方法多采用酶标放免法。该方法特异性强，灵敏度高，但操作较麻烦，而且成本较高。本研究中采用的是高效液相色谱法(HPLC)，操作简便、快速，且测定数据准确可靠。能真实地反映正常人及血栓病患者血浆中腺苷酸的变化规律。由于本方法是间接测得酶活性，而ADP的水平受许多因素的影响，例如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)、ADP + Pi / ATP、氧的供应情况、抑制剂的作用等，因此，本方法与应用14C标记ADP薄层层析色谱法直接测定ADP酶的活性比较存在其一定的不足。但是考虑到ADP氧化磷酸化成为ATP的过程为正常人及血栓病患者的生化共有途径，故可忽略不计。因此本方法可作为大样本的筛选指标，结合影像学检查，可进行血栓性疾病的早期诊断。
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参考文献
〔1〕Schror K.抗血小板药物研究进展〔J〕.国外医学药学分册，1996,6：156.
〔2〕王喜山.体内血栓烷与前列环素的酶代谢产物及其临床意义〔J〕.国外医学临床生物化学与检验分册，1996,2：78.
〔3〕Candians D,Koyamada N,Miyatake T,et al.Loss of rat glomerular ATP dipho-sphohydrolase activity during reperfusion jnjury is associated with oxidative stress reactions〔J〕.Trom Haem,1996,76(5):807-812.
〔4〕Christoforidis S,Dopamercaki T,Galaris D,et al.Purification and properties of human placental ATP diphosphohydrolase〔J〕.Eur J Biochem,1995,234:66-74.
, 百拇医药
〔5〕Wang Tingfang,Guidotti G.CD39 is an ecto-(Ca2+,Mg2+)-apyrase〔J〕.J Biolog Chem,1996,271(17):9898-9901.
〔6〕Komoszynsski M,Wojtczak A.Apyrases(ATP-diphosphohydr-olases,EC3.6.1.5)unction and relationship to ATPases〔J〕.BioBiophys Acta,1996，1310：233-241.
〔7〕Koyamada N,Miyatake T,Candinas D,et al.Apyrase administration prolongs discordant xenigraft suevival〔J〕.Transplantantion，1996,62(12)：1739-1743.
, 百拇医药
〔8〕Jagroop I A,Mikhailidi S.New developments in anti-platelet therapies:potential use of CD39/vascular ATP diphosphohydrolase in thrombotic disorders〔J〕.Curr Drug Targets,2001;2(1):107-108.
〔9〕Enjyoji K,Sevigny J,Lin Y,et al.Targeted disruption of cd39/ATP diphosp-hohydrolase results in disordered hemostasis and thromboregulation〔J〕.Nat Med,1999,5(9):1010-1017.
〔10〕Imai M,Kaezmarek E,Kozial K,et al.Suppression of ATP diphosphohydrolase/CD39 in human vascular endothelial celles〔J〕.Biochemistry，1999,38(41):13473-13479.
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〔11〕Zimmermann N.Nucleotides and cd39:principal modulatory player in hemostasis and thrombosis〔J〕.Nat Med,1999,5(9):987-988.
〔12〕Imai M,Takigami K,Guckel B O,et al.CD39/vascular ATP diphosphohydrolase modulates xenograft survival〔J〕.Transplant Proc,2000,32(5):969.
作者简介：张晶(1969-)，女(汉族)，天津市人，主治医师。, 百拇医药
关键词：
摘要：介入医学、器官移植的兴起和发展在给广大患者带来福音的同时，医源性血管损伤导致血栓形成或血管再狭窄亦随之发生，这也是治疗的远期效果不理想的重要因素之一。如何预防和早期发现血栓形成，已成为临床亟待解决的问题。本研究探讨血栓形成的机制及临床早期诊断的有效指标。
1 资料与方法
1.1 临床资料：实验组75例为发病5日内，未经任何治疗；临床表现及血管超声多普勒确诊为肢体静脉血栓形成60例，肢体动脉栓塞者15例；男40例，女35例；年龄32~71岁，平均56.67岁。正常对照组100例为无高血压、冠心病、糖尿病、脑梗死及肢体血栓形成病史的健康献血员；男58例，女42例；年龄20~59岁，平均41.23岁。
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1.2 样本收集：实验组患者入院后采集血样本；正常对照组在天津市血液中心采集新鲜血样本30例，在本院采集志愿者新鲜血样本70例。取血浆0.5 ml置于2 ml，加入0.5 ml Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，置旋涡混合器上混匀提取，离心取上清液，加入甲醇：乙醚(1∶1)1 ml混匀提取以除去脂溶性物质，再经离心后取出水层，用0.45微孔滤膜过滤后，取20 μl进样。
1.4 检测方法：Kromasil C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，流动相0.005 mol/L庚烷磺酸钠水溶液-甲醇(70∶30)，流速1.0 ml/min，紫外检测波长254 nm，灵敏度0.005(AUFS)，进样量20 μl。
1.4.1 标准曲线的测定：取ADP、AMP的标准品，用流动相分别将其配制成10、50、100、200、500 mg/L 5个不同浓度的溶液，按分析方法进样，分析得到其相应的出峰时间。ADP的保留时间为4.557分钟，AMP的保留时间为7.350分钟。用检测得到的峰面积对浓度进行线性回归分析，得出线性方程：ADP：Y=-606.08+671.2749Xr =0.999 9AMP：Y=-3027.11+902.323 9Xr=0.999 8
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1.4.2 重现性及样品测定：取同一待测样品，分6次各进样20 μl，间隔30~60分钟。统计分析得到6次分析的RSD变异系数为3.05%，说明分析方法稳定可靠，仪器性能稳定。
1.4.3 回收率试验：用标准品为添加参照进行回收试验，按样品制备项下操作，连续检测，得到2个不同浓度样品管中ADP和AMP的峰面积，利用公式〔回收率=(样品测定峰面积-对照测定峰面积)/ 标准品测定峰面积〕
计算回收率，ADP回收率为87%~105%,平均为95%；AMP回收率为87%~102%，平均为94%。试验方法稳定可靠。
2 结果
100例正常人和75例血栓病患者的ADP和AMP测定结果见表1。
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3 讨论
3.1 血栓形成是多种因素综合的结果。血栓形成包括血小板黏附、聚集、以及血液凝固。其中，血小板黏附、聚集是血栓形成的关键，而且是导致血栓形成的最早反应之一〔1〕。体内能够引起血小板聚集的物质起主要作用的是血栓素A2(TXA2)和ADP〔2〕。ADP是重要的血小板激活剂，ADP酶广泛存在于人体各器官组织中。ADP酶在Ca2+、Mg2+存在的情况下活性增高〔3-5〕。ADP酶可水解ATP、ADP，但不水解AMP，因此能通过直接降低血液中ADP浓度及间接升高AMP的浓度起到对抗ADP介导的血小板聚集，从而抑制血小板依赖性血栓的形成〔6,7〕。ADP酶在体内外均有很强的抗血小板聚集的作用，在抑制ADP介导的血小板依赖性血栓形成过程中起着重要的作用〔8,9〕，在保持血液流动性以及机体出血与血栓形成的动态平衡中起着非常重要的调节作用〔10,11〕。国外研究还发现，在血管内皮损伤、再灌注缺血及异种移植物的排斥期，血管壁的ADP酶的活性降低，造成局部ADP水平升高〔3,7,12〕。以上是导致血栓形成的重要因素之一。
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3.2 本研究通过测定正常人及血栓病患者血浆中ADP、AMP浓度，分析结果得出：血栓病患者血浆中ADP浓度明显高于正常人，AMP浓度明显低于正常人。表明血栓病患者血浆中ADP酶的活性减低，同时由于ADP升高必然消耗血浆中内源性ADP酶，使血管壁ADP酶的活性减低，ADP介导的血小板聚集抑制作用减弱，从而导致血栓形成。因此，血浆ADP和AMP浓度的测定可为血栓性疾病的早期诊断及评价治疗效果提供有意义的指标。
3.3 酶活性的测定方法多采用酶标放免法。该方法特异性强，灵敏度高，但操作较麻烦，而且成本较高。本研究中采用的是高效液相色谱法(HPLC)，操作简便、快速，且测定数据准确可靠。能真实地反映正常人及血栓病患者血浆中腺苷酸的变化规律。由于本方法是间接测得酶活性，而ADP的水平受许多因素的影响，例如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)、ADP + Pi / ATP、氧的供应情况、抑制剂的作用等，因此，本方法与应用14C标记ADP薄层层析色谱法直接测定ADP酶的活性比较存在其一定的不足。但是考虑到ADP氧化磷酸化成为ATP的过程为正常人及血栓病患者的生化共有途径，故可忽略不计。因此本方法可作为大样本的筛选指标，结合影像学检查，可进行血栓性疾病的早期诊断。
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参考文献
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〔7〕Koyamada N,Miyatake T,Candinas D,et al.Apyrase administration prolongs discordant xenigraft suevival〔J〕.Transplantantion，1996,62(12)：1739-1743.
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作者简介：张晶(1969-)，女(汉族)，天津市人，主治医师。, 百拇医药