中国南方汉族人MTHFR基因多态性与缺血性脑卒中的遗传易感性研究
1.广东省惠州市中心人民医院；广东惠州516002；2.中山医科大学第一附属医院；广东广州510081 李才明1；张成2；邱淑莲1；卢锡林2；曾缨2；吴海新1；陈伟奇1；罗伟良1；刘集鸿1
关键词：N5；N10-亚甲基四氢叶酸还原酶；基因；同型半胱氨酸；脑卒中；缺血性
摘要：目的：研究中国南方汉族人N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与缺血性脑卒中(IS)的关系。方法：运用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测143例IS患者及154例对照组患者MTHFR基因多态性。结果：IS患者中TT型频率为14.0%，CT型频率为45.5%，CC型频率为40.5%，T等位基因频率为36.7%，C等位基因频率63.4%；对照组中TT型频率为5.2%，CT型频率为31.8%，CC型频率为63.0%，T等位基因频率为21.1%，C等位基因频率为78.9%。2组各频率间差异有显著性；普通型和重型组间差异无显著性；TT基因型、T等位基因与IS显著相关。结论：MTHFR基因多态性与IS有一定关系，MTHFR基因可能是IS的易感基因，对人群进行大规模筛选，早期对TT和CT基因型的人群进行维生素干预，对预防IS的发生有一定价值。
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近年来的研究表明，高同型半胱氨酸(HCY)血症是心脑血管疾病的一个新的、独立的危险因子，而且与脑血管病的预后有关〔1，2〕。蛋氨酸代谢中N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是关键酶，MTHFR基因错义突变可引起此酶缺乏或活性降低，引起高同型半胱氨酸血症，其中C677T位碱基突变最为常见，而且TT基因型是缺血性脑卒中(IS)的独立危险因素〔3，4〕。但国内外报道不尽相同〔5-7〕。我们运用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测MTHFR基因C667T位突变，以分析中国南方汉族人MTHFR基因多态性可能作为IS的危险因子及其预报价值。
1 资料与方法
1.1 研究对象：IS患者组:诊断标准参照1995年中华医学会第4届脑血管病会议修订的各类脑血管疾病诊断要点〔8〕。143例患者均经临床、CT或(和)MRI扫描确诊；男73例，女70例；年龄40～90岁，中位年龄为66岁。根据患者病情及CT和(或)MRI结果，将IS患者分为临床IS组(有明显IS临床表现)和腔隙性脑梗死组(无明显IS临床表现，CT或MRI提示有腔隙性病变)；同时按神经功能缺损评分将临床IS患者分为普通型(0~30分)和重型(31~45分)。对照组：年龄、性别匹配的154例同期其它科住院患者，男78例，女76例；年龄39～88岁，中位年龄为64岁。患者均排除高血压病、冠心病、脑血管疾病、糖尿病、癌症、肾功能衰竭等疾病。
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1.2 研究方法：
1.2.1 基因组DNA的提取：取外周静脉血5 ml，用肝素抗凝，低渗法破坏红细胞，分离白细胞，经十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀提取基因组DNA。
1.2.2 MTHFR基因型检测：引物参考文献〔3〕方法设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为P1：5′-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3′；P2：5′-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3′。特异性扩增MTHFR基因含Hinf I多态性位点片段。PCR反应体积30 μl，常规配制，循环周期94 ℃30秒、62 ℃45秒、72 ℃50秒，45循环周期后72 ℃再延伸10分钟，体积分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，扩增片段大小为198 bp。在20 μl反应体系中加缓冲液2 μl，Hinf I 10 U(1 μl)，PCR扩增产物10 μl，用去离子水补足至20 μl，37 ℃消化24小时，质量分数为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳判断酶切结果。
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1.2.3 血生化指标测定：取空腹12小时静脉血,分离血浆储存于-20 ℃冰箱待测。血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)采用酶法；载脂蛋白A(apoA)、apoB采用免疫比浊法；血尿素氮(BUN)采用速率法；血肌酐(Cr)采用比色法。应用日本Olympus AU600型全自动生化分析仪，所有项目测定均带有质控血浆，批内与批间变异系数为5%以下。
1.2.4 统计学处理:采用SAS计算机软件，计量资料组间比较用t检验，计数资料组间比较用χ2检验，基因型及等位基因相对风险率以比数比及95%可信区间表示，显著性水平用χ2检验，用Logistic回归分析确定独立危险因素。
2 结果
2.1 MTHFR基因多态类型：PCR扩增结果及酶切结果见图1和2。PCR扩增出198 bp长的DNA片段，经Hinf I限制性内切酶消化可产生3种基因型：纯合子突变TT型为酶切后175 bp片段；CC型为仅有198 bp片段；CT型既有198 bp片段，又含有175 bp片段，为杂合子突变。
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2.2 群体代表性检验：IS与对照组患者MTHFR基因型分布经χ2检验，P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明患者来自同一群体。
2.3 各组IS患者和对照组MTHFR基因型分布特征见表1。各组IS与对照组相比，TT基因型频率和T等位基因频率差异比较均有统计学意义；而临床IS组和腔隙性脑梗死组患者之间、普通型和重型患者之间各种基因型差异比较均无统计学意义。
2.4 MTHFR基因多态性与IS的关系：Logistic回归分析表明，TT基因型及T等位基因独立于年龄、性别、血压、血糖、血脂、肾功能等因素之外，与IS显著相关(P值分别为0.001 8和0.000 9)。进一步分析亦表明，TT基因型及T等位基因与临床IS和腔隙性脑梗死均显著相关。
3 讨论
HCY血症可能通过多种机制导致动脉粥样硬化，包括造成内皮损伤和功能异常、剌激血管平滑肌细胞增生、破坏机体凝血和纤溶系统，影响脂质代谢等，使机体处于血栓前状态，从而增加了心脑血管疾病发病的危险性〔9〕。引起HCY血症的因素有遗传和环境因素，B族维生素(VitB6、VitB12、叶酸)是HCY代谢中必要的辅助因子，特别是叶酸水平与血浆HCY水平呈负相关〔10〕；在遗传因素中，MTHFR基因和胱硫醚合成酶(CBS)的错义突变是其中重要因素。Morita等〔11〕研究表明，蛋氨酸合成酶(MS)D919G突变并非是血HCY和叶酸水平的决定因素，其突变的等位基因频率与正常人无显著差异。多数研究认为，定位于染色体1P36.3上的MTHFR基因C667T突变与冠心病及脑卒中密切相关〔3-5〕。本研究中以中国南方汉族人为研究对象，对照组MTHFR基因C667T纯合突变TT基因型及T等位基因频率为5.2%和21.1%，结果与朱慧萍〔12〕、周宪梁〔5〕等报告的结果有所不同，表明MTHFR基因C667T位为多态性，也可能存在群体、种族差异，但应注意取样等因素影响，且酶切时PCR产物用量、pH、温度、酶的用量及酶切时间均会影响酶切效果，甚至影响基因型判断，这在研究中应引起注意。
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本研究结果表明，IS患者携带TT、CT基因型和T等位基因频率均明显高于对照组患者，差异均有显著性意义，将结果进行Logistic回归分析，结果表明，TT基因型及T等位基因独立于年龄、性别、血压、血糖、血脂、肾功能等因素之外，与IS相关，表明MTHFR基因可能是IS的易感基因，MTHFR基因C667T错义突变是IS的独立危险因素，这与文献报告的结果基本一致〔3-5〕。进一步分析亦表明，TT基因型及T等位基因与临床IS和腔隙性脑梗死均显著相关，这说明TT基因型及T等位基因对脑血管的中小血管损害均较明显，既可以引起脑内中等动脉梗塞，也可引起小动脉闭塞。我们认为MTHFR基因多态性对IS的影响是由于突变型基因改变了MTHFR的活性，引起HCY的升高，HCY通过各种机制促进动脉粥样硬化血栓形成，增加了IS的危险，然而究竟由于其本身还是由于其相关的代谢物或共同因素导致动脉粥样硬化血栓形成尚不清楚。IS患者携带TT、CT基因型和T等位基因频率普通型和重型组间无明显差异，提示MTHFR基因型与IS病情严重程度无明显相关性。考虑影响血中HCY水平有环境和遗传因素，人群膳食中摄入的叶酸及VitB12量有所不同，对血中HCY水平有明显影响，从而使MTHFR基因错义突变；且环境因素如各种危险因素存在与否、病变部位和发病后治疗情况不同等均对病情产生很大影响。研究表明〔13〕，使用叶酸及VitB12、VitB6可降低几乎所有原因引起的高HCY水平，减少患者动脉粥样硬化危险性。因此，我们认为对人群进行MTHFR基因多态性筛选，并对TT型和CT型人群进行早期的VitB12、叶酸等干预，可以降低血HCY水平，预防IS的发生。
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参考文献
〔1〕Perry J J,Refsum H,Morris R W,et al.Prospective study of serum total homocysteine concentration and risk of stroke in middle-age British men〔J〕.Lancet,1995，346:1395-1398.
〔2〕Bousbey C J,Beresford S A,Omenn G S,et al.A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk for vascular disease〔J〕.JAMA,1995,274:1049-1057.
〔3〕Frosst P,Blam H J,Milos R,et al.A candidate genetic risk for vascular disease common mutation methylenetetrahydrofolate〔J〕.Nat Genet,1995,10:111-113.
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〔4〕Sharma P.Genes for ischemic stroke:strategies for their detection〔J〕.J Hyperten,1996，14:277-285.
〔5〕周宪梁,胡爱华,惠汝太,等.MTHFR基因多态性与血浆同型半胱氨酸水平与脑卒中的关系〔J〕.中华心血管病杂志,1999，27(4):121-123.
〔6〕Lalouschek W,Aull S,Serles W,et al.Genetic and non-genetic factors influencing plasma homocysteine levels in patients with ischemic cerebrovascular disease and in healthy control subjects〔J〕.J Lab Clin Med.1999,133:575-582.
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〔7〕Markus H S,Ali N,Swarminathan R,et al.A common polymorphism in the methylenetrahydrafolate reductase gene,homocysteine,and ischemic cerebrovascular disease〔J〕.Stroke,1997，28:1739-1743.〔8〕王新德.各类脑血管病诊断要点〔J〕.中华神经科杂志，1996,29(6):379-380.
〔9〕陈健,张金枝,程龙献.高同型半胱氨酸血症:心脑血管疾病的独立危险因子〔J〕.心血管病学进展,2000，21(2):75-78.
〔10〕Deloughery T G,Evans A,Sadeghi A,et al.Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductaseorrelation with homocysteine metabolism and late-onset vascular discase〔J〕.Circulation,1996,94(12):3074-3078.
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〔11〕Morita H,Kurihara H,Sugiyama T,et al.Polymorphism of the methionine synthase gene association with homocysteine metabolism and late-onset vascular disease in the Japanese population〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999，19:298-302.
〔12〕朱慧萍,赵如水,刀京晶,等.中国北方少数民族人群同型半胱氨酸代谢酶的遗传多态性〔J〕.中国优生优育,2000，11(2):51-53.
〔13〕杜萱,吴畅.同型(半)胱氨酸与动脉粥样硬化〔J〕.中华心血管杂志,2000，28(3):239-240.
作者简介：李才明(1971-)，男(汉族)，广东省始光县人，主治医师。, http://www.100md.com
关键词：N5；N10-亚甲基四氢叶酸还原酶；基因；同型半胱氨酸；脑卒中；缺血性
摘要：目的：研究中国南方汉族人N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与缺血性脑卒中(IS)的关系。方法：运用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测143例IS患者及154例对照组患者MTHFR基因多态性。结果：IS患者中TT型频率为14.0%，CT型频率为45.5%，CC型频率为40.5%，T等位基因频率为36.7%，C等位基因频率63.4%；对照组中TT型频率为5.2%，CT型频率为31.8%，CC型频率为63.0%，T等位基因频率为21.1%，C等位基因频率为78.9%。2组各频率间差异有显著性；普通型和重型组间差异无显著性；TT基因型、T等位基因与IS显著相关。结论：MTHFR基因多态性与IS有一定关系，MTHFR基因可能是IS的易感基因，对人群进行大规模筛选，早期对TT和CT基因型的人群进行维生素干预，对预防IS的发生有一定价值。
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近年来的研究表明，高同型半胱氨酸(HCY)血症是心脑血管疾病的一个新的、独立的危险因子，而且与脑血管病的预后有关〔1，2〕。蛋氨酸代谢中N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是关键酶，MTHFR基因错义突变可引起此酶缺乏或活性降低，引起高同型半胱氨酸血症，其中C677T位碱基突变最为常见，而且TT基因型是缺血性脑卒中(IS)的独立危险因素〔3，4〕。但国内外报道不尽相同〔5-7〕。我们运用多聚酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测MTHFR基因C667T位突变，以分析中国南方汉族人MTHFR基因多态性可能作为IS的危险因子及其预报价值。
1 资料与方法
1.1 研究对象：IS患者组:诊断标准参照1995年中华医学会第4届脑血管病会议修订的各类脑血管疾病诊断要点〔8〕。143例患者均经临床、CT或(和)MRI扫描确诊；男73例，女70例；年龄40～90岁，中位年龄为66岁。根据患者病情及CT和(或)MRI结果，将IS患者分为临床IS组(有明显IS临床表现)和腔隙性脑梗死组(无明显IS临床表现，CT或MRI提示有腔隙性病变)；同时按神经功能缺损评分将临床IS患者分为普通型(0~30分)和重型(31~45分)。对照组：年龄、性别匹配的154例同期其它科住院患者，男78例，女76例；年龄39～88岁，中位年龄为64岁。患者均排除高血压病、冠心病、脑血管疾病、糖尿病、癌症、肾功能衰竭等疾病。
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1.2 研究方法：
1.2.1 基因组DNA的提取：取外周静脉血5 ml，用肝素抗凝，低渗法破坏红细胞，分离白细胞，经十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提，无水乙醇沉淀提取基因组DNA。
1.2.2 MTHFR基因型检测：引物参考文献〔3〕方法设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为P1：5′-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3′；P2：5′-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3′。特异性扩增MTHFR基因含Hinf I多态性位点片段。PCR反应体积30 μl，常规配制，循环周期94 ℃30秒、62 ℃45秒、72 ℃50秒，45循环周期后72 ℃再延伸10分钟，体积分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物，扩增片段大小为198 bp。在20 μl反应体系中加缓冲液2 μl，Hinf I 10 U(1 μl)，PCR扩增产物10 μl，用去离子水补足至20 μl，37 ℃消化24小时，质量分数为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳判断酶切结果。
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1.2.3 血生化指标测定：取空腹12小时静脉血,分离血浆储存于-20 ℃冰箱待测。血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)采用酶法；载脂蛋白A(apoA)、apoB采用免疫比浊法；血尿素氮(BUN)采用速率法；血肌酐(Cr)采用比色法。应用日本Olympus AU600型全自动生化分析仪，所有项目测定均带有质控血浆，批内与批间变异系数为5%以下。
1.2.4 统计学处理:采用SAS计算机软件，计量资料组间比较用t检验，计数资料组间比较用χ2检验，基因型及等位基因相对风险率以比数比及95%可信区间表示，显著性水平用χ2检验，用Logistic回归分析确定独立危险因素。
2 结果
2.1 MTHFR基因多态类型：PCR扩增结果及酶切结果见图1和2。PCR扩增出198 bp长的DNA片段，经Hinf I限制性内切酶消化可产生3种基因型：纯合子突变TT型为酶切后175 bp片段；CC型为仅有198 bp片段；CT型既有198 bp片段，又含有175 bp片段，为杂合子突变。
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2.2 群体代表性检验：IS与对照组患者MTHFR基因型分布经χ2检验，P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明患者来自同一群体。
2.3 各组IS患者和对照组MTHFR基因型分布特征见表1。各组IS与对照组相比，TT基因型频率和T等位基因频率差异比较均有统计学意义；而临床IS组和腔隙性脑梗死组患者之间、普通型和重型患者之间各种基因型差异比较均无统计学意义。
2.4 MTHFR基因多态性与IS的关系：Logistic回归分析表明，TT基因型及T等位基因独立于年龄、性别、血压、血糖、血脂、肾功能等因素之外，与IS显著相关(P值分别为0.001 8和0.000 9)。进一步分析亦表明，TT基因型及T等位基因与临床IS和腔隙性脑梗死均显著相关。
3 讨论
HCY血症可能通过多种机制导致动脉粥样硬化，包括造成内皮损伤和功能异常、剌激血管平滑肌细胞增生、破坏机体凝血和纤溶系统，影响脂质代谢等，使机体处于血栓前状态，从而增加了心脑血管疾病发病的危险性〔9〕。引起HCY血症的因素有遗传和环境因素，B族维生素(VitB6、VitB12、叶酸)是HCY代谢中必要的辅助因子，特别是叶酸水平与血浆HCY水平呈负相关〔10〕；在遗传因素中，MTHFR基因和胱硫醚合成酶(CBS)的错义突变是其中重要因素。Morita等〔11〕研究表明，蛋氨酸合成酶(MS)D919G突变并非是血HCY和叶酸水平的决定因素，其突变的等位基因频率与正常人无显著差异。多数研究认为，定位于染色体1P36.3上的MTHFR基因C667T突变与冠心病及脑卒中密切相关〔3-5〕。本研究中以中国南方汉族人为研究对象，对照组MTHFR基因C667T纯合突变TT基因型及T等位基因频率为5.2%和21.1%，结果与朱慧萍〔12〕、周宪梁〔5〕等报告的结果有所不同，表明MTHFR基因C667T位为多态性，也可能存在群体、种族差异，但应注意取样等因素影响，且酶切时PCR产物用量、pH、温度、酶的用量及酶切时间均会影响酶切效果，甚至影响基因型判断，这在研究中应引起注意。
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本研究结果表明，IS患者携带TT、CT基因型和T等位基因频率均明显高于对照组患者，差异均有显著性意义，将结果进行Logistic回归分析，结果表明，TT基因型及T等位基因独立于年龄、性别、血压、血糖、血脂、肾功能等因素之外，与IS相关，表明MTHFR基因可能是IS的易感基因，MTHFR基因C667T错义突变是IS的独立危险因素，这与文献报告的结果基本一致〔3-5〕。进一步分析亦表明，TT基因型及T等位基因与临床IS和腔隙性脑梗死均显著相关，这说明TT基因型及T等位基因对脑血管的中小血管损害均较明显，既可以引起脑内中等动脉梗塞，也可引起小动脉闭塞。我们认为MTHFR基因多态性对IS的影响是由于突变型基因改变了MTHFR的活性，引起HCY的升高，HCY通过各种机制促进动脉粥样硬化血栓形成，增加了IS的危险，然而究竟由于其本身还是由于其相关的代谢物或共同因素导致动脉粥样硬化血栓形成尚不清楚。IS患者携带TT、CT基因型和T等位基因频率普通型和重型组间无明显差异，提示MTHFR基因型与IS病情严重程度无明显相关性。考虑影响血中HCY水平有环境和遗传因素，人群膳食中摄入的叶酸及VitB12量有所不同，对血中HCY水平有明显影响，从而使MTHFR基因错义突变；且环境因素如各种危险因素存在与否、病变部位和发病后治疗情况不同等均对病情产生很大影响。研究表明〔13〕，使用叶酸及VitB12、VitB6可降低几乎所有原因引起的高HCY水平，减少患者动脉粥样硬化危险性。因此，我们认为对人群进行MTHFR基因多态性筛选，并对TT型和CT型人群进行早期的VitB12、叶酸等干预，可以降低血HCY水平，预防IS的发生。
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参考文献
〔1〕Perry J J,Refsum H,Morris R W,et al.Prospective study of serum total homocysteine concentration and risk of stroke in middle-age British men〔J〕.Lancet,1995，346:1395-1398.
〔2〕Bousbey C J,Beresford S A,Omenn G S,et al.A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk for vascular disease〔J〕.JAMA,1995,274:1049-1057.
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〔5〕周宪梁,胡爱华,惠汝太,等.MTHFR基因多态性与血浆同型半胱氨酸水平与脑卒中的关系〔J〕.中华心血管病杂志,1999，27(4):121-123.
〔6〕Lalouschek W,Aull S,Serles W,et al.Genetic and non-genetic factors influencing plasma homocysteine levels in patients with ischemic cerebrovascular disease and in healthy control subjects〔J〕.J Lab Clin Med.1999,133:575-582.
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〔7〕Markus H S,Ali N,Swarminathan R,et al.A common polymorphism in the methylenetrahydrafolate reductase gene,homocysteine,and ischemic cerebrovascular disease〔J〕.Stroke,1997，28:1739-1743.〔8〕王新德.各类脑血管病诊断要点〔J〕.中华神经科杂志，1996,29(6):379-380.
〔9〕陈健,张金枝,程龙献.高同型半胱氨酸血症:心脑血管疾病的独立危险因子〔J〕.心血管病学进展,2000，21(2):75-78.
〔10〕Deloughery T G,Evans A,Sadeghi A,et al.Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductaseorrelation with homocysteine metabolism and late-onset vascular discase〔J〕.Circulation,1996,94(12):3074-3078.
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〔11〕Morita H,Kurihara H,Sugiyama T,et al.Polymorphism of the methionine synthase gene association with homocysteine metabolism and late-onset vascular disease in the Japanese population〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999，19:298-302.
〔12〕朱慧萍,赵如水,刀京晶,等.中国北方少数民族人群同型半胱氨酸代谢酶的遗传多态性〔J〕.中国优生优育,2000，11(2):51-53.
〔13〕杜萱,吴畅.同型(半)胱氨酸与动脉粥样硬化〔J〕.中华心血管杂志,2000，28(3):239-240.
作者简介：李才明(1971-)，男(汉族)，广东省始光县人，主治医师。, http://www.100md.com