白细胞介素-10对血管一氧化氮/一氧化氮合酶系统的影响
北京大学第一医院心内科；北京 100034 夏春芳*；霍勇；薛林；朱国英；唐朝枢
关键词：白细胞介素-10；一氧化氮；一氧化氮合酶
摘要：为探讨抗炎因子白细胞介-10 (IL-10)对大鼠主动脉一氧化氮(NO)/一氧化氮合酶(NOS)系统的影响, 应用Griess试剂、 ~3H瓜氨酸生成及蛋白免疫印迹杂交等方法, 测定IL10孵育对血管NO释放、 NOS活性及表达的影响。结果发现细菌脂多糖(LPS)呈浓度依赖性地激活诱导型NOS (iNOS), 促进NO生成。IL10 (10-10～10-8 g/ml)呈浓度依赖性地上调内皮型NOS (eNOS)蛋白表达及其活性, 但对iNOS活性及表达无明显影响。IL10 (10-9～10-8 g/ml)显著抑制10 μg/ml LPS诱导的NO生成和iNOS激活; 而高浓度IL10 (10-7 g/ml)则上调iNOS的活性, 对eNOS蛋白的表达和活性无明显影响。因此IL10对NO/NOS系统具有双重影响, 一方面可抑制炎症介质诱发的作为炎性物质的iNOS的表达及激活, 另一方面可上调内皮源扩血管物质NO的释放。
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一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物体内活跃的多功能细胞信号分子, 具有很强的舒血管作用, 能降低全身平均动脉压, 控制血管床的静息张力, 增强肾血流, 对血管生物学功能的调节具有重要作用[1]。同时NO也是一种炎性因子, 多种炎性介质可引起NO释放[2]。白细胞介素10是体内产生的一种内源性抗炎因子, 除在多种炎性疾病中发挥效应外, 最近还有大量研究报道, 在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)斑块中IL10含量丰富, 外源给予IL10可减少AS斑块的形成[3]。同时动物实验还发现, IL10在血管成形术后再狭窄的发病中具保护作用[4]。但IL10发挥保护作用的具体机制目前尚未充分阐明, 本实验在孵育的大鼠主动脉上观察了IL10对正常的和细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激对血管组织一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活性、 表达以及NO合成的影响。
1材料和方法
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1.1 血管条孵育雄性健康Wistar大鼠(300～350 g), 断头处死。迅速取出主动脉, 除去外膜, 称重。切成1 mm2大小薄片, 分别置于1 ml含5%FBS的1640的培养液中, 按下述分组加入不同试剂后在37℃、 95% O25% CO2条件下振摇孵育6 h。离心, 分取组织和孵育液进行下一步测定。实验分组: (1)对照组: 不作干预处理; (2) LPS组: 培养液中分别含10、 50及100 μg/ml浓度的LPS, 共三个亚组; (3) IL10组: 培养液中分别含10-10、 10-9、 10-8和10-7 g/ml浓度的IL10, 共四个亚组; (4) LPS+IL10组: 除含10 μg/ml LPS外, 还分别加入10-10、 10-9和 10-8 g/ml的IL10, 共三个亚组。
1.2 亚硝酸盐含量测定[5]取离心后的孵育液, 加入等体积Griess试剂(1%磺胺溶于5% H3PO4、 0.1%萘乙二胺盐酸盐溶于双蒸水, 两者按1∶1体积混合)反应15 min, 在分光光度计上测定546 nm处的吸光值。以亚硝酸钠为标准品, 绘制标准曲线。计算样品每克血管组织生成亚硝酸盐的量。
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1.3 NOS活性测定[6]取孵育后的血管组织, 每管加入酶提取液(mmol/L: 50 trisHCl pH 7.4, 0.1 EGTA, 0.5 DTT, 1 PMSF, 2 leupeptin, 0.001 pepstatin) 1 ml, 用Polytron匀浆器制成匀浆。4℃ 3*#000 r/min 离心10 min, 取上清, 测定蛋白含量, 调整蛋白浓度至1 mg/ml。每个蛋白样本取两次, 各为200 μg, 分别加入100 μl含与不含2 mmol/L Ca2+的孵育液(mmol/L: 50 trisHCl pH 7.4, 100 NADPH, 0.03 L精氨酸, 37 kBq/管 ~3HLArg, 10 μg/ml calmodulin), 以分别代表总NOS (tNOS)和诱导型NOS (iNOS)活性, 37℃, 震摇孵育30 min。然后加入50 μl冰冷终止液(mmol/L: 20醋酸钠, 1 L瓜氨酸, 2 EDTA, 0.2 EGTA)终止反应。过Dowex AG 50WX8柱, 加闪烁液后用β液闪仪测定 ~3H放射活性。以每毫克蛋白每分钟生成[~3H]L瓜氨酸的量表示NOS活性, tNOS与iNOS活性之差为内皮型NOS (eNOS)活性。
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1.4 NOS表达按参考文献[6]的方法进行免疫蛋白印迹杂交: 取血管匀浆进行SDSPAGE电泳, 转膜, 封闭过夜, 1∶500稀释的抗iNOS或eNOS兔抗大鼠多克隆抗体4℃下杂交4 h, 1∶4*#000稀释的二抗辣根过氧化酶(HRP)交联物室温反应2 h, 后增强化学发光试剂(enhanced chemiluminesence, ECL)进行显色, 并经计算机灰度扫描处理。
1.5 材料IL10购自STRATHMANN 公司, 抗iNOS多抗及eNOS多抗购自Santa Cruz公司, 二抗购自中山生物公司, ~3HLArg 购自北京原子能研究所, LPS、 pepstatin、 leupeptin、 calmodulin及PMSF为Sigma公司产品, 其余试剂为国产分析纯。
1.6 统计学分析实验数据以mean±SD表示。两组间的差异应用t检验, 多组间比较采用one way ANOVA方差分析和组间q检验作统计学处理。P<0.05为差异具有显著性。
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2结果
2.1 血管NO2的生成
以亚硝酸盐(NO2)含量代表NO生成量。10～100 μg/ml的LPS呈浓度依赖地刺激血管NO2生成(P<0.01)。
低浓度(10-10～10-9 g/ml) IL10对血管NO2生成无明显影响, 而高浓度(10-8和10-7 g/ml) IL10则使NO生成分别增加157%和207%(P<0.05或P<0.01)。
在10 μg/ml浓度LPS刺激NO释放的基础上, 同时给予不同浓度IL10, 低浓度IL10 (10-10～10-9 g/ml)抑制LPS诱导的NO生成(P<0.01), 而高浓度IL10 (10-8 g/ml)作用不明显(P>0.05)。
2.2 血管组织的NOS活性
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10～100 μg/ml的LPS呈浓度依赖地上调tNOS活性(P<0.01), 主要是iNOS活性增加(P<0.05或P<0.01), eNOS活性均略有增加, 但仅100 μg/ml浓度的LPS的作用具有统计学意义(P<0.05)。
10-10～10-7 g/ml 浓度的IL10均显著增加tNOS活性(P<0.05或P<0.01), 低浓度IL10 (10-10～10-8 g/ml)主要上调eNOS活性(P<0.05或P<0.01), 对iNOS活性无影响(P>0.05)。10-7 g/ml浓度的IL10主要刺激iNOS激活(P<0.01), 而对eNOS活性无明显影响(P>0.05)。
在LPS (10 μg/ml)诱导的NOS活性上调的基础上, 不同浓度IL10 (10-10～10-8 g/ml)对tNOS活性均略有抑制, 但无统计学显著意义(P>0.05)。10-9～10-8 g/ml浓度的IL10可下调LPS诱导的iNOS激活(P<0.05), 而10-10 g/ml浓度的IL10对LPS激活的iNOS并无明显影响(P>0.05), 各组eNOS的活性差异无显著性意义(P>0.05) 。
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2.3 NOS表达
LPS (10～100 μg/ml)
对iNOS及 eNOS的表达均无明显影响。IL10 (10-10～10-8 g/ml)可明显刺激eNOS的表达(P<0.05或P<0.01), 而10-7 g/ml浓度IL10的作用不明显。各浓度IL10对iNOS表达均无明显影响。10 μg/ml 浓度的LPS与IL10 (10-10～10-8 g/ml)共同作用下, iNOS及 eNOS表达均无显著改变(P>0.05)
3讨论
白细胞介素10是由多种细胞生成的一种抗炎因子, 在多种炎性疾病, 如在慢性肠病、 感染性休克等中, 通过抑制炎性因子的生成而发挥抗炎作用[7]。最近研究表明IL10在AS斑块中出现丰富表达[8], 并可能通过抑制单核细胞的粘附, 下调炎症免疫反应及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖, 从而缩小高脂饮食导致的AS斑块[3,9], 因此被称作“动脉粥样硬化斑块的免疫刀”[10]。NO在血管主要来源于VSMC、内皮细胞及血管外膜非肾上腺素能非胆碱能神经末梢, 是一种心血管系统的重要生理调节分子。NO在一氧化氮合酶(包括eNOS及iNOS)作用下以L精氨酸为底物合成, eNOS为血管内皮细胞生成, 主要参与血管收缩调节, 而iNOS主要与机体防御功能有关[1]。
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本实验在孵育的大鼠主动脉组织中观察到, 在炎性介质LPS作用下, NO生成增多, 主要由于刺激iNOS激活引起。较低浓度IL10可能通过促进eNOS表达, 进而上调eNOS活性来刺激NO的生成, 而较高浓度的IL10主要通过激活iNOS来促进NO生成。IL10还能抑制LPS刺激的NO的生成, 此作用主要通过抑制LPS刺激的iNOS激活实现。提示IL10既可像其它细胞因子一样通过增强eNOS表达而促进NO生成, 从而起扩张血管作用, 还能通过抑制炎症介质诱导的NO释放发挥抗炎效应。
目前研究表明, IL10在血管成形术后再狭窄及AS过程中出现高表达, 是由于机体在受到损伤后产生了内源性的保护性调节因子, 这在AS与再狭窄的发病中具有重要的病理生理意义, 而IL10对NO/NOS系统的作用可能是其保护机制之一。
参考文献
[1] Li H, Forstermann U. Nitric oxide in the pathogenesis of vascular disease. J Pathol, 2000, 190(3):244～254.
, 百拇医药
[2]Clancy RM, Amin AR, Abramson SB. The role of nitric oxide in inflammation and immunity. Arthritis Rheum, 1998, 41(7):1141～1151.
[3]Pinderski Oslund LJ, Hedrick CC, Olvera T et al. Interleukin10 blocks atherosclerotic events in vitro and in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999, 19(12):2847～2853.
[4]Feldman LJ, Aguirre L, Ziol M et al. Interleukin10 inhibits intimal hyperplasia after angioplasty or stent implantation in hypercholesterolemic rabbits. Circulation, 2000, 101(8):908～916.
, 百拇医药
[5]Tatsumi T, Matoba S, Kawahara A et al. Cytokineinduced nitric oxide production inhibits mitochondrial energy production and impairs contractile function in rat cardiac myocytes. J Am Coll Cardiol, 2000, 35(5):1338～1346.
[6]Khanna A, Rossman JE, Fung HL et al. Attenuated nitric oxide synthase activity and protein expression accompany intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Bioche Biophys Res Commun, 2000, 269(1):160～164.
, http://www.100md.com
[7]Pretolani M, Goldman M. IL10: a potential therapy for allergic inflammation? Immunol Today, 1997, 18(6):277～280.
[8]Mallat Z, Heymes C, Ohan J et al. Expression of interleukin10 in advanced human atherosclerotic plaques:relation to inducible nitric oxide synthase expression and cell death. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999, 19(3):611～616.
[9]Mallat Z, Besnard S, Duriez M et al. Protective role of interleukin10 in atherosclerosis. Circ Res, 1999, 85(8):eI 7～24.
[10]Terkeltaub RA. IL10: An “immunologic scalpel” for athe~ro~sclerosis? Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999, 19(12):2823～2825., 百拇医药
关键词：白细胞介素-10；一氧化氮；一氧化氮合酶
摘要：为探讨抗炎因子白细胞介-10 (IL-10)对大鼠主动脉一氧化氮(NO)/一氧化氮合酶(NOS)系统的影响, 应用Griess试剂、 ~3H瓜氨酸生成及蛋白免疫印迹杂交等方法, 测定IL10孵育对血管NO释放、 NOS活性及表达的影响。结果发现细菌脂多糖(LPS)呈浓度依赖性地激活诱导型NOS (iNOS), 促进NO生成。IL10 (10-10～10-8 g/ml)呈浓度依赖性地上调内皮型NOS (eNOS)蛋白表达及其活性, 但对iNOS活性及表达无明显影响。IL10 (10-9～10-8 g/ml)显著抑制10 μg/ml LPS诱导的NO生成和iNOS激活; 而高浓度IL10 (10-7 g/ml)则上调iNOS的活性, 对eNOS蛋白的表达和活性无明显影响。因此IL10对NO/NOS系统具有双重影响, 一方面可抑制炎症介质诱发的作为炎性物质的iNOS的表达及激活, 另一方面可上调内皮源扩血管物质NO的释放。
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一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物体内活跃的多功能细胞信号分子, 具有很强的舒血管作用, 能降低全身平均动脉压, 控制血管床的静息张力, 增强肾血流, 对血管生物学功能的调节具有重要作用[1]。同时NO也是一种炎性因子, 多种炎性介质可引起NO释放[2]。白细胞介素10是体内产生的一种内源性抗炎因子, 除在多种炎性疾病中发挥效应外, 最近还有大量研究报道, 在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)斑块中IL10含量丰富, 外源给予IL10可减少AS斑块的形成[3]。同时动物实验还发现, IL10在血管成形术后再狭窄的发病中具保护作用[4]。但IL10发挥保护作用的具体机制目前尚未充分阐明, 本实验在孵育的大鼠主动脉上观察了IL10对正常的和细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激对血管组织一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活性、 表达以及NO合成的影响。
1材料和方法
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1.1 血管条孵育雄性健康Wistar大鼠(300～350 g), 断头处死。迅速取出主动脉, 除去外膜, 称重。切成1 mm2大小薄片, 分别置于1 ml含5%FBS的1640的培养液中, 按下述分组加入不同试剂后在37℃、 95% O25% CO2条件下振摇孵育6 h。离心, 分取组织和孵育液进行下一步测定。实验分组: (1)对照组: 不作干预处理; (2) LPS组: 培养液中分别含10、 50及100 μg/ml浓度的LPS, 共三个亚组; (3) IL10组: 培养液中分别含10-10、 10-9、 10-8和10-7 g/ml浓度的IL10, 共四个亚组; (4) LPS+IL10组: 除含10 μg/ml LPS外, 还分别加入10-10、 10-9和 10-8 g/ml的IL10, 共三个亚组。
1.2 亚硝酸盐含量测定[5]取离心后的孵育液, 加入等体积Griess试剂(1%磺胺溶于5% H3PO4、 0.1%萘乙二胺盐酸盐溶于双蒸水, 两者按1∶1体积混合)反应15 min, 在分光光度计上测定546 nm处的吸光值。以亚硝酸钠为标准品, 绘制标准曲线。计算样品每克血管组织生成亚硝酸盐的量。
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1.3 NOS活性测定[6]取孵育后的血管组织, 每管加入酶提取液(mmol/L: 50 trisHCl pH 7.4, 0.1 EGTA, 0.5 DTT, 1 PMSF, 2 leupeptin, 0.001 pepstatin) 1 ml, 用Polytron匀浆器制成匀浆。4℃ 3*#000 r/min 离心10 min, 取上清, 测定蛋白含量, 调整蛋白浓度至1 mg/ml。每个蛋白样本取两次, 各为200 μg, 分别加入100 μl含与不含2 mmol/L Ca2+的孵育液(mmol/L: 50 trisHCl pH 7.4, 100 NADPH, 0.03 L精氨酸, 37 kBq/管 ~3HLArg, 10 μg/ml calmodulin), 以分别代表总NOS (tNOS)和诱导型NOS (iNOS)活性, 37℃, 震摇孵育30 min。然后加入50 μl冰冷终止液(mmol/L: 20醋酸钠, 1 L瓜氨酸, 2 EDTA, 0.2 EGTA)终止反应。过Dowex AG 50WX8柱, 加闪烁液后用β液闪仪测定 ~3H放射活性。以每毫克蛋白每分钟生成[~3H]L瓜氨酸的量表示NOS活性, tNOS与iNOS活性之差为内皮型NOS (eNOS)活性。
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1.4 NOS表达按参考文献[6]的方法进行免疫蛋白印迹杂交: 取血管匀浆进行SDSPAGE电泳, 转膜, 封闭过夜, 1∶500稀释的抗iNOS或eNOS兔抗大鼠多克隆抗体4℃下杂交4 h, 1∶4*#000稀释的二抗辣根过氧化酶(HRP)交联物室温反应2 h, 后增强化学发光试剂(enhanced chemiluminesence, ECL)进行显色, 并经计算机灰度扫描处理。
1.5 材料IL10购自STRATHMANN 公司, 抗iNOS多抗及eNOS多抗购自Santa Cruz公司, 二抗购自中山生物公司, ~3HLArg 购自北京原子能研究所, LPS、 pepstatin、 leupeptin、 calmodulin及PMSF为Sigma公司产品, 其余试剂为国产分析纯。
1.6 统计学分析实验数据以mean±SD表示。两组间的差异应用t检验, 多组间比较采用one way ANOVA方差分析和组间q检验作统计学处理。P<0.05为差异具有显著性。
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2结果
2.1 血管NO2的生成
以亚硝酸盐(NO2)含量代表NO生成量。10～100 μg/ml的LPS呈浓度依赖地刺激血管NO2生成(P<0.01)。
低浓度(10-10～10-9 g/ml) IL10对血管NO2生成无明显影响, 而高浓度(10-8和10-7 g/ml) IL10则使NO生成分别增加157%和207%(P<0.05或P<0.01)。
在10 μg/ml浓度LPS刺激NO释放的基础上, 同时给予不同浓度IL10, 低浓度IL10 (10-10～10-9 g/ml)抑制LPS诱导的NO生成(P<0.01), 而高浓度IL10 (10-8 g/ml)作用不明显(P>0.05)。
2.2 血管组织的NOS活性
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10～100 μg/ml的LPS呈浓度依赖地上调tNOS活性(P<0.01), 主要是iNOS活性增加(P<0.05或P<0.01), eNOS活性均略有增加, 但仅100 μg/ml浓度的LPS的作用具有统计学意义(P<0.05)。
10-10～10-7 g/ml 浓度的IL10均显著增加tNOS活性(P<0.05或P<0.01), 低浓度IL10 (10-10～10-8 g/ml)主要上调eNOS活性(P<0.05或P<0.01), 对iNOS活性无影响(P>0.05)。10-7 g/ml浓度的IL10主要刺激iNOS激活(P<0.01), 而对eNOS活性无明显影响(P>0.05)。
在LPS (10 μg/ml)诱导的NOS活性上调的基础上, 不同浓度IL10 (10-10～10-8 g/ml)对tNOS活性均略有抑制, 但无统计学显著意义(P>0.05)。10-9～10-8 g/ml浓度的IL10可下调LPS诱导的iNOS激活(P<0.05), 而10-10 g/ml浓度的IL10对LPS激活的iNOS并无明显影响(P>0.05), 各组eNOS的活性差异无显著性意义(P>0.05) 。
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2.3 NOS表达
LPS (10～100 μg/ml)
对iNOS及 eNOS的表达均无明显影响。IL10 (10-10～10-8 g/ml)可明显刺激eNOS的表达(P<0.05或P<0.01), 而10-7 g/ml浓度IL10的作用不明显。各浓度IL10对iNOS表达均无明显影响。10 μg/ml 浓度的LPS与IL10 (10-10～10-8 g/ml)共同作用下, iNOS及 eNOS表达均无显著改变(P>0.05)
3讨论
白细胞介素10是由多种细胞生成的一种抗炎因子, 在多种炎性疾病, 如在慢性肠病、 感染性休克等中, 通过抑制炎性因子的生成而发挥抗炎作用[7]。最近研究表明IL10在AS斑块中出现丰富表达[8], 并可能通过抑制单核细胞的粘附, 下调炎症免疫反应及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖, 从而缩小高脂饮食导致的AS斑块[3,9], 因此被称作“动脉粥样硬化斑块的免疫刀”[10]。NO在血管主要来源于VSMC、内皮细胞及血管外膜非肾上腺素能非胆碱能神经末梢, 是一种心血管系统的重要生理调节分子。NO在一氧化氮合酶(包括eNOS及iNOS)作用下以L精氨酸为底物合成, eNOS为血管内皮细胞生成, 主要参与血管收缩调节, 而iNOS主要与机体防御功能有关[1]。
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本实验在孵育的大鼠主动脉组织中观察到, 在炎性介质LPS作用下, NO生成增多, 主要由于刺激iNOS激活引起。较低浓度IL10可能通过促进eNOS表达, 进而上调eNOS活性来刺激NO的生成, 而较高浓度的IL10主要通过激活iNOS来促进NO生成。IL10还能抑制LPS刺激的NO的生成, 此作用主要通过抑制LPS刺激的iNOS激活实现。提示IL10既可像其它细胞因子一样通过增强eNOS表达而促进NO生成, 从而起扩张血管作用, 还能通过抑制炎症介质诱导的NO释放发挥抗炎效应。
目前研究表明, IL10在血管成形术后再狭窄及AS过程中出现高表达, 是由于机体在受到损伤后产生了内源性的保护性调节因子, 这在AS与再狭窄的发病中具有重要的病理生理意义, 而IL10对NO/NOS系统的作用可能是其保护机制之一。
参考文献
[1] Li H, Forstermann U. Nitric oxide in the pathogenesis of vascular disease. J Pathol, 2000, 190(3):244～254.
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[4]Feldman LJ, Aguirre L, Ziol M et al. Interleukin10 inhibits intimal hyperplasia after angioplasty or stent implantation in hypercholesterolemic rabbits. Circulation, 2000, 101(8):908～916.
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[5]Tatsumi T, Matoba S, Kawahara A et al. Cytokineinduced nitric oxide production inhibits mitochondrial energy production and impairs contractile function in rat cardiac myocytes. J Am Coll Cardiol, 2000, 35(5):1338～1346.
[6]Khanna A, Rossman JE, Fung HL et al. Attenuated nitric oxide synthase activity and protein expression accompany intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Bioche Biophys Res Commun, 2000, 269(1):160～164.
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[7]Pretolani M, Goldman M. IL10: a potential therapy for allergic inflammation? Immunol Today, 1997, 18(6):277～280.
[8]Mallat Z, Heymes C, Ohan J et al. Expression of interleukin10 in advanced human atherosclerotic plaques:relation to inducible nitric oxide synthase expression and cell death. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999, 19(3):611～616.
[9]Mallat Z, Besnard S, Duriez M et al. Protective role of interleukin10 in atherosclerosis. Circ Res, 1999, 85(8):eI 7～24.
[10]Terkeltaub RA. IL10: An “immunologic scalpel” for athe~ro~sclerosis? Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999, 19(12):2823～2825., 百拇医药