一氧化氮在17-β雌二醇抑制血管平滑肌细胞增殖和原癌基因c -fos表达中的作用
中山医科大学生理学教研室；广州 510080 杨丹；谈智；刘培庆；潘敬运；王庭槐*
关键词：血管平滑肌细胞；雌激素；一氧化氮；一氧化氮合酶；c -fos
摘要：实验利用大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)作为模型，观察17-β雌二醇(E2)对VSMC增殖和原癌基因c -fos表达的影响，并探讨VSMC源性一氧化氮(NO)在其中的作用。检测指标包括NO释放的测定、细胞计数、 3H-Tdr掺入、 噻唑蓝(MTT)测定和c -fos mRNA表达。结果显示，E2(10-12~10-8 mol/L)呈浓度依赖性地促进VSMC中NO的释放；10-8 mol/L E2 能明显抑制10%小牛血清(FCS)和10-7 mol/L 内皮素-1(ET-1)诱导的细胞增殖和DNA合成，E2的抑制作用均可被雌激素受体 (ER) 拮抗剂tamoxifen (10-7 mol/L)和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(10-6 mol/L)明显减轻；E2(10-8 mol/L)可明显抑制10-7 mol/L ET-1诱导的VSMC c -fos表达，这种抑制作用可被L-NAME (10-6 mol/L) 明显减轻。这些结果提示E2能抑制VSMC增殖和原癌基因c -fos表达，这和促进VSMC的NO释放密切相关，而且该作用至少部分通过ER介导。
有大量证据表明绝经前妇女的心血管病发病率远远低于同龄男性， 而绝经后这种差别则不复存在，这提示雌激素对心血管系统具有保护作用。在动脉粥样硬化(AS)的发病过程中， 内皮功能下降和血管平滑肌的增殖是两大重要因素。近年来,较多的研究集中在雌激素的内皮保护方面，包括促进血管内皮依赖性舒张，促进血管内皮细胞释放一氧化氮(NO)和内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 的表达[1]。 但也有研究发1期杨丹等: NO在17-β雌二醇抑制血管平滑肌细胞增殖和原癌基因c -fos表达中的作用现雌激素对血管平滑肌(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖有直接抑制作用[2]。 而这种作用不依赖于内皮释放NO, 如17-β雌二醇(E2)能诱导去内皮的动脉条iNOS的表达和NO的产生来减弱去内皮的大鼠动脉的收缩反应[3], 这提示雌激素对血管张力的调节与VSMC自身NO系统有关。 因此, 有必要确定雌激素对VSMC的直接抑制作用是否也与VSMC自身释放的NO有关。为此, 本研究观察了E2对大鼠VSMC增殖和原癌基因c -fos表达及NO释放的影响, 并探讨了NO、 NOS和ER在其中的作用, 以进一步阐明雌激素抗动脉粥样硬化的机制。
1材料和方法
1.1 VSMC的培养[4]取150～200 g雌性SD大鼠(中山医科大学动物中心提供)的胸主动脉。 用贴块法培养VSMC, 实验采用第4代培养细胞。培养液为含10%小牛血清的无酚红DMEM, 给药前24 h换用无血清而加入转铁蛋白等补充营养的无酚红DMEM。
1.2 NO释放的测定[1] 用Nitrit/Nitrat Farbtest 试剂盒, 以比色法测定培养液和细胞内的硝酸盐总量。以每培养瓶106个细胞的密度接种细胞, 分别收集细胞培养液和细胞裂解液(80℃恒温水浴裂解10 min, 12000 r/min离心10 min, 取上清液)进行测定。500 μl样品中加入250 μl NADPH和200 μl硝酸还原酶, 室温下孵育30 min, 加入对氨基苯磺酰胺和萘乙二胺显色15 min, 以紫外分光光度计546 nm波长测定吸光度, 再根据标准曲线换算成硝酸盐浓度。细胞培养液和细胞裂解液中硝酸盐浓度之和即为VSMC释放出的硝酸盐总量。
1.3 细胞计数VSMC以105/孔接种于24孔板, 贴壁后换无血清DMEM培养液, 24 h后加药处理3 d, 用胰酶短暂消化后制备成细胞悬液, 在倒置光学显微镜下计数。
1.4 DNA合成测定制备2×105 cells/ml悬液接种于24孔板, 贴壁后换无血清DMEM, 24 h后加药, 孵育16 h后每孔加入37 kBq 3H-Thymidine(3H-Tdr), 8 h后加入冷PBS液终止反应。 在Millipore上经微孔滤膜收集细胞并用10%三氯醋酸处理、洗净, 滤膜干燥后加入闪烁液, 在β闪烁计数仪上测定3H放射活性。
1.5 MTT测定制备2×105 cells/ml悬液接种于96孔板, 贴壁后换无血清DMEM, 24 h后加药, 孵育24 h后每孔加入100 μg MTT。 继续培养5 h后去除培养液, 每孔加入0.2 ml DMSO, 振摇10 min后用酶联免疫检测仪测定光密度值(OD值, 检测波长570 nm, 参考波长630 nm), 通过与对照值的比较得到实验组的存活值。
1.6 c -fos mRNA的表达检测 用TRIzol试剂盒提取细胞RNA, 提取后用紫外分光光度计测定其浓度和纯度, 计算样品总RNA浓度。根据Yang等[5]报道的序列合成VSMC的c -fos寡核苷酸引物, 其序列为：上游5′-GGT CAT CGG GGA TCT TGc -3′, 下游5′-GGG CTC TCC TGT CAA c -3′。利用该对引物可扩增出510 bp的c -fos cDNA片段, 内标GAPDH的寡核苷酸引物是根据Fort等[6]报道的序列合成：上游5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3′, 下游 5′-TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG-3′, 利用该对引物可扩增出443 bp的GADPH cDNA片段。取样品总RNA 2 μg, 加入0.4 (mol/L 特异性c -fos mRNA引物.采用TitanTM一步法RT-PCR试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应(RT-RCR), 扩增条件参考试剂盒说明书(94℃变性2 min×1次→94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 68℃延伸45 s×10次→94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 68℃延伸45 s, 每次循环延伸时间延长5 s×25次→68℃延伸7 min), 总反应体积为50 μl。取RT-PCR产物8 μl, 加2 μl上样缓冲液, 在含0.5 μg/ml溴化乙淀的1.5 %琼脂糖凝胶进行电泳, 电泳条件为68 V、 45 min。以GDS凝胶成像系统拍摄电泳图谱, 并进行相应分析。
1.7 试剂 Nitrit/Nitrat, Farbtest试剂和TitanTM one Tube RT-PCR Kit均由Boehringer Mannheim公司提供。TRIzol试剂, DMEM, fetal bovine serum (FCS)为Gibco公司产品。17-β雌二醇(17-β estraoliol, E2), tamoxifen, 内皮素-1(endotheline 1, ET-1), NG-硝基左旋精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methylester, L-NAME), 噻唑蓝(3-[4,5-DimethylthiazoL-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT), 琼脂糖(agrose)均为Sigma产品。c -fos引物序列和GAPDH引物序列在上海生工生物工程公司合成。
1.8 实验分组 (1) 空白对照组; (2) serum处理组; (3) E2+serum组; (4)tamoxifen+E2+serum组; (5)L-NAME+E2+serum组; (6)ET-1处理组; (7)E2+ET-1组; (8)tamoxifen+E2+ET-1组; (9)L-NAME+E2+ET-1组; (10)E2组; (11)tamoxifen组; (12)L-NAME组。
1.9 统计处理结果以mean±SD表示, 以方差分析, 组间t检验作统计学处理, P<0.05被认为有统计学差异。
2结果
2.1 E2对VSMC NO释放的影响
NO释放量用培养液和细胞内硝酸盐总量之和表示。与对照组比较, 以10-12 mol/L、10-10 mol/L 及10-8 mol/L的 E2处理VSMC 48 h, 使培养液和细胞内硝酸盐总量从80.4 ±5.8分别增加到103.0 ± 4.9(P< 0.001), 108.9 ± 2.5(P< 0.001), 112.9± 2.4(P<0.001), 分别增加了(28.3±7.6)%, (35.9±7.8)% 和(41.1±9) %(n= 6, P < 0.001)。
2.2 E2对VSMC细胞计数的影响
以空白对照为100%, 10%FCS作用3 d使细胞计数增加了(119.4±13.3)%(n＝4, P<0.001), 该作用被10-8 mol/L E2预处理24 h后明显抑制, 抑制率为(45.8±2)%(n＝4, P<0.001)。预先给予10-6 mol/L L-NAME和10-7 mol/L tamoxifen 半小时, 使E2的抑制10%FCS诱导细胞增殖的作用分别减轻了(87±15.4)%(n＝4, P<0.001)和(76.1±6)%(n＝4, P<0.001); 10-7 mol/L ET-1作用3 d使细胞计数增加了(100.9±20.9)%(n＝4, P<0.001), 该作用被10-8 mol/L E2预处理24 h后明显抑制, 抑制率为(44.3±2.5)%(n＝4, P<0.001), 预先给予10-6 mol/L L-NAME和10-7 mol/L tamoxifen 半小时使E2的抑制10-7 mol/L ET-1诱导细胞增殖的作用分别减轻了(83.1±8.8)%(n＝4, P<0.01)和(83.5±1.3)%(n＝4, P<0.001)。
2.3 E2对VSMC 3H-Tdr掺入率的影响
与空白对照组相比, 10% FCS和10-7 mol/L ET-1分别使VSMC 3H-Tdr掺入的cpm值从631.2±145.5增至3589.3±807(n＝6, P<0.001)和1553.3±481.9(n＝6, P<0.01)。E2预处理24 h后对FCS和ET-1诱导的VSMC 3H-Tdr掺入均有抑制作用, 且抑制作用随浓度增加而增大, 10-12 mol/L、10-10 mol/L 及10-8 mol/L的 E2对10%FCS的这种作用分别抑制了(6.8±3.2)%(n=6, P<0.01), (15.8±4)%(n=6, P<0.001), (36.3±10.4)%(n=6, P<0.001)。10-8 mol/L E2对ET-1的这种作用抑制了(49±8.1)%(n=6, P<0.001), 用10-6 mol/L L-NAME预处理半小时后, 10-8 mol/L E2对FCS诱导VSMC 3H-Tdr掺入的抑制作用完全消失(n＝6, P<0.01)。对ET-1诱导VSMC 3H-Tdr掺入的抑制率从(49±8.1)%下降到(17.7±7)%(n=6, P<0.01)。用10-7 mol/L tamoxifen预处理半小时后, 完全消除了10-8 mol/L E2对FCS的抑制作用(n=6, P< 0.001), 部分减轻了10-8 mol/L E2对ET-1的抑制作用, 抑制率从(49±8.1)%下降到(12.7±5.1)%(n=6, P<0.01)。
2.4 E2对VSMC MTT测定的影响
与空白对照组相比, 10%FCS使vs MC MTT的OD值从0.12±0.04增至1.38±0.14(n=6, P< 0.001), 10-8 mol/L E2预处理24 h使之下降到1.18±0.08, 有明显抑制作用(n=6, P< 0.05 vs FCS)。预先给予10-7 mol/L tamoxifen和10-6 mol/L L-NAME 半小时, 可明显消除E2的抑制作用, MTT的OD值分别为1.28±0.13(n＝6, P< 0.05 vs E2+FCS)和1.31±0.11(n=6, P< 0.05 vs E2+FCS); 与对照组相比, 10-7 mol/L ET-1使VSMC MTT的OD值从0.12±0.04增至1.24±0.06(n＝6, P< 0.001), 10-8 mol/L E2预处理24 h, 使之降到1.11±0.05, 有明显抑制作用(n＝6, P< 0.05 vs ET-1)。预先给予10-7 mol/L tamoxifen和10-6 mol/L L-NAME半小时, 可明显消除E2的抑制作用, MTT的OD值分别为1.17±0.07(n＝6, P< 0.05 vs E2+ET-1)和1.16±0.07(n＝6, P< 0.05 vs E2+ET-1)。
2.5 E2对VSMC 的c -fos表达的影响
与空白对照组比较, 用10-7 mol/L ET-1处理VSMC 30 min后, 从RT-PCR结果上可见位于510 bp处的c -fos表达明显增加; 用10-8 mol/L E2预处理24 h后, ET-1诱导的c -fos表达受到明显抑制, 10-6 mol/L L-NAME预孵半小时可明显逆转E2的抑制作用。
3讨论
VSMC增殖是动脉粥样硬化(AS)的一个重要病理生理机制。大量研究表明, 在AS动脉中膜明显增厚, 而雌激素能有效延缓AS的发展[7]。本实验从细胞计数、3H-Tdr掺入和MTT法检测活细胞数三方面显示, 生理浓度(10-12～10-8 mol/L)的E2能明显抑制血清或ET-1诱导的VSMC增殖和DNA合成, 说明E2有较明显的抗VSMC增殖作用。核内早期生长因子c -fos基因的激活是VSMC增殖的一个始动因素, 为进一步阐明E2抑制VSMC增殖的作用与原癌基因的关系, 本实验检测了c -fos的基因表达, 发现E2能明显抑制 ET-1诱导的c -fos基因表达, 说明E2对VSMC增殖的抑制作用与原癌基因c -fos的表达下降有关。本实验所用E2浓度是模拟体内生理条件下或雌激素替代疗法时的浓度(10-9～10-8 mol/L), 可解释生理浓度离体条件下雌激素的心血管保护作用。
实验进一步研究了NO在雌激素抑制VSMC增殖和c -fos基因表达中的作用。NO在体内由L-精氨酸和分子氧在NOS的催化下产生, 在心血管系统的作用主要有调节血管张力、抑制白细胞与内皮细胞的粘附、 抑制VSMC增殖和血小板聚集等。已有研究证实雌激素能增加EC eNOS活性和表达及NO释放, 并认为这是雌激素抗AS的重要机制, 我们也曾报道雌激素诱导BAEC NO释放和e-NOS表达[8], 但雌激素是否诱导VSMC释放NO以及VSMC释放的NO是否与雌激素的抗VSMC增殖作用有关, 尚未见报道。我们发现, E2呈浓度依赖地增加VSMC的NO释放, 而且NOS抑制剂L-NAME能明显减轻10-8 mol/L E2对血清或ET-1诱导的VSMC增殖, DNA合成和c -fos基因表达的抑制作用, 表明雌激素诱导VSMC的NO释放是其抑制VSMC增殖和原癌基因c -fos表达的重要机制。VSMC中的NOS主要为诱导型NOS(iNOS)[9], iNOS的活化主要与感染和炎症有关。有报道, VSMC的iNOS表达和平滑肌源性的NO参与AS斑块的形成[10], Valeria Zancan等也发现, E2降低VSMC中细胞因子诱导的iNOS活性, 认为雌激素的血管保护作用与平滑肌源性的NO呈负相关[11]。与此相反, Binko[3]和Kauser[12]的研究则发现, E2通过激活iNOS减弱去内皮动脉血管的收缩作用, 提示雌激素的血管保护作用与平滑肌源性的NO呈正相关。本实验结果亦支持这一观点, 这种相互矛盾的结果可能与实验条件的不同有关。目前越来越多的研究也证明了平滑肌源性的NO可能具有血管保护作用。 有文献报道, ET-1和ox-LDL这两种重要的促AS因子均能抑制iNOS表达和VSMC的NO释放[13, 14], 而且VSMC中iNOS介导的NO释放能抑制LDL的氧化修饰[15]。更直接的证据是， Kibbe MR等把iNOS基因转染入VSMC中能明显抑制VSMC增殖[16]。我们发现, E2促进VSMC的NO合成与释放和E2抑制VSMC增殖和原癌基因c -fos表达密切相关, 但究竟是通过何种NOS介导尚不明确, 本实验室准备直接检测iNOS的活性和表达, 以进一步明确iNOS的作用。
我们还研究了雌激素受体(ER)在E2抑制VSMC增殖中的作用, 结果表明, ER拮抗剂tamoxifen(10-7 mol/L)能明显减轻10-8 mol/L E2对血清或ET-1诱导的VSMC增殖, DNA合成的抑制作用, 提示E2的作用至少部分是通过ER介导的。早已有研究发现, VSMC有ER的表达。传统ER为核受体, 分为α、 β两个亚型, VSMC中主要的ER为β受体[17], 而α受体则主要存在于乳腺和子宫中, 两者与E2的亲和力相同, 但其结构在两个重要的功能域有所不同。 目前认为可能主要是β受体介导了E2对VSMC增殖的抑制作用, 也有研究发现ER也存在于胞浆和胞膜上, 介导E2对细胞内钙和NO释放的影响。本文所用ER拮抗剂tamoxifen主要作用于核受体, 但对α和β亚型无特异性, 因此, 我们尚无法推论何种受体亚型介导了E2的抗增殖作用, 这有待今后进一步研究。
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