一氧化氮在大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤中的作用
华北煤炭医学院病理生理教研室；唐山 063000 杨秀红；张连元*；孙树勋；董淑云；门秀丽；景有伶；张一兵
关键词：一氧化氮；缺血；再灌注；成人呼吸窘迫综合症
摘要：在大鼠肢体缺血再灌注(LIR)损伤模型上, 观察应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂氨基胍(AG)及一氧化氮(NO)合成前体物质L-精氨酸(L-Arg)对大鼠骨骼肌和肺组织的NOS活性、 NO含量、 丙二醛(MDA)、 髓过氧化物酶(MPO)和湿/干重(W/D)值的影响以及肺磷脂酰胆碱(PC)的改变, 并观察了肺组织在光镜下形态学的变化。结果显示, 与对照组比较, LIR组骨骼肌和肺组织NOS活性均增强, MDA值、 MPO活性增加, W/D值增大, 肺PC含量降低; 光镜下, 肺间质多形核粒细胞(PMN)聚集和浸润, 肺间隔面密度值增加。给予AG后, 与LIR组相比NOS活性降低, NO产生下降, 而MPO活性、 W/D比值增加, 肺PC含量进一步降低; 镜下PMN聚集和浸润增加, 肺间隔面密度值增大。而给予 L-Arg 后能减轻LIR引起的上述变化。上述结果提示, LIR后2 h时, 骨骼肌和肺组织NOS活性增加, NO产生增多; 内源性NO可能在LIR所诱发的早期急性肺损伤中起保护作用。
大量实验已证实, 肢体经过一段时间的缺血再灌注后可引起急性肺损伤(acute lung injury, ALI); 并有人用同位素标记等方法[1,2]研究表明, ALI时肺组织NOS活性明显增高并催化合成大量的NO。NO是一种强烈的扩血管物质, 具有舒张血管平滑肌、 抑制血小板和白细胞的活化和聚集等重要作用。NO和NOS在肢体缺血再灌注(LIR)后的ALI中起着极其重要的作用, 但目前关于NO在LIR后ALI中作用尚存争议。我们在LIR模型上, 采用氨基胍(AG)和 L-Arg 两种药物处理, 观察缺血4 h再灌注2 h后骨骼肌和肺组织丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、 湿/干重(W/D)、 NOS活性、 NO含量、 肺磷脂酰胆碱(PC)的改变以及形态学上的变化, 旨在探讨NO在LIR继发ALI中的作用。
1材料和方法
1.1 模型复制 按Rosenthal法[3]复制大鼠LIR模型, 用200~250 g雄性Wistar大鼠(购自北京实验动物养殖厂), 术前禁食12 h, 自由饮水。 乙醚浅麻醉下以橡皮带环绕结扎大鼠双后肢根部, 阻断血流4 h松解, 恢复血流后观察2 h。缺血期间, 用激光多普勒血流仪(LDF-3型， 南开大学)监测肢体血流情况。于松带前20 min向腹腔注入1%戍巴比妥钠溶液(0.4 ml/kg)麻醉, 左侧颈外静脉注入1000 U/kg肝素抗凝血, 右侧颈总动脉插管。 于松带后2 h自颈动脉放血处死大鼠, 速取后肢腓肠肌及右肺300 mg制成10%组织匀浆, 分别测MPO[4]、 NO、 NOS[5], 取左肺及股二头肌约300 mg测W/D值, 取右肺400 mg测PC[6,7]。取左肺尖及腓肠肌做组织学检查。
1.2 动物分组 动物随机分为4组, 每组6例。(1)对照组: 不结扎后肢; (2)LIR组: 模型复制如上述; (3) LIR+AG组: 松带前15 min滴注AG(30 mg/kg); (4)LIR+L-Arg组: 松带前15 min滴注 L-Arg (150 mg/kg)。各组动物均经颈外静脉给药, 各药均溶于生理盐水(NS)(4 ml/kg)滴注。 LIR组仅滴注相同剂量的NS而不加任何药物治疗, 均60 min内滴完。
1.3 分光光度法测NOS 根据NOS催化L-Arg生成NO, NO与二价铁配合物形成有色物, 在540 nm波长处测其消光值, 以此了解NOS活性。试剂盒购自北京邦定泰克生物制剂公司, 用紫外吸收法测上清液蛋白含量, 计算各样品NOS活性。
1.4 组织NO水平测定 采用萘乙二胺与样品中硝酸盐和亚硝酸盐反应生成粉红色物质, 在分光光度计上530 nm处测样品的吸光度, 按试剂盒(军事医学科学院提供)说明操作, 以NO-2和NO-3离子浓度代表组织NO含量(μmol/L)。
1.5 组织MDA的测定 采用自己配制的试剂硫代巴比妥酸比色法进行测定。
1.6 高效液相色谱法测肺PC 使用仪器: SY5000 LIQUID CHROMATOGRAPH (北京分析仪器厂), N2000色谱数据工作站 (浙江大学智能信息工程研究所)。色谱柱: Hypersil SiO2 4.0×300 mm, 粒径10 μm (大连依利特)。流动相由乙腈-甲醇-85%磷酸(85∶10∶1 V/V)组成, 混匀, 过滤(0.2 μm), 并脱气后使用。 流速为1.0 ml/min, 进样量10 μl, 以每克肺组织含PC量表示, 结果见表2。PC的出峰时间是2.95±0.02 min。
1.7 组织形态学观察 每组动物任取2只, 实验结束时, 取左上肺及腓肠肌经10%多聚甲醛固定, 备做光镜标本,并对切片进行图像分析(北京新航图像分析系统), 随机选择6个低倍视野(10×10)测其肺泡间隔面密度值, 以目标面积/统计场面积表示。
1.8 试剂 L-Arg、 AG和PC标准品购自Sigma公司, 乙腈、 甲醇为美国Fisher公司色谱纯级产品, 磷酸为国产优级纯, 余为国产分析纯试剂。
1.9 统计学分析 数据用mean±SD表示, 用方差分析q检验统计处理。
2结果
2.1 各组动物骨骼肌生化检查结果
LIR组与对照组比较, NOS活性增强, 产生NO增多, MPO、 MDA、 W/D值明显升高(P<0.01)。 AG给药后, NOS活性明显降低(P<0.01), NO产生减少, 而组织MPO、 MDA、 W/D值却较LIR组升高(P<0.05), 组织损伤加重。滴注L-Arg后, NOS活性虽无明显变化(P>0.05), 但NO产生增多, MPO、 MDA、 W/D值降低, 减轻了组织损伤。
2.2 各组动物肺组织生化检查结果
LIR组与对照组比较, NOS活性增强, 产生NO增多, MPO、 MDA、 W/D值明显升高(P<0.05和P<0.01), PC (出峰时间为2.998±0.02 min)含量降低(P<0.01)。 AG给药后, 与LIR组比较NOS活性明显降低(P<0.01), NO产生减少, 而组织MPO、 MDA、 W/D值升高(P<0.05), PC含量进一步降低, 组织损伤加重。用L-Arg 治疗后, 与LIR组比较NOS活性虽无明显变化(P>0.05), 但NO产生增多, MPO值、 MDA、 W/D值均降低, PC含量增加(P<0.05), 减轻了组织损伤。
2.3 组织形态学的变化
与对照组比较, LIR组肌纤维明显肿胀、 变性、 断裂, 间质内血管扩张充血, 血细胞粘附于血管壁。肺组织间质血管扩张充血, 中性粒细胞聚集和浸润, 肺间隔加宽, 未见透明膜形成。LIR+AG组病变加重, 而LIR+L-Arg 组病变减轻。各组肺间隔面密度值见图3。
3讨论
我们的前期工作已证明了LIR后血管组织iNOS活性明显增高[8]。本实验观察到, 缺血再灌注后骨骼肌和肺组织NOS活性增加, NO生成增加, 与文献报道相符[1, 2] 。 同时观察到, 给予NOS抑制剂AG后, NOS活性降低, NO生成减少, 骨骼肌和肺的损伤却加重。 相反, 给予 L-Arg 治疗后, NOS活性虽无明显改变, 却能增加NO的产生, 而使骨骼肌和肺组织的损伤减轻, 结果提示内源性NO的增高在LIR后早期引起局部骨骼肌和远端肺的损伤中起保护作用。
目前有关研究NO在LIR后ALI中作用的报道较少见, 结果尚存争议, 其原因可能与ALI的阶段及所用药物种类、 剂量和作用时程等有关。NO的作用具有两面性, 适量时可通过降低血管的反应性维持器官的灌注、 抗血小板和白细胞聚集、 消除氧自由基抑制脂质过氧化、 改善微循环等而起代偿性的保护作用。NO生成过多时又可形成毒性更强的过氧亚硝基化合物, 与氧自由基协同加重组织的损伤。本研究观察了LIR后2 h时NO与各损伤指标的关系, 结果表明NO在LIR后早期对ALI起保护作用。随着再灌注时间的延长, NOS活性和NO的产生以及与ALI的关系有待进一步研究。目前多数学者认为LIR后ALI的机制实际上是全身炎症反应综合征(SIRS)在肺部的表现, 但参与炎症反应的细胞和因子很多, 何者为首要因素以及这些因素与NO的关系有待进一步研究。
参考文献
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