17β-雌二醇下调血管平滑肌内皮素A型受体的表达
中山医科大学生理教研室； 广州 510089 王庭槐*；谈智；刘培庆；鲁伟；杨丹；潘敬运
关键词：雌激素；雌激素受体；血管平滑肌细胞；内皮素；内皮素受体
摘要：为进一步探讨雌激素对心血管的保护作用, 实验在双侧卵巢去势大鼠模型和培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)上, 观察17β-雌二醇(E2)对血管反应性及VSMCs增殖的影响, 以RT-PCR 和Western blot检测内皮素受体(ETAR)的表达。结果显示: 去势雌性大鼠血管对内皮素(ET-1)的反应性明显增高, ETAR特异性受体阻断剂BQ123能完全阻断ET-1对VSMCs增殖的影响, E2能明显抑制ET-1对VSMCs增殖的作用, RT-PCR结果显示E2能抑制ETAR mRNA的表达, Western blot进一步证实E2能抑制ETAR蛋白表达; E2受体阻断剂Tamoxifen能部份抑制ET-1对VSMCs的增殖及ETAR的mRNA和蛋白的表达。以上结果提示: ET-1促VSMCs增殖的效应主要是由ETAR介导的, 雌激素能通过下调ETAR来抑制ET-1对VSMCs促增殖的作用和血管对ET-1的反应, 且此作用与雌激素受体有关。
流行病学调查显示, 雌激素(estrogen, E2)具有心血管保护作用。近年来, 对平滑肌生物学特性及其在动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)等心血管疾病中作用的研究取得了重大进展[1], 现已证实, 在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)上存在雌激素受体, 这些受体可介导雌激素对VSMCs增殖的抑制作用[2]。可见, 抑制VSMCs增殖可能是雌激素抗AS的一个重要途径。内皮素(endothelin ET)是一种由21个氨基酸组成的血管活性多肽,具有强大的促血管平滑肌细胞增殖、收缩血管和升高血压等作用。其中ET-1在血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs) 和 VSMCs 中生成, 与心血管5期王庭槐等: 17β-雌二醇下调血管平滑肌内皮素A型受体的表达生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷功能关系密切。ET-1 只有与靶细胞膜上的ET受体(ETR)结合后, 启动一系列细胞内信号传递过程, 方可实现其生物学效应。内皮素受体(ETR)分为ETA、 ETB和ETC三类, 其中ETAR主要分布于VSMCs, 对ET-1有选择性亲和性, 介导ET-1对血管的收缩和血管壁增殖的作用, 在AS的发生、 发展过程中起着重要的中介作用。有报道, 在AS患者体内血浆中ET-1的水平增高, 在粥样硬化斑块中ETAR表达增高[5], 本实验从ETAR着手来进一步探讨雌激素抗AS作用的机制。
1材料和方法
1.1 材料与试剂雌性SD大鼠由中山医科大学动物中心提供。 Endothelin-1、 tamoxifin、 17β-雌二醇、 PMSF、 leupeptin、 胰蛋白酶均为Sigma公司产品, BQ123 为American Peptide Company产品, TRIzol试剂盒、 DMEM培养基为GIBCO 公司产品, RT-PCR试剂盒为Boehringer Mannheim公司产品, ECL试剂盒、 cDNA分子MarK为Gene公司产品, [~3H]thymidine为中国原子能科学研究所产品, ETAR抗体由美国加州太平洋医学中心癌症研究所刘勇博士惠赠, 寡核苷酸引物由上海生物工程公司合成,其余均为国产分析纯。
1.2 离体血管条实验雌性SD大鼠30只(200~250 g), 分三组: 假手术组(sham), 去势组(ovariectomized)和雌激素替代组。术后1周给药, 雌激素替代组, 每天皮下注射17β-雌二醇20 μg/kg, 假手术组和去势组给予相同量的溶剂, 1个月后实验。
快速取出胸主动脉放入冰冷改良的Krebs液(mol/L: NaCl 115.0、 KCl 5.0、 MgSO4 1.16、 NaH2PO4 1.16、 NaHCO3 21.9、 CaCl2 2.5和Glucose 11.0, pH 7.2~7.4)中。制备长约3~4 mm的血管环, 置于10 ml充满37℃ Krebs液的浴槽中, 持续通入95% O2与5% CO2的混合气。在2 g前负荷下平衡2 h, 其间每隔20 min更换Krebs溶液1次。借助张力传感器由平衡记录仪记录血管环张力变化。作ET-1的浓度依赖性收缩反应实验。实验结束后, 滤纸吸干动脉环的水分并称重, 收缩力以mg/mg净组织重 (mg/mg wet tissue)表示。
1.3 血管平滑肌细胞培养利用组织块贴壁法进行VSMCs培养。待细胞长满后用0.125%的胰蛋白酶传代。实验用4~6代细胞。所用的VMSCs用α-actin抗体、 ABC免疫组化法进行鉴定。
1.4 [~3H]-TdR掺入率的测定 VSMCs以5×105个cell/ml密度接种于24孔板上, 用无血清的DMEM液培养24 h, 加入不同浓度的ET-1继续培养。在有些实验中, 加入ET-1前1 h, 加或不加入10-6 mol/L的BQ123, 10-6 mol/L的tamoxifen或不同浓度的17β-雌二醇。20 h后, 每孔加入37 kBq/ml [3H]-TdR继续孵育8 h, 移去培养液。用10%的三氯乙酸4℃固定30 min, 再用预冷的PBS液清洗两遍, 最后用含1% SDS的0.2 mol/L的NaOH溶液0.5 ml裂解细胞。 37℃、 12 h后收集裂解液, 置于含有8 ml闪烁液的测量杯中, 摇匀放置在液闪烁计数仪上进行放射活性计数测定。
1.5 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)ETAR寡核苷酸引物根据Masaki H[3]等发表的鼠ETAR的cDNA序列设计合成: 上游为5′-GACG~GC~TTT~CAA~ATAT~ATCA~ACA~CT~GTG-3′, 下游为5′-GG~AGA~CAA~TTT~CAA~TGG~CG~GT-3′, 这对引物可扩增出长度为397 bp的ETAR的cDNA片断。内标GAPDH寡核苷酸引物根据Fort P[4]等发表的鼠GAPDH的cDNA序列设计合成: 上游为5′-CAT~CAC~CAT~CTT~CCA~GG~AGCG-3′, 下游为5′-TGA~CCT~TGCC~CAC~AG~CC~TTG-3′, 这对引物可扩增出长度为443 bp的GAPDH的cDNA片断。采用一步法RT-PCR试剂盒进行逆转录聚合酶链式反应。反应总体积50 μl, 反应条件: 50℃、 30 min; 94℃、 2 min 1个循环; 94℃、 30 s; 45℃、 30 s; 68℃、 45 s共10个循环; 94℃、 30 s; 50℃、 30 s; 68℃、 30 s共25个循环; 最后68℃、 7 min 1个循环终止。RT-PCR产物在1.5%琼脂糖上电泳, 电解液为1倍的TBE。用GDS凝胶成相系统打印结果, 条带用计算机图像分析系统扫描定量。
1.6 免疫印迹法(Western blot)测定ETAR蛋白表达各种干扰因素处理细胞12 h后, 弃去培养液, 加入0.15 ml蛋白提取液, 组分为(mol/L): β磷酸甘油20、 焦磷酸钠50、 NaF 50、 EDTA 5、 EGTA 5、 PMSF 0.5、 NaCl 50、 leupeptin 0.02、 β巯基乙醇0.3% (v/v)。收集提取液, 4℃离心(13?000 r/min×10 min), 取上清液Bradford法定蛋白浓度, 调至200 μg/ml。SDS-PAGE电泳, 电印迹转移至硝酸纤维膜上, 1% BSA的TBST室温封闭1 h, 分别与一抗(兔抗鼠ETAR单克隆抗体, 1∶10?000)和二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)室温孵育1 h, 与ECL试剂反应1 min, X胶片曝光20 s。条带用计算机图像分析系统扫描定量。
1.7 统计处理数据以mean±SD表示。以单因素方差分析, 组间t检验作统计学处理, P<0.05被认为具有统计学差异。
2结果
2.1 各组大鼠主动脉对ET-1的反应
如图1所示, 假手术组与雌激素替代组主动脉对ET-1的反应无明显差异(n=8), EC50分别是2.91±0.62 10-9 mol/L和2.90±0.16 10-9 mol/L (P>0.05 vs sham)。 而去势组主动脉对ET-1的反应性明显增高(n=8), EC50为2.16±0.37 10-9 mol/L (P<0.05 vs sham)。最大收缩力假手术组192.5±28.1 mg/mg wet tissue, 雌激素替代组183.4±23.3 mg/mg wet tissue (P>0.05 vs sham), 而去势组237.2±32.7 mg/mg wet tissue (P<0.05 vs sham)。
2.2 [3H]-TdR的测定
ET-1能呈剂量依赖性地促进 VSMCs [3H]-TdR的掺入, 在10-7 mol/L时达到最大值(图中未显示)。10-6 mol/L的BQ123能完全抑制ET-1的作用(图2: n=6, P<0.01 vs 10-7 mol/L ET-1), 17β-雌二醇能呈剂量依赖性地抑制ET-1的促进 VSMCs [3H]-TdR的掺入作用, 在10-7 mol/L时达到最大效应(n=6, P<0.05 vs 10-7 mol/L ET-1)。10-6 mol/L的tamoxifen能部分抑制17β-雌二醇对ET-1的抑制作用(n=6, P<0.05 vs 10-7 mol/L ET-1+10-7 mol/L 17β-E2组)。ET组与ET+E2+Tam组之间无差异。
2.3 RT-PCR和Western blot
RT-PCR显示: 10-10~10-7 mol/L的17β-雌二醇在作用12 h后能下调VSMCs上ETAR mRNA的表达(图4); Western blot 进一步证实, 17β-雌二醇能下调ETAR蛋白表达(图5) (P<0.05, vs control, n=3)。17β-雌二醇的作用能被10-6 mol/L的tamoxifen所部分抑制。
3讨论
动脉粥样硬化为诸多因素相互作用引起动脉机械性狭窄的病理过程, 确切病因迄今尚未完全阐明。在AS患者体内, 血浆中ET-1的水平增高, 在粥样硬化斑块中ETAR表达增高[5], 这都提示ET-1在AS可能起着重要的中介作用。
去势雌性大鼠对ET-1的反应性明显增高, 而雌激素替代组的大鼠对ET-1的反应性和最大收缩力与假手术组无差异。造成这种情况的原因在于去势雌性大鼠切除了双侧卵巢, 体内雌激素水平明显下降, 而雌激素替代组的大鼠补充了外源的雌激素, 维持其体内雌激素水平[6]。实验结果表明, 雌激素能影响血管对ET-1 的反应性。在AS患者体内, 斑块和增生的血管对ET-1的反应性异常增高, 引起血管持续收缩, 易导致和加重血管内皮的损伤, 引起VSMCs 的迁移和增殖, 从而促进AS的发展。我们的实验结果表明, 雌激素通过影响血管对ET-1 的反应, 可能是雌激素抗AS的一个重要途径。
为了进一步探讨雌激素影响血管对ET-1反应的机制, 我们进行了细胞增殖实验。ET-1可浓度依赖性地促进VSMCs [3H]-TdR的掺入, ETAR特异性阻断剂BQ123能完全阻断ET-1对VSMCs的[3H]-TdR掺入量的影响(图2), 表明ET-1促VSMCs增殖主要是由ETAR所介导的。生理浓度下(10-9~10-7 mol/L)的17β-雌二醇能对抗ET-1促进VSMCs增殖的作用(图3)。这些结果强烈提示雌激素抑制ET-1促VSMCs增殖作用可能与ETAR 有关。因此我们进行了有关的分子生物学实验, 从分子水平来探讨两者间的关系。
RT-PCR结果显示, 17β-雌二醇(E2)在生理浓度下(10-9~10-7 mol/L)可抑制培养的VSMCs上ETAR mRNA的表达(图4)。这可能就是雌激素抑制ET-1对VSMCs促增殖的作用和血管对ET-1的反应的机制。由于mRNA要经过转录和翻译后才能表达有功能的蛋白, mRNA水平并不一定代表蛋白水平, 所以我们使用Western blot来进一步验证雌激素对ETAR蛋白的影响。ETAR受体蛋白由427个氨基酸组成, 分子量约在45 kD至50 kD之间。Western blot结果显示, 雌激素可抑制ETAR蛋白的表达(图5)。研究结果表明, 雌激素可通过减少ETAR mRNA含量来下调ETAR的表达。
雌激素抑制VSMCs增殖的机制并不十分清楚, 可能与多种因素有关。如我室曾报道雌激素能诱导VSMCs上eNOS的表达, 促进NO的释放, NO能抑制钙离子通道, 减少细胞内钙离子浓度等[7]。本研究则着重从雌激素对内皮素系统影响角度探讨雌激素抑制VSMCs增殖的机制, 证明抑制VSMCs 的ETA受体的表达可能是雌激素抑制VSMCs增殖, 发挥抗AS作用的重要机制。
本研究结果还显示, 雌激素受体拮抗剂tamoxifen能抑制17β-雌二醇对VSMCs上[3H]-TdR的掺入(图2)和ETAR的表达(图4, 5), 表明雌激素是通过其受体来发挥作用的。现在已克隆出两种不同的ER: ERα[8]和ERβ[9]。两者基因序列具有同源性, 有着相似的功能, 但也存在着差异。雌激素是通过哪种类型的ER来影响ETAR的表达, 尚不清楚, 需要用进一步的实验来验证。
总之, 本文证明了ET-1促VSMCs增殖主要是由ETAR所介导的, 雌激素可通过减少VSMCs上ETAR mRNA含量来下调ETAR的表达从而抑制ET-1对VSMCs促增殖的作用和血管对ET-1的反应, 且此作用与雌激素受体有关。 提示卵巢切除术后或绝经期妇女体内雌激素水平下降, 血管可对ET-1反应增强, 可能是绝经期妇女AS发病率增高的原因之一, 这为进一步探讨雌激素抗动脉粥样硬化作用的机制提供了新资料。
参考文献
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