应激大鼠肾胞液［~3H］醛固酮结合活性的变化及调节机制的初步研究
第三军医大学复合伤研究所；重庆 400038 刘都户*；粟永萍；张渭；楼淑芬；高京生；程天民
关键词：烫伤；应激；醛固酮结合活性
摘要：为探讨烫伤引起病理性应激时大鼠肾胞液醛固酮结合活性的变化及可能的调节机制, 以[~3H]-醛固酮为配体, 用放射性配基-受体结合分析法测定了正常对照组、 轻度烫伤组和重度烫伤组大鼠肾胞液醛固酮结合活性的结合容量(Rt)和表观解离常数(Kd); 采用体内注射TNF-α、 IL-1β中和抗体和α-促黑色素细胞刺激激素(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)和合成肽KPV (Ac-D-Lys-L-Pro-D-Val)等措施调节其改变。结果发现, 肾胞液存在两种不同结合容量、 不同亲和力的醛固酮结合活性受体。与正常对照组的Rt (Rt1: 41.6±7.2 fmol/mg pro; Rt2: 317.6±70.0 fmol/mg pro)相比, 轻烫组的Rt (Rt1: 41.4±5.0 fmol/mg pro; Rt2: 314.8±45.7 fmol/mg pro)无显著差异(P>0.05; P>0.05); 重烫组的Rt (Rt1: 22.4±5.4 fmol/mg pro; Rt2: 196.3±32.5 fmol/mg pro)则显著下降(P<0.01; P<0.01)。体内注射TNF-α与 IL-1β中和抗体、 α-MSH及KPV均能明显提高重烫组Rt值。结果提示, 重度烫伤大鼠肾胞浆醛固酮结合活性降低, TNF-α、 IL-1β中和抗体、 α-MSH及KPV均可防止重度烫伤引起病理性应激时醛固酮结合活性降低。
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糖皮质激素和盐皮质激素作为应激的主要效应分子, 在发挥应激的防护作用、 维持机体创伤后内稳态平衡中起着非常重要的作用[1]。目前已有关于应激、 烫伤、休克时糖皮质激素受体减少及靶细胞对糖皮质激素反应性降低的报道[2~6]。有的学者提出了糖皮质激素受体减少可使休克加重的假说[7，8]。但在严重创伤机体中的另一重要应激效应激素醛固酮的结合活性,目前还不甚明了。本文以局部烫伤作为应激源, 以醛固酮(ald)为配基, 研究应激时肾脏胞液醛固酮结合活性的变化, 并对其机制进行了初步探讨。
1材料和方法
1.1材料[1,2,6,7-3H]醛固酮([~3H]aldosterone, [~3H]Ald)、 醛固酮(aldosterone, Ald)为Sigma公司产品。S.A. 1.85 TBq, 稀释成500倍备用。Rat IL-1β、 TNF-α中和抗体为Endogen产品。α-MSH亦为Sigma公司提供。KPV肽由第三军医大学免疫学研究所合成。
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1.2 方法
1.2.1 实验动物分组及处理第一部分: 观察烫伤引起病理性应激大鼠肾胞液醛固酮结合活性的变化。Wistar雄性大鼠18只(180~200 g), 腹腔注入1%戊巴比妥纳(30 mg/kg)麻醉。随机分为3组， (1)正常对照组(n=6): 大鼠不做任何处理; (2)轻度烫伤组(n=6): 置于90℃水中5~6 s, 烫伤面积为9%~10%(按体重等换算出动物体表面积, 在模板上刻出不同面积的椭圆形洞, 用于烫伤动物模型的制备); (3)重度烫组(n=6): 置于90℃水中9~10 s, 烫伤面积为35%左右。对烫伤后的动物立即进行腹腔注入生理盐水(5 ml/100 g体重)的复苏治疗。烫伤时间为20∶30~21∶00, 12 h后处死动物, 按文献[9]的方法, 取肾脏组织制备肾胞液(简述见1.2.2)。第二部分: 观察TNF-α与IL-1β中和抗体、 α-MSH和KPV对重度烫伤引起病理性应激大鼠肾胞液醛固酮结合活性的调节作用。Wistar雄性大鼠24只(180~200 g), 腹腔注入1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉, 随机分为4组: (1) Anti-TNF-α组(n=6): 烫伤前15 min尾静脉注入TNFα中和抗体(3.5 mg/kg), 其它处理按重度烫伤组实行; (2) Anti-IL-1 组(n=6): 烫伤前15 min尾静脉注入IL-1β中和抗体(3.5 mg/kg), 其它处理同重烫伤组; (3) α-MSH组(n=6): 烫伤前15 min腹腔注入α-MSH (100 μg/0.2 ml生理盐水), 其它处理同重度烫伤组; (4) KPV组(n=6): 烫伤前15 min腹腔注入KPV (40 μg/0.2 ml生理盐水), 其它处理同重度烫伤组。
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1.2.2 大鼠肾胞液醛固酮结合活性的测定醛固酮结合活性的放射性配体结合分析法参考文献[9]。动物断头处死后的新鲜肾脏组织用匀浆缓冲液(50 mmol/L Tris HCl, 250 mmol/L蔗糖, 50 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L 钼酸钠, 1 nmol/L 巯基乙醇)进行匀浆破碎, 低温超速离心(114?500 g, 30 min, 4℃)。在[~3H]Ald终浓度2×10-10~2×10-8 mol/L范围内取14个点, 用250 μl肾胞液与 ~3H标记的醛固酮孵育(0℃, 24 h)。采用双位点系统Scatchard作图, 分析测定醛固酮结合活性的Rt和Kd值[10,11]。肾胞液蛋白含量的测定用Lowry′s法。
实验数据用mean±SD表示, 用t检验判定均数差异的显著性。
2结果
2.1 大鼠肾胞液醛固酮结合活性的Scatchard作图
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肾胞液存在两种不同结合容量、 不同亲和力的醛固酮结合活性位点。
2.2 烫伤大鼠肾胞液醛固酮结合活性的变化
大鼠烫伤后12 h, 用放射性配基-受体结合分析。
统计学分析表明, 三组间的Kd值(包括Kd1 和Kd2)变化不大(P>0.05); 轻度烫伤组的Rt (Rt1和Rt2)与正常对照组相比, 无显著差异(P>0.05); 而重度烫伤组的Rt (Rt1和Rt2)比正常对照组明显降低(P<0.01)。
2.3 TNF-α与IL-1β中和抗体、 α-MSH和KPV对重烫组肾胞液醛固酮结合活性的调节作用
重度烫伤前15 min给大鼠体内分别注射TNF-α与IL-1β中和抗体、 α-MSH和KPV, 同样在12 h后检测肾胞液醛固酮结合活性的Rt和Kd值。
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统计学结果表明, TNF-α与IL-1β中和抗体和α-MSH及KPV组的Rt值均明显大于重度烫伤组(P<0.01), TNF-α与IL-1中和抗体和α-MSH及KPV组的肾胞液醛固酮结合活性的Kd值是: Kd1 (nmol/L)分别为2.334±0.270、 2.115±0.399、 2.417±0.667和2.112±0.146; Kd2 (nmol/L)分别为79.214±3.146、 80.822±9.900、 83.864±11.619和81.646±4.201, 与重度烫伤组无显著差异(P>0.05)。
3讨论
醛固酮是由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素, 严重创伤后的疼痛、 失液后的低血容量以及感染等刺激, 均可使其反应性升高。据报道[12~14], 临床表现为: (1)烧伤后血清醛固酮含量均显著升高, 且与烧伤程度成正比, 其增强幅度远高于一般创伤的反应; (2)烧伤后醛固酮应激性升高从休克期开始, 一直延续到创面完全愈合前, 且在休克期升高值是正常的6倍, 为严重烧伤后机体应激性反应的第一个高峰。进入回吸收期后, 血容量逐渐恢复, 组织缺血、 缺氧得到改善, 其含量迅速下降, 但由于烧伤毒素被持续吸收, 儿茶酚胺分泌持续增加, 高热、 高代谢率发生改变, 其含量仍显著高于正常水平。之后缓慢下降, 伤后30 d时(创面愈合前)仍高于正常值的3~3.5倍, 这提示烧伤后如创面未完全恢复, 机体的应激性反应却依然存在; (3)感染和菌血症是严重烧伤后机体应激性反应的第二个高峰, 且菌血症期峰值又高于休克期; 菌血症期醛固酮分泌如骤然减少, 且下降至正常值以下, 病人在3~5 d内即死亡。这些资料均显示了醛固酮作为效应分子在严重创伤所致的病理性应激反应中的重要作用。另外, 我们发现, 烧伤后血清醛固酮对Na+、 K+的调节出现了与其生理活性不协调的现象; 在休克期血清醛固酮极度升高的同时, 血Na+较低(133±3.20 mmol/L); 休克期后的第3天, 醛固酮含量骤然从1?441 pmol/L下降到780 pmol/L, 此后3~15 d内含量进一步缓慢下降, 但血钠却回升到正常水平(136~143 mmol/L)。应激时, 靶细胞对激素反应性变化的机制十分复杂, 但受体是决定靶细胞反应性的关键性大分子, 已有严重创伤时糖皮质激素受体下降的报道[7]。以上资料均提示, 作为应激反应重要内涵之一的盐皮质激素-醛固酮的结合活性也存在下降的可能。局部创伤组织发生血管通透性升高, 中性粒细胞、 单核细胞渗出, 血管内皮损伤, 加上细菌感染释放出LPS, 均能导致创伤组织局部依次产生TNFα、 IL-1β及IL-6等细胞因子。这3种细胞因子以自分泌和旁分泌的形式产生级联放大作用。大量产生的TNFα、 IL-1β及IL-6进入血液循环, 可单独也可联合协同在下丘脑、 垂体和肾上腺三个不同水平起兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴的作用[15~19]。本实验观察到, 轻度烫伤大鼠肾胞液醛固酮结合活性未见明显改变, 重度烫伤可使大鼠肾胞液醛固酮结合活性的Rt值下降, 而用TNFα与IL-1β中和抗体可明显减低其下降。依据此实验结果, 我们提出以下假设: 病理性应激时, 适当的TNNα、 IL-1β等细胞因子的增加可启动下丘脑-垂体-肾上腺应激反应轴兴奋, 使交感神经激活而副交感神经抑制, 从而提高机体的抗损伤能力, 但持续高水平促炎性细胞因子可以在应激效应分子醛固酮结合活性水平降低应激的保护作用。此理论还需进一步的实验证实。本实验所测正常对照组的Rt1、 Rt2和文献报道基本一致, Kd1、 Kd2比文献报道所测值偏小, 这与所用试验动物及所测方法不完全一样有关。实验中非特异结合约占总结合的10%左右。
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促黑色素细胞刺激激素(α-MSH)是一种内源性神经肽, 来源于其前体激素-阿黑皮素(propimelanocotin, POMC)。 POMC和α-MSH最先在垂体中检出, 近年来发现在非垂体组织如脑、 皮肤、 性腺、 胃肠道和免疫活性细胞上也存在。α-MSH和黑皮素受体(melanocortin receptor, MCR)结合, 活化腺苷酸环化酶, 提高细胞内cAMP浓度, 增强酪氨酸酶活性, 刺激黑色素细胞分化、 增殖, 促进黑色素生成。另外α-MSH抑制发热及各种实验性炎症, 如动物模型中由炎症介质引起的急性炎症、慢性炎症、 迟发性过敏反应和内毒素引起的系统性炎症反应综合症以及再灌注损伤所致的脑内炎症等[20]。在人类, α-MSH浓度在炎症部位、 炎症性紊乱患者血浆及注射内毒素后动物的血浆中均增高。α-MSH抑制促炎因子的产生, 抑制巨噬细胞一氧化氮的合成、 新喋呤(neopterin)产生[21]及人成纤维细胞前列腺素E2的生成, 以剂量依赖方式抑制中性粒细胞的趋化作用, 增强IL-10生成, 发挥外周抗炎作用[20]。基于以上的资料提示, 作者将α-MSH试用于严重创伤机体高细胞因子血症的调节, 从而达到提高醛固酮结合活性的目的。本实验证实, α-MSH及其C-端短肽KPV均可减缓重度烫伤引起病理性应激时醛固酮结合活性的下降, 这与其降低促炎症细胞因子的持续过度升高的作用可能有关。关于其具体机制及病理意义, 我们正在做进一步的研究。
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参考文献
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关键词：烫伤；应激；醛固酮结合活性
摘要：为探讨烫伤引起病理性应激时大鼠肾胞液醛固酮结合活性的变化及可能的调节机制, 以[~3H]-醛固酮为配体, 用放射性配基-受体结合分析法测定了正常对照组、 轻度烫伤组和重度烫伤组大鼠肾胞液醛固酮结合活性的结合容量(Rt)和表观解离常数(Kd); 采用体内注射TNF-α、 IL-1β中和抗体和α-促黑色素细胞刺激激素(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)和合成肽KPV (Ac-D-Lys-L-Pro-D-Val)等措施调节其改变。结果发现, 肾胞液存在两种不同结合容量、 不同亲和力的醛固酮结合活性受体。与正常对照组的Rt (Rt1: 41.6±7.2 fmol/mg pro; Rt2: 317.6±70.0 fmol/mg pro)相比, 轻烫组的Rt (Rt1: 41.4±5.0 fmol/mg pro; Rt2: 314.8±45.7 fmol/mg pro)无显著差异(P>0.05; P>0.05); 重烫组的Rt (Rt1: 22.4±5.4 fmol/mg pro; Rt2: 196.3±32.5 fmol/mg pro)则显著下降(P<0.01; P<0.01)。体内注射TNF-α与 IL-1β中和抗体、 α-MSH及KPV均能明显提高重烫组Rt值。结果提示, 重度烫伤大鼠肾胞浆醛固酮结合活性降低, TNF-α、 IL-1β中和抗体、 α-MSH及KPV均可防止重度烫伤引起病理性应激时醛固酮结合活性降低。
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糖皮质激素和盐皮质激素作为应激的主要效应分子, 在发挥应激的防护作用、 维持机体创伤后内稳态平衡中起着非常重要的作用[1]。目前已有关于应激、 烫伤、休克时糖皮质激素受体减少及靶细胞对糖皮质激素反应性降低的报道[2~6]。有的学者提出了糖皮质激素受体减少可使休克加重的假说[7，8]。但在严重创伤机体中的另一重要应激效应激素醛固酮的结合活性,目前还不甚明了。本文以局部烫伤作为应激源, 以醛固酮(ald)为配基, 研究应激时肾脏胞液醛固酮结合活性的变化, 并对其机制进行了初步探讨。
1材料和方法
1.1材料[1,2,6,7-3H]醛固酮([~3H]aldosterone, [~3H]Ald)、 醛固酮(aldosterone, Ald)为Sigma公司产品。S.A. 1.85 TBq, 稀释成500倍备用。Rat IL-1β、 TNF-α中和抗体为Endogen产品。α-MSH亦为Sigma公司提供。KPV肽由第三军医大学免疫学研究所合成。
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1.2 方法
1.2.1 实验动物分组及处理第一部分: 观察烫伤引起病理性应激大鼠肾胞液醛固酮结合活性的变化。Wistar雄性大鼠18只(180~200 g), 腹腔注入1%戊巴比妥纳(30 mg/kg)麻醉。随机分为3组， (1)正常对照组(n=6): 大鼠不做任何处理; (2)轻度烫伤组(n=6): 置于90℃水中5~6 s, 烫伤面积为9%~10%(按体重等换算出动物体表面积, 在模板上刻出不同面积的椭圆形洞, 用于烫伤动物模型的制备); (3)重度烫组(n=6): 置于90℃水中9~10 s, 烫伤面积为35%左右。对烫伤后的动物立即进行腹腔注入生理盐水(5 ml/100 g体重)的复苏治疗。烫伤时间为20∶30~21∶00, 12 h后处死动物, 按文献[9]的方法, 取肾脏组织制备肾胞液(简述见1.2.2)。第二部分: 观察TNF-α与IL-1β中和抗体、 α-MSH和KPV对重度烫伤引起病理性应激大鼠肾胞液醛固酮结合活性的调节作用。Wistar雄性大鼠24只(180~200 g), 腹腔注入1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉, 随机分为4组: (1) Anti-TNF-α组(n=6): 烫伤前15 min尾静脉注入TNFα中和抗体(3.5 mg/kg), 其它处理按重度烫伤组实行; (2) Anti-IL-1 组(n=6): 烫伤前15 min尾静脉注入IL-1β中和抗体(3.5 mg/kg), 其它处理同重烫伤组; (3) α-MSH组(n=6): 烫伤前15 min腹腔注入α-MSH (100 μg/0.2 ml生理盐水), 其它处理同重度烫伤组; (4) KPV组(n=6): 烫伤前15 min腹腔注入KPV (40 μg/0.2 ml生理盐水), 其它处理同重度烫伤组。
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1.2.2 大鼠肾胞液醛固酮结合活性的测定醛固酮结合活性的放射性配体结合分析法参考文献[9]。动物断头处死后的新鲜肾脏组织用匀浆缓冲液(50 mmol/L Tris HCl, 250 mmol/L蔗糖, 50 mmol/L KCl, 3 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L 钼酸钠, 1 nmol/L 巯基乙醇)进行匀浆破碎, 低温超速离心(114?500 g, 30 min, 4℃)。在[~3H]Ald终浓度2×10-10~2×10-8 mol/L范围内取14个点, 用250 μl肾胞液与 ~3H标记的醛固酮孵育(0℃, 24 h)。采用双位点系统Scatchard作图, 分析测定醛固酮结合活性的Rt和Kd值[10,11]。肾胞液蛋白含量的测定用Lowry′s法。
实验数据用mean±SD表示, 用t检验判定均数差异的显著性。
2结果
2.1 大鼠肾胞液醛固酮结合活性的Scatchard作图
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肾胞液存在两种不同结合容量、 不同亲和力的醛固酮结合活性位点。
2.2 烫伤大鼠肾胞液醛固酮结合活性的变化
大鼠烫伤后12 h, 用放射性配基-受体结合分析。
统计学分析表明, 三组间的Kd值(包括Kd1 和Kd2)变化不大(P>0.05); 轻度烫伤组的Rt (Rt1和Rt2)与正常对照组相比, 无显著差异(P>0.05); 而重度烫伤组的Rt (Rt1和Rt2)比正常对照组明显降低(P<0.01)。
2.3 TNF-α与IL-1β中和抗体、 α-MSH和KPV对重烫组肾胞液醛固酮结合活性的调节作用
重度烫伤前15 min给大鼠体内分别注射TNF-α与IL-1β中和抗体、 α-MSH和KPV, 同样在12 h后检测肾胞液醛固酮结合活性的Rt和Kd值。
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统计学结果表明, TNF-α与IL-1β中和抗体和α-MSH及KPV组的Rt值均明显大于重度烫伤组(P<0.01), TNF-α与IL-1中和抗体和α-MSH及KPV组的肾胞液醛固酮结合活性的Kd值是: Kd1 (nmol/L)分别为2.334±0.270、 2.115±0.399、 2.417±0.667和2.112±0.146; Kd2 (nmol/L)分别为79.214±3.146、 80.822±9.900、 83.864±11.619和81.646±4.201, 与重度烫伤组无显著差异(P>0.05)。
3讨论
醛固酮是由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素, 严重创伤后的疼痛、 失液后的低血容量以及感染等刺激, 均可使其反应性升高。据报道[12~14], 临床表现为: (1)烧伤后血清醛固酮含量均显著升高, 且与烧伤程度成正比, 其增强幅度远高于一般创伤的反应; (2)烧伤后醛固酮应激性升高从休克期开始, 一直延续到创面完全愈合前, 且在休克期升高值是正常的6倍, 为严重烧伤后机体应激性反应的第一个高峰。进入回吸收期后, 血容量逐渐恢复, 组织缺血、 缺氧得到改善, 其含量迅速下降, 但由于烧伤毒素被持续吸收, 儿茶酚胺分泌持续增加, 高热、 高代谢率发生改变, 其含量仍显著高于正常水平。之后缓慢下降, 伤后30 d时(创面愈合前)仍高于正常值的3~3.5倍, 这提示烧伤后如创面未完全恢复, 机体的应激性反应却依然存在; (3)感染和菌血症是严重烧伤后机体应激性反应的第二个高峰, 且菌血症期峰值又高于休克期; 菌血症期醛固酮分泌如骤然减少, 且下降至正常值以下, 病人在3~5 d内即死亡。这些资料均显示了醛固酮作为效应分子在严重创伤所致的病理性应激反应中的重要作用。另外, 我们发现, 烧伤后血清醛固酮对Na+、 K+的调节出现了与其生理活性不协调的现象; 在休克期血清醛固酮极度升高的同时, 血Na+较低(133±3.20 mmol/L); 休克期后的第3天, 醛固酮含量骤然从1?441 pmol/L下降到780 pmol/L, 此后3~15 d内含量进一步缓慢下降, 但血钠却回升到正常水平(136~143 mmol/L)。应激时, 靶细胞对激素反应性变化的机制十分复杂, 但受体是决定靶细胞反应性的关键性大分子, 已有严重创伤时糖皮质激素受体下降的报道[7]。以上资料均提示, 作为应激反应重要内涵之一的盐皮质激素-醛固酮的结合活性也存在下降的可能。局部创伤组织发生血管通透性升高, 中性粒细胞、 单核细胞渗出, 血管内皮损伤, 加上细菌感染释放出LPS, 均能导致创伤组织局部依次产生TNFα、 IL-1β及IL-6等细胞因子。这3种细胞因子以自分泌和旁分泌的形式产生级联放大作用。大量产生的TNFα、 IL-1β及IL-6进入血液循环, 可单独也可联合协同在下丘脑、 垂体和肾上腺三个不同水平起兴奋下丘脑-垂体-肾上腺轴的作用[15~19]。本实验观察到, 轻度烫伤大鼠肾胞液醛固酮结合活性未见明显改变, 重度烫伤可使大鼠肾胞液醛固酮结合活性的Rt值下降, 而用TNFα与IL-1β中和抗体可明显减低其下降。依据此实验结果, 我们提出以下假设: 病理性应激时, 适当的TNNα、 IL-1β等细胞因子的增加可启动下丘脑-垂体-肾上腺应激反应轴兴奋, 使交感神经激活而副交感神经抑制, 从而提高机体的抗损伤能力, 但持续高水平促炎性细胞因子可以在应激效应分子醛固酮结合活性水平降低应激的保护作用。此理论还需进一步的实验证实。本实验所测正常对照组的Rt1、 Rt2和文献报道基本一致, Kd1、 Kd2比文献报道所测值偏小, 这与所用试验动物及所测方法不完全一样有关。实验中非特异结合约占总结合的10%左右。
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促黑色素细胞刺激激素(α-MSH)是一种内源性神经肽, 来源于其前体激素-阿黑皮素(propimelanocotin, POMC)。 POMC和α-MSH最先在垂体中检出, 近年来发现在非垂体组织如脑、 皮肤、 性腺、 胃肠道和免疫活性细胞上也存在。α-MSH和黑皮素受体(melanocortin receptor, MCR)结合, 活化腺苷酸环化酶, 提高细胞内cAMP浓度, 增强酪氨酸酶活性, 刺激黑色素细胞分化、 增殖, 促进黑色素生成。另外α-MSH抑制发热及各种实验性炎症, 如动物模型中由炎症介质引起的急性炎症、慢性炎症、 迟发性过敏反应和内毒素引起的系统性炎症反应综合症以及再灌注损伤所致的脑内炎症等[20]。在人类, α-MSH浓度在炎症部位、 炎症性紊乱患者血浆及注射内毒素后动物的血浆中均增高。α-MSH抑制促炎因子的产生, 抑制巨噬细胞一氧化氮的合成、 新喋呤(neopterin)产生[21]及人成纤维细胞前列腺素E2的生成, 以剂量依赖方式抑制中性粒细胞的趋化作用, 增强IL-10生成, 发挥外周抗炎作用[20]。基于以上的资料提示, 作者将α-MSH试用于严重创伤机体高细胞因子血症的调节, 从而达到提高醛固酮结合活性的目的。本实验证实, α-MSH及其C-端短肽KPV均可减缓重度烫伤引起病理性应激时醛固酮结合活性的下降, 这与其降低促炎症细胞因子的持续过度升高的作用可能有关。关于其具体机制及病理意义, 我们正在做进一步的研究。
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