Genistein对大鼠垂体前叶细胞增殖的抑制作用
第四军医大学基础部生理学教研室；西安 710032 张庆红*；胡玉珍；周士胜；王复周
关键词：genistein；垂体；增殖；凋亡；酪氨酸蛋白激酶抑制剂
摘要：应用细胞培养、 ~3H-TdR掺入、 流式细胞和电镜技术, 观察酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制剂genistein对正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT-20增殖的影响, 并探讨其可能的机制。结果显示: genistein作用48 h后可明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT-20增殖。流式细胞仪检测发现, 50 和100 μmol/L genistein可将AtT-20细胞阻断于G0/G1期及G2/M期, 并出现凋亡峰, 凋亡率分别达19.9%和36.4%。电镜照片显示有凋亡细胞。结果表明, PTK抑制剂可以明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT-20的增殖, 并诱导细胞凋亡, 说明PTK活性对细胞增殖和分化有重要作用。
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酪氨酸蛋白激酶(PTK)是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质, 能催化蛋白质的酪氨酸残基发生磷酸化反应, 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是细胞信号传递的关键变化[1]。PTK通过激活信号转导系统, 调控基因表达、细胞生长和增殖, 影响细胞功能。现在确信PTK与细胞增殖和存活有关。在数种肿瘤中, 如乳腺癌、鳞状细胞癌和胶质瘤, PTK活性升高[2]。许多生长因子和细胞因子通过激活PTK促进细胞增殖。大多数生长因子受体具有酪氨酸激酶结构域, 能与细胞内酪氨酸激酶耦联, 进一步激活一系列下游丝氨酸/苏氨酸激酶。如果剥夺生长因子或细胞因子, 可导致细胞生长停止或凋亡[3]。
垂体腺瘤的病因尚未完全弄清, 研究集中在两方面: 一是异常的生理调节, 二是癌基因的激活或抑癌基因的丧失。越来越多的证据表明, 垂体腺瘤的发生与细胞内信号转导机制异常有关[4], 垂体瘤分泌的一些生长因子如表皮生长因子(EGF)、人成纤维生长因子(hFGF)能通过激活酪氨酸激酶促进垂体1期张庆红等: Genistein对大鼠垂体前叶细胞增殖的抑制作用生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷细胞增殖[5]。
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文献报道, 酪氨酸激酶抑制剂genistein可抑制人垂体瘤细胞增殖[2], 但机制不明。最近的研究表明, PTK在细胞增殖和凋亡中扮演双重角色[3]。Genistein对正常大鼠垂体前叶细胞和AtT-20细胞株增殖的作用以及对其凋亡的研究未见报道。本实验观察了genistein对小鼠垂体瘤细胞株AtT-20和大鼠垂体前叶细胞增殖和凋亡的影响, 以阐明PTK与垂体肿瘤的关系。
1材料和方法
1.1大鼠垂体前叶细胞原代培养雌性SD大鼠(150~200 g), 戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg, ip), 用无菌注射器从左心室向主动脉方向灌注无菌生理盐水20 ml, 冲净垂体中的血细胞。将大鼠浸于70%酒精中10 min。暴露垂体, 收集垂体前叶于小瓶中剪碎, 用0.25%的胰酶和1% DNA酶1∶1消化2次, 每次10~15 min。用含血清的培养液终止胰酶作用, 1?000 g离心10 min, 弃上清, 将细胞重悬于含10%小牛血清的D/F12培养基中(4~5×108/L), 以100 μl/孔加在96孔板内, 置于5% CO2孵箱孵育。第2天换液, 第4天用无血清培养液洗2遍, 加含添加剂的无血清培养液(添加剂包括30 nmol/L硒酸钠、0.6 g/L谷胺酰胺、5 mg/L胰岛素、10 mg/L转铁蛋白、100 μmol/L腐胺、5 g/L葡萄糖、1 g/L牛血清白蛋白、青链霉素、10 mmol/L HEPES), 第6天加药至所需浓度。小鼠AtT-20是一种分泌ACTH的垂体腺瘤细胞株, 培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中(Gibco), 在5% CO2孵箱孵育, 细胞按1×108/L比例接种。
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1.2用3H-TdR掺入法测细胞增殖药物作用48 h后, 吸去培养液, 每孔加不含添加剂的培养液100 μl和含37 kBq ~3H-TdR溶液(上海原子核研究所), 37℃孵育4~6 h后加入0.25%胰酶-2%EDTA溶液20 μl, 20 min后用细胞收集器收集到玻璃纤维纸上, 用液闪记数器(LS-6500, 美国Beckman)进行掺入量测定, 结果以cpm表示。实验数据均以mean±SD表示, 组间用Origin 5.0软件中单因素方差分析进行统计学处理。
1.3流式细胞仪测定将AtT-20接种于70 mm2的培养瓶中, 待细胞达到80%的密度时, 加药作用48 h, 收集细胞。用0.01 mol/L的PBS洗2遍, 离心, 去上清。将3~5ⅹ106细胞用70%乙醇固定, 离心收集细胞, 碘化丙锭染色, 用流式细胞仪(美国Coulter 公司Elite ESP型)测定各细胞周期DNA含量。
1.4透射电镜样品制备细胞离心成团, 用4%戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制, pH 7.4)前固定4~8 h, 1%四氧化锇后固定2 h, 用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗, 丙酮梯度脱水, Epon 812包埋, 65℃烤箱聚合24 h, LKB Nova型超薄切片机制备超薄切片(70 nm), 醋酸双氧钠和枸橼酸铅双染, 并用JEM-2000EX透射电镜观察。
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2结果
2.1Genistein对细胞形态的影响
正常大鼠垂体前叶细胞体积变小, 显示不规则的轮廓, 细胞核固缩、破裂, 细胞易从培养板表面脱落。AtT-20垂体腺瘤细胞变圆, 少数从培养瓶表面脱落, 飘浮在培养基中。
2.2Genistein对细胞增殖的抑制效应
Genistein能明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和AtT-20细胞生长, 并呈剂量依赖性。
2.3Genistein对细胞周期的影响
Genistein处理的AtT-20细胞在G0/G1期前出现凋亡峰, 凋亡率达19.9%和36.4%。
2.4电镜结果
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除正常形态细胞外, 多为具有凋亡特征的细胞。早期, 细胞核染色质增粗, 并沿核膜不均匀边聚积, 随着染色质积聚的增多呈新月状; 后期, 细胞核分裂成多个核碎片, 细胞膜发泡后与主细胞脱离, 形成凋亡小体, 凋亡小体内可见细胞器。
3讨论
Genistein是大豆的主要成分, 流行病学研究表明, 乳腺癌和其他癌症的发生率与饮食中大豆的摄入量成反比[6]。Genistein可抑制鳞状细胞癌和肺癌等细胞的增殖, 并诱导其凋亡[7,8]。Genistein抑制癌症的作用机制仍不清楚, 可能与雌激素受体调控有关[8]。Genistein也是一种PTK的强效广谱抑制剂, 在体内可能通过抑制PTK活性而产生抗肿瘤作用[9]。
本实验表明, Genistein可抑制培养的大鼠垂体前叶细胞的3H-TdR掺入值。Genistein对正常垂体前叶细胞的抑制效应不同于对肿瘤细胞的作用, 对正常大鼠垂体前叶细胞的增殖产生抑制作用的最低剂量要高于AtT-20细胞。这可能是因为在肿瘤细胞, 对 genistein 敏感的靶蛋白被细胞转化过程中所发生的特殊生化事件所掩盖。正常细胞中, 生长因子作用于细胞膜, 激活细胞内PTK, 进而激活细胞内对细胞生长和增殖至关重要的某一蛋白。Genistein只要能抑制PTK活性, 就能有效地抑制该蛋白的作用, 因此, genistein在低浓度就能抑制细胞生长。但是肿瘤细胞常有异常的转化特性, 细胞内PTK分子会发生突变, 同样浓度的 genistein 不能抑制PTK活性, 从而不能抑制该蛋白的磷酸化, 因此也就不能抑制肿瘤细胞的生长。但提高genistein浓度可抑制肿瘤细胞中的另一个靶蛋白, 这样在较高浓度时genistein也能抑制肿瘤细胞生长[10]。
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凋亡是细胞自身破坏的一种基因水平的程序过程, 是细胞内在的决定动物发育和组织平衡的一个重要机制, 如果这个受到严密调控的细胞自杀机制发生功能障碍或失去控制, 将导致肿瘤、神经退行性疾病或其他的病理性变化[3] 。对垂体来说, 紫外线照射与电离辐射、 使用抗癌药物的哺乳后期妇女、 生长因子缺乏以及过度表达某些基因, 均可诱导细胞凋亡[11]。
本文首次发现, genistein可诱导AtT-20细胞发生凋亡, 提示genistein对垂体肿瘤的抑制作用可能是通过诱导凋亡而实现的。Genistein作为酪氨酸激酶的抑制剂, 能有效抑制垂体细胞增殖并诱导其凋亡, 表明酪氨酸激酶活性是垂体肿瘤生长所必须的。酪氨酸激酶调控细胞生长中的机制非常复杂, 它同时又受垂体细胞分泌的生长因子和激素调节。我们的发现为研究酪氨酸激酶对垂体肿瘤细胞的作用提供了一条依据。
参考文献
[1]马晶. 非受体型酪氨酸蛋白激酶与免疫细胞的信号传递. 国外医学免疫分册.1998, 21 (3): 113~116.
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[2]Jones JH, Justice SK, Price A.Suppression of tyrosine kinase activity inhibits ~3H-thymidine uptake in cultured human pituitary tumor cells. J Clin Endocrinol Metab, 1997, 82 (7): 2143~2147.
[3]叶鑫生, 沈倍奋, 汤锡芳等主编。细胞调控探索. 北京: 军事医学科学出版社, 1999, 12~15。
[4]Zhang ZH (张作洪), Bai XJ (白祥军), Lei T (雷 霆) et al. The pituitary adenoma and the abnormity of the cellular signaling mechanism. Chin J Exp Surg (中华实验外科杂志), 1999, 16 (2): 190 ~191 (Chinese, English abstract).
, http://www.100md.com
[5]Oomizu S, Takeuchi S, Takahashi S. Stimulatory effect of insulin-like growth factor I on proliferation of mouse pituitary cells in serum-free culture. J Endocrinol, 1998, 157 (1): 53~62.
[6]Wiseman H. Role of dietary phyto-oestrogens in the protection against cancer and heart disease. Biochem Biophysy Res Commun, 1996, 253 (24): 795~800.
[7]Alhasan SA, Pietrasczkiwicz H, Alonso MD et al. Genistein-induced cell cycle arrest and apoptosis in a head and neck squamous cell carcinoma cell line. Nutr Cancer, 1999, 34 (1): 12~19.
, 百拇医药
[8]Schwartz JA, Liu G, Brooks SC.Genistein-mediated attenuation of tamoxifen-induced antagonism from estrogen receptor-regulated genes. Biochem Biophys Res Commun， 1998, 253 (1): 38~43.
[9]Lian F, Li Y, Bhuiyan M et al. p53-independent apoptosis induced by genistein in lung cancer cells. Nutr Cancer， 1999, 33 (2): 125~131.
[10]Peterson G.Evaluation of biochemical targets of genistein in tumor cells. J Nutr, 1995, 125: 784s~789s.
[11]Kulig E, Jin L, Qian X et al. Apoptosis in nontumorous and neoplastic human pituitaries: expression of the Bcl-2 family of proteins. Am J Pathol， 1999, 154 (3): 767~774., 百拇医药
关键词：genistein；垂体；增殖；凋亡；酪氨酸蛋白激酶抑制剂
摘要：应用细胞培养、 ~3H-TdR掺入、 流式细胞和电镜技术, 观察酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制剂genistein对正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT-20增殖的影响, 并探讨其可能的机制。结果显示: genistein作用48 h后可明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT-20增殖。流式细胞仪检测发现, 50 和100 μmol/L genistein可将AtT-20细胞阻断于G0/G1期及G2/M期, 并出现凋亡峰, 凋亡率分别达19.9%和36.4%。电镜照片显示有凋亡细胞。结果表明, PTK抑制剂可以明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和垂体瘤细胞株AtT-20的增殖, 并诱导细胞凋亡, 说明PTK活性对细胞增殖和分化有重要作用。
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酪氨酸蛋白激酶(PTK)是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质, 能催化蛋白质的酪氨酸残基发生磷酸化反应, 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是细胞信号传递的关键变化[1]。PTK通过激活信号转导系统, 调控基因表达、细胞生长和增殖, 影响细胞功能。现在确信PTK与细胞增殖和存活有关。在数种肿瘤中, 如乳腺癌、鳞状细胞癌和胶质瘤, PTK活性升高[2]。许多生长因子和细胞因子通过激活PTK促进细胞增殖。大多数生长因子受体具有酪氨酸激酶结构域, 能与细胞内酪氨酸激酶耦联, 进一步激活一系列下游丝氨酸/苏氨酸激酶。如果剥夺生长因子或细胞因子, 可导致细胞生长停止或凋亡[3]。
垂体腺瘤的病因尚未完全弄清, 研究集中在两方面: 一是异常的生理调节, 二是癌基因的激活或抑癌基因的丧失。越来越多的证据表明, 垂体腺瘤的发生与细胞内信号转导机制异常有关[4], 垂体瘤分泌的一些生长因子如表皮生长因子(EGF)、人成纤维生长因子(hFGF)能通过激活酪氨酸激酶促进垂体1期张庆红等: Genistein对大鼠垂体前叶细胞增殖的抑制作用生理学报 Acta Physiol. Sin. 53卷细胞增殖[5]。
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文献报道, 酪氨酸激酶抑制剂genistein可抑制人垂体瘤细胞增殖[2], 但机制不明。最近的研究表明, PTK在细胞增殖和凋亡中扮演双重角色[3]。Genistein对正常大鼠垂体前叶细胞和AtT-20细胞株增殖的作用以及对其凋亡的研究未见报道。本实验观察了genistein对小鼠垂体瘤细胞株AtT-20和大鼠垂体前叶细胞增殖和凋亡的影响, 以阐明PTK与垂体肿瘤的关系。
1材料和方法
1.1大鼠垂体前叶细胞原代培养雌性SD大鼠(150~200 g), 戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg, ip), 用无菌注射器从左心室向主动脉方向灌注无菌生理盐水20 ml, 冲净垂体中的血细胞。将大鼠浸于70%酒精中10 min。暴露垂体, 收集垂体前叶于小瓶中剪碎, 用0.25%的胰酶和1% DNA酶1∶1消化2次, 每次10~15 min。用含血清的培养液终止胰酶作用, 1?000 g离心10 min, 弃上清, 将细胞重悬于含10%小牛血清的D/F12培养基中(4~5×108/L), 以100 μl/孔加在96孔板内, 置于5% CO2孵箱孵育。第2天换液, 第4天用无血清培养液洗2遍, 加含添加剂的无血清培养液(添加剂包括30 nmol/L硒酸钠、0.6 g/L谷胺酰胺、5 mg/L胰岛素、10 mg/L转铁蛋白、100 μmol/L腐胺、5 g/L葡萄糖、1 g/L牛血清白蛋白、青链霉素、10 mmol/L HEPES), 第6天加药至所需浓度。小鼠AtT-20是一种分泌ACTH的垂体腺瘤细胞株, 培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中(Gibco), 在5% CO2孵箱孵育, 细胞按1×108/L比例接种。
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1.2用3H-TdR掺入法测细胞增殖药物作用48 h后, 吸去培养液, 每孔加不含添加剂的培养液100 μl和含37 kBq ~3H-TdR溶液(上海原子核研究所), 37℃孵育4~6 h后加入0.25%胰酶-2%EDTA溶液20 μl, 20 min后用细胞收集器收集到玻璃纤维纸上, 用液闪记数器(LS-6500, 美国Beckman)进行掺入量测定, 结果以cpm表示。实验数据均以mean±SD表示, 组间用Origin 5.0软件中单因素方差分析进行统计学处理。
1.3流式细胞仪测定将AtT-20接种于70 mm2的培养瓶中, 待细胞达到80%的密度时, 加药作用48 h, 收集细胞。用0.01 mol/L的PBS洗2遍, 离心, 去上清。将3~5ⅹ106细胞用70%乙醇固定, 离心收集细胞, 碘化丙锭染色, 用流式细胞仪(美国Coulter 公司Elite ESP型)测定各细胞周期DNA含量。
1.4透射电镜样品制备细胞离心成团, 用4%戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制, pH 7.4)前固定4~8 h, 1%四氧化锇后固定2 h, 用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗, 丙酮梯度脱水, Epon 812包埋, 65℃烤箱聚合24 h, LKB Nova型超薄切片机制备超薄切片(70 nm), 醋酸双氧钠和枸橼酸铅双染, 并用JEM-2000EX透射电镜观察。
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2结果
2.1Genistein对细胞形态的影响
正常大鼠垂体前叶细胞体积变小, 显示不规则的轮廓, 细胞核固缩、破裂, 细胞易从培养板表面脱落。AtT-20垂体腺瘤细胞变圆, 少数从培养瓶表面脱落, 飘浮在培养基中。
2.2Genistein对细胞增殖的抑制效应
Genistein能明显抑制正常大鼠垂体前叶细胞和AtT-20细胞生长, 并呈剂量依赖性。
2.3Genistein对细胞周期的影响
Genistein处理的AtT-20细胞在G0/G1期前出现凋亡峰, 凋亡率达19.9%和36.4%。
2.4电镜结果
, 百拇医药
除正常形态细胞外, 多为具有凋亡特征的细胞。早期, 细胞核染色质增粗, 并沿核膜不均匀边聚积, 随着染色质积聚的增多呈新月状; 后期, 细胞核分裂成多个核碎片, 细胞膜发泡后与主细胞脱离, 形成凋亡小体, 凋亡小体内可见细胞器。
3讨论
Genistein是大豆的主要成分, 流行病学研究表明, 乳腺癌和其他癌症的发生率与饮食中大豆的摄入量成反比[6]。Genistein可抑制鳞状细胞癌和肺癌等细胞的增殖, 并诱导其凋亡[7,8]。Genistein抑制癌症的作用机制仍不清楚, 可能与雌激素受体调控有关[8]。Genistein也是一种PTK的强效广谱抑制剂, 在体内可能通过抑制PTK活性而产生抗肿瘤作用[9]。
本实验表明, Genistein可抑制培养的大鼠垂体前叶细胞的3H-TdR掺入值。Genistein对正常垂体前叶细胞的抑制效应不同于对肿瘤细胞的作用, 对正常大鼠垂体前叶细胞的增殖产生抑制作用的最低剂量要高于AtT-20细胞。这可能是因为在肿瘤细胞, 对 genistein 敏感的靶蛋白被细胞转化过程中所发生的特殊生化事件所掩盖。正常细胞中, 生长因子作用于细胞膜, 激活细胞内PTK, 进而激活细胞内对细胞生长和增殖至关重要的某一蛋白。Genistein只要能抑制PTK活性, 就能有效地抑制该蛋白的作用, 因此, genistein在低浓度就能抑制细胞生长。但是肿瘤细胞常有异常的转化特性, 细胞内PTK分子会发生突变, 同样浓度的 genistein 不能抑制PTK活性, 从而不能抑制该蛋白的磷酸化, 因此也就不能抑制肿瘤细胞的生长。但提高genistein浓度可抑制肿瘤细胞中的另一个靶蛋白, 这样在较高浓度时genistein也能抑制肿瘤细胞生长[10]。
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凋亡是细胞自身破坏的一种基因水平的程序过程, 是细胞内在的决定动物发育和组织平衡的一个重要机制, 如果这个受到严密调控的细胞自杀机制发生功能障碍或失去控制, 将导致肿瘤、神经退行性疾病或其他的病理性变化[3] 。对垂体来说, 紫外线照射与电离辐射、 使用抗癌药物的哺乳后期妇女、 生长因子缺乏以及过度表达某些基因, 均可诱导细胞凋亡[11]。
本文首次发现, genistein可诱导AtT-20细胞发生凋亡, 提示genistein对垂体肿瘤的抑制作用可能是通过诱导凋亡而实现的。Genistein作为酪氨酸激酶的抑制剂, 能有效抑制垂体细胞增殖并诱导其凋亡, 表明酪氨酸激酶活性是垂体肿瘤生长所必须的。酪氨酸激酶调控细胞生长中的机制非常复杂, 它同时又受垂体细胞分泌的生长因子和激素调节。我们的发现为研究酪氨酸激酶对垂体肿瘤细胞的作用提供了一条依据。
参考文献
[1]马晶. 非受体型酪氨酸蛋白激酶与免疫细胞的信号传递. 国外医学免疫分册.1998, 21 (3): 113~116.
, http://www.100md.com
[2]Jones JH, Justice SK, Price A.Suppression of tyrosine kinase activity inhibits ~3H-thymidine uptake in cultured human pituitary tumor cells. J Clin Endocrinol Metab, 1997, 82 (7): 2143~2147.
[3]叶鑫生, 沈倍奋, 汤锡芳等主编。细胞调控探索. 北京: 军事医学科学出版社, 1999, 12~15。
[4]Zhang ZH (张作洪), Bai XJ (白祥军), Lei T (雷 霆) et al. The pituitary adenoma and the abnormity of the cellular signaling mechanism. Chin J Exp Surg (中华实验外科杂志), 1999, 16 (2): 190 ~191 (Chinese, English abstract).
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[5]Oomizu S, Takeuchi S, Takahashi S. Stimulatory effect of insulin-like growth factor I on proliferation of mouse pituitary cells in serum-free culture. J Endocrinol, 1998, 157 (1): 53~62.
[6]Wiseman H. Role of dietary phyto-oestrogens in the protection against cancer and heart disease. Biochem Biophysy Res Commun, 1996, 253 (24): 795~800.
[7]Alhasan SA, Pietrasczkiwicz H, Alonso MD et al. Genistein-induced cell cycle arrest and apoptosis in a head and neck squamous cell carcinoma cell line. Nutr Cancer, 1999, 34 (1): 12~19.
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[8]Schwartz JA, Liu G, Brooks SC.Genistein-mediated attenuation of tamoxifen-induced antagonism from estrogen receptor-regulated genes. Biochem Biophys Res Commun， 1998, 253 (1): 38~43.
[9]Lian F, Li Y, Bhuiyan M et al. p53-independent apoptosis induced by genistein in lung cancer cells. Nutr Cancer， 1999, 33 (2): 125~131.
[10]Peterson G.Evaluation of biochemical targets of genistein in tumor cells. J Nutr, 1995, 125: 784s~789s.
[11]Kulig E, Jin L, Qian X et al. Apoptosis in nontumorous and neoplastic human pituitaries: expression of the Bcl-2 family of proteins. Am J Pathol， 1999, 154 (3): 767~774., 百拇医药