低氧对CD34+造血干/祖细胞增殖分化及其对细胞因子依赖性的影响
军事医学科学院输血研究所； 国家生物医学分析中心； 北京 100850 孙兵；白慈贤；冯凯；李梁；赵鹏；裴雪涛
关键词：低氧；CD34+细胞；单个核细胞；BFU-
摘要：采用免疫磁珠法分离脐血CD34+造血干/祖细胞, 进行低氧和常氧条件下单个核细胞(MNC)及CD34+细胞的半固体及液体培养, 计细胞总数和集落产率, 并通过流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期, 以探讨造血干/祖细胞在低氧环境下增殖分化性能的改变及其对细胞因子反应性的变化。结果显示: CD34+细胞在低氧条件下生成的BFU-E集落数(324.8±41.4/104细胞)明显增多(对照为191.2±34.5/104细胞, P<0.01); 在无细胞因子存在的液体培养体系中, 低氧组的BFU-E产率(152.4±22.6/104细胞)明显高于常氧组(74.2±9.3/104细胞, P<0.01); 低氧培养细胞中CD34+细胞的比例高于对照2.5±1.2倍(P<0.05)。但MNC生成的BFU-E在常氧和低氧条件下无显著差异。这些结果表明: 体外低氧环境能显著增加CD34+造血干/祖细胞形成红系祖细胞的产率, 且使其对细胞因子的依赖性降低, 并对早期红系祖细胞的维持有增强作用, 但对粒系祖细胞的增殖则有抑制作用。
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在高原居住的居民都伴有真性红细胞增多, 这是由于低氧刺激机体, 通过神经内分泌调节, 继发红细胞生成素(EPO)增多, 从而刺激骨髓产生大量红细胞所致。然而低氧是如何作用于造血干/祖细胞, 以及对其增殖分化的调控过程等尚不清楚。为进一步探讨低氧对造血细胞增殖分化的影响, 我们应用体外低氧细胞培养模型, 观察造血细胞在低氧条件下细胞数量、 集落形成能力、 表面标志及细胞周期等的变化, 从而探讨低氧对造血细胞增殖分化的影响及其可能的调控机制。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂 MiniMACS磁性分离仪(Miltenyi Biotec, Germany); 流式细胞仪(FACScan, BD,USA); 血样: 脐血采自解放军总医院(20 U/ml肝素抗凝); 培养基: DMEM (GIBCO, USA)、 IMDM (GIBCO, USA); 细胞因子: GM-CSF(Glaxo)、 IL-3(Promega); SCF(Sandos); EPO(Boehringer)。CD34+细胞MACS磁性分离试剂盒及CD34单抗QBEND/10 (Miltenyi Biotec); 羊抗鼠PE荧光素标记二抗和FITC标记鼠抗人HPCA-2 (CD34)单抗(BD)。
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1.2 脐血单个核细胞及CD34+细胞的分离纯化 采用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统(MiniMACS)进行分离[1]。脐血经Ficoll分离液(相对比重为1.077)分出单个核细胞(MNC), 然后标记细胞(抗CD34抗体为QBEND/10, 磁珠为直径50 nm的羊抗鼠IgG1免疫磁珠)。标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时, CD34+细胞被洗脱除去, 将分离柱移出磁场, 加压洗脱, 收集组分为CD34+细胞, 流式细胞仪检测其纯度, 标记抗体为FITC结合的鼠抗人HPCA-2(CD34)单抗。
1.3 细胞因子及低氧环境 细胞生长因子终浓度为: SCF 50 ng/ml、 IL-3 20 ng/ml、 EPO 2 U/ml、 GM-CSF 40 ng/ml; 低氧模型为一有进出气孔的小室, 置于37℃恒温箱内, 持续通入94% N2∶5% CO2∶1% O2的混合气体(北京氦普北分气体公司), 维持饱和湿度, 常氧对照置于37℃、 5% CO2空气和饱和湿度的培养箱中。
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1.4 细胞培养 半固体培养: 以MNC 105/ml、 CD34+细胞104/ml及上述细胞因子加入半固体培养基中, 培养基含IMDM培养液、 体积分数为20%的FCS、 质量分数为10%的BSA (Sigma)和1.35%的甲基纤维素, 接种于12孔板, 每孔1 ml, 平行3孔, 培养14 d后计数细胞集落(CFU-GM、 BFU-E和CFU-GEMM)。 液体培养: 以MNC 106/ml、 CD34+细胞105/ml接种于12孔板, 每孔2 ml。培养液IMDM含体积分数为12.5%的HS、 12.5%的FCS、 5×10-7 mol/L氢化可的松, 细胞因子有或无对照, 分置于低氧及常氧下培养。分别于第24、 48小时和第7天洗涤、 计数、 收集细胞。对培养7 d的细胞再进行常氧下的造血祖细胞检测, 其余细胞固定进行流式细胞仪分析。
1.5 流式细胞仪检测CD34抗原表达和细胞周期
CD34抗原采用直接标记法, FITC标记的CD34单克隆抗体以1∶10稀释, 细胞在4℃标记30 min, 洗涤两次, 重新悬浮后用流式细胞仪检测。70%乙醇固定细胞(>1×106个), 经离心去除固定液后, 加200 μl浓度为1 mg/ml的RNA酶A (RnaseA) 37℃处理30 min, 再以800 μl浓度为0.1 mg/ml的碘化丙啶(PI)4℃避光染色30 min, 上机检测细胞周期的变化。
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1.6 实验数据的统计学处理 实验结果以均数±标准差(x±s)表示, 统计学处理按配对t检验和X2检验进行。
2 结果
2.1 低氧对半固体培养条件下造血祖细胞生长的影响
体外培养14 d时, 含3个以上细胞簇, 细胞数在100以上, 并含桔红色血红蛋白的为红系祖细胞BFU-E; 细胞数在40以上, 由粒细胞和巨噬细胞组成的集落为粒/巨噬系祖细胞CFU-GM; 混合集落(CFU-GEMM)则由粒细胞、 巨噬细胞、 巨核细胞和有核红细胞共同组成, 属更早期的造血祖细胞。在上述培养体系中, MNC培养结果见图1, 低氧条件下CFU-GM数量(51.2±6.5/105 MNC)显著减少(常氧组为89.6±11.4/105 MNC, P<0.05), 而BFU-E则无明显差异, 两组的集落产率分别为188.4±21.3/105 MNC和165.3±18.5/105 MNC (P>0.05)。CD34+细胞培养的结果见图2, 各系祖细胞集落产率均有明显增加, 低氧组BFU-E产率(324.8±29.7/104 CD34+细胞)比对照组(191.5±22.4/104 CD34+细胞)显著增多(P<0.01), CFU-GM产率(101.3±9.2/104 CD34+细胞)则明显减少(对照组为220.4±19.5/104 CD34+细胞, P<0.01)。混合集落产率无显著差异。
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2.2 低氧对液体培养条件下造血祖细胞的维持和分化的影响
培养体系中无造血生长因子时, MNC在低氧条件下培养7 d后的细胞总数与对照组相似, 两者均降低为接种细胞数的30%～40%, 无明显差异; 当造血生长因子存在时, 对照组细胞总数为接种细胞的(110.5±10.2)%, 低氧组则下降为(50.8±6.6)%, 两者存在显著差异(P<0.01)。CD34+细胞在无造血生长因子时, 低氧组与对照组的细胞总数均降低为接种细胞数的40%～60%, 无显著差异(P>0.05); 当造血生长因子存在时, 两组的细胞总数均显著增加(扩增12.4～15.3倍), 两者间也无明显差异(P>0.05), 见表1。
表1. 低氧对MNC和CD34+细胞增殖的影响
Table 1. Effect of hypoxia on total cells in liquid culture of MNC and CD34+ cells (n=4)
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MNC (105/ml)
CD34+ cells (105/ml)
GF(-)
GF(+)
GF(-)
GF(+)
Hypoxia 1%O2
3.2±0.7
5.1±0.6
0.5±0.05
6.2±0.8
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Control
3.4±0.8
11±0.4
0.45±0.04
6.9±0.7
GF: growth factors.
将液体培养的细胞再行半固体培养, 其造血集落的产率见图3。在无造血生长因子存在的条件下, 低氧组BFU-E的产率(16.6±2.1/103细胞)显著高于对照组(8.1±1.4/103细胞, P<0.01); 而造血生长因子存在时, 低氧组BFU-E的产率(20.3±3.4/103细胞)则低于对照组(33.5±5.7/103细胞, P<0.05)。可见: 有无造血生长因子对低氧组BFU-E的产率无明显影响, 两者都接近于液体培养前的BFU-E产率; 但有无造血生长因子对常氧组的BFU-E产率则有十分明显的影响, 加生长因子组的产率远远高于无生长因子组。
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2.3 低氧对培养细胞CD34抗原表达及细胞周期的影响
在造血生长因子存在的条件下, 对培养7 d的细胞进行CD34抗原表达的检测, 结果显示, 在低氧条件下, 培养细胞CD34抗原表达阳性的比例(25.7±3.8)%显著高于对照(9.1±2.3)%(P<0.01)。细胞周期的流式细胞仪分析表明, 两组的S期细胞数所占比例分别为(32.0±4.1)%(低氧组)和(36.9±4.5)%(对照组), 无显著差异。
3 讨论
脐血含有丰富的造血干/祖细胞, 借助于体外细胞培养技术, 可以用来作为低氧对造血干/祖细胞增殖与分化调控的研究。在国外的一些报告中, 应用3%～7%的低氧环境进行造血细胞的体外培养, 发现这些中度的低氧环境均能增加各系祖细胞的产率, 且不影响它们的分化与成熟。这可能是因为其氧浓度接近于体内造血环境的氧含量, 比在常氧条件下的培养体系能减少氧自由基的形成或增加细胞因子的生成[2,3]。因此, 这些培养模型不能反映低氧对造血调控的真正影响。本实验则应用1%的低氧环境, 结合细胞因子的有无及较为成熟的MNC群体和纯化的CD34+造血干/祖细胞进行比较研究, 观察到低氧能显著增加CD34+细胞产生BFU-E的数量, 且在液体培养体系中更有益于BFU-E的维持, 并减缓其向晚期红系祖细胞的分化和成熟。此外, 低氧环境可减少粒系祖细胞(CFU-GM)的生成, 更利于红系造血。然而, 利用单个核细胞的培养则无法检测出这些差异, 说明在MNC水平难以反映低氧对造血细胞增殖分化的影响, 而在纯化的造血干/祖细胞水平则能反映出这些影响。因此, CD34+细胞的增殖分化是研究低氧对造血影响较为确切的指标。
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造血生长因子是造血细胞生存和增殖分化的重要条件, 在无生长因子作用时, 无论是低氧还是常氧, MNC细胞和CD34+细胞经7 d培养后, 其细胞总数均显著降低, 这可能与细胞因子缺乏而导致细胞过多凋亡有关[4]。而在有造血生长因子存在时, 低氧培养的MNC细胞总数显著低于对照, 这是由于MNC中含有较多的终末分化细胞, 它们耐受低氧的能力较低, 从而出现细胞过多死亡。氧依赖产生的红系集落同时也是生长因子依赖性的, CD34+细胞在低氧条件下培养的细胞经再培养产生的BFU-E , 无论有无细胞因子均能保持比较稳定的数量, 且接近于未培养细胞所产生的BFU-E。说明低氧不仅能维持BFU-E的存活, 而且能促使红系祖细胞对细胞因子的依赖性较常氧状态下明显降低[5], 但CFU-GM在低氧条件下, 无论有无因子存在均明显降低。实验提示低氧环境对红系祖细胞的维持和细胞因子低依赖性的作用较为特异, 对粒系造血则无此影响。
低氧对红系分化的影响可通过测定细胞表面抗原CD34和CD36来判断。CD34+细胞包括造血干细胞和早期造血祖细胞, 而晚期红系祖细胞和幼稚红细胞则表达CD36[6]。我们的实验结果和细胞表型分析表明, 低氧扩增的红系祖细胞更多地表达CD34, 即CD34+的早期红系祖细胞(BFU-E), 且低氧能减缓它们向晚期红系祖细胞的分化和成熟, 但经过常氧再培养后, 这些祖细胞同样也具有向成熟红系分化的能力。而常氧条件下扩增的细胞更多的是较成熟的BFU-E, 它们更接近于晚期红系祖细胞(CFU-E)[7]。细胞周期检测则显示处于S期的细胞比例无明显变化, 这提示较长时间缺氧或低氧适应后的红细胞持续增多并非由于进入增殖期的细胞增加所致, 而可能是由于低氧诱使造血系统增生活跃, 且干细胞向红系分化增多, 使造血细胞(尤其是红细胞)的绝对数量(基数)增加所致, 而比例则无明显变化。
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体内造血过程是一个非常复杂而周密的调节系统, 低氧所致造血细胞增殖、 分化和凋亡的改变是由一系列细胞内信号转导、 各种生物化学反应及相关基因表达改变的综合结果。大量的研究结果表明, 低氧对红细胞的生成可能发挥着双重的调控机制, 一方面通过维持和扩增早期红系祖细胞, 并减缓其向终末细胞的分化和成熟; 另一方面低氧又可促使红细胞生成素分泌增多, 促进CFU-E进一步分化成熟, 最终使红细胞增多及供氧能力增强, 从而表明低氧对红细胞生成的调节是一个正性的刺激作用。
Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39730190)
Corresponding author. Tel: 010-66932240; Fax: 010-68214653; E-mail: peixt@nic.bmi.ac.cn
, 百拇医药 孙兵(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
白慈贤(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
冯凯(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
李梁(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
赵鹏(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
裴雪涛(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
参 考 文 献
[1] Pei XT (裴雪涛), Wang LS (王立生), Xu L (徐 黎) et al. Studies on the committed differentiation of CD34+ hematopoietic progenitor cells. Chin J Hematol (中华血液学杂志), 1998, 19: 289～293 (in Chinese with English abstract).
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[2] Smith S, Broxmeyer HE. The influence of oxygen tension on the long-term growth in vitro of hematopoietic progenitor cells from human cord blood. Br J Haematol, 1986, 63: 29～33.
[3] Koller MR, Bender JG, Papoutsakis ET et al. Effects of synergistic cytokine combination, low oxygen, and irradiated stroma on the expansion of human cord blood progenitors. Blood, 1992, 80: 403～409.
[4] Beitner-Johnson D, Shull GE, Dedman JR et al. Regulation of gene expression by hypoxia: A molecular approach. Respir Physiol, 1997, 110: 87～97.
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[5] Schibler KR, Li Y, Ohls RK et al. Possible mechanisms accounting for the growth factor independence of hematopoietic progenitors from umbilical cord blood. Blood, 1994, 84: 3679～3684.
[6] De Wolf JTM, Muller EW, Hendriks DH et al. Mast cell growth factor modulates CD36 antigen expression on eythroid progenitors from human bone marrow and peripheral blood associated with ongoing differentiation. Blood, 1994, 84: 59～64.
[7] Cipolleschi MG, D′Ippolito G, Bernabei PA et al. Severe hypoxia enhances the formation of erythroid bursts human cord blood cells and the maintenance of BFU-E in vitro. Exp Hematol, 1997, 25: 1187～1194.
Received 1999-07-29 Revised 1999-09-03, 百拇医药
关键词：低氧；CD34+细胞；单个核细胞；BFU-
摘要：采用免疫磁珠法分离脐血CD34+造血干/祖细胞, 进行低氧和常氧条件下单个核细胞(MNC)及CD34+细胞的半固体及液体培养, 计细胞总数和集落产率, 并通过流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期, 以探讨造血干/祖细胞在低氧环境下增殖分化性能的改变及其对细胞因子反应性的变化。结果显示: CD34+细胞在低氧条件下生成的BFU-E集落数(324.8±41.4/104细胞)明显增多(对照为191.2±34.5/104细胞, P<0.01); 在无细胞因子存在的液体培养体系中, 低氧组的BFU-E产率(152.4±22.6/104细胞)明显高于常氧组(74.2±9.3/104细胞, P<0.01); 低氧培养细胞中CD34+细胞的比例高于对照2.5±1.2倍(P<0.05)。但MNC生成的BFU-E在常氧和低氧条件下无显著差异。这些结果表明: 体外低氧环境能显著增加CD34+造血干/祖细胞形成红系祖细胞的产率, 且使其对细胞因子的依赖性降低, 并对早期红系祖细胞的维持有增强作用, 但对粒系祖细胞的增殖则有抑制作用。
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在高原居住的居民都伴有真性红细胞增多, 这是由于低氧刺激机体, 通过神经内分泌调节, 继发红细胞生成素(EPO)增多, 从而刺激骨髓产生大量红细胞所致。然而低氧是如何作用于造血干/祖细胞, 以及对其增殖分化的调控过程等尚不清楚。为进一步探讨低氧对造血细胞增殖分化的影响, 我们应用体外低氧细胞培养模型, 观察造血细胞在低氧条件下细胞数量、 集落形成能力、 表面标志及细胞周期等的变化, 从而探讨低氧对造血细胞增殖分化的影响及其可能的调控机制。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂 MiniMACS磁性分离仪(Miltenyi Biotec, Germany); 流式细胞仪(FACScan, BD,USA); 血样: 脐血采自解放军总医院(20 U/ml肝素抗凝); 培养基: DMEM (GIBCO, USA)、 IMDM (GIBCO, USA); 细胞因子: GM-CSF(Glaxo)、 IL-3(Promega); SCF(Sandos); EPO(Boehringer)。CD34+细胞MACS磁性分离试剂盒及CD34单抗QBEND/10 (Miltenyi Biotec); 羊抗鼠PE荧光素标记二抗和FITC标记鼠抗人HPCA-2 (CD34)单抗(BD)。
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1.2 脐血单个核细胞及CD34+细胞的分离纯化 采用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统(MiniMACS)进行分离[1]。脐血经Ficoll分离液(相对比重为1.077)分出单个核细胞(MNC), 然后标记细胞(抗CD34抗体为QBEND/10, 磁珠为直径50 nm的羊抗鼠IgG1免疫磁珠)。标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时, CD34+细胞被洗脱除去, 将分离柱移出磁场, 加压洗脱, 收集组分为CD34+细胞, 流式细胞仪检测其纯度, 标记抗体为FITC结合的鼠抗人HPCA-2(CD34)单抗。
1.3 细胞因子及低氧环境 细胞生长因子终浓度为: SCF 50 ng/ml、 IL-3 20 ng/ml、 EPO 2 U/ml、 GM-CSF 40 ng/ml; 低氧模型为一有进出气孔的小室, 置于37℃恒温箱内, 持续通入94% N2∶5% CO2∶1% O2的混合气体(北京氦普北分气体公司), 维持饱和湿度, 常氧对照置于37℃、 5% CO2空气和饱和湿度的培养箱中。
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1.4 细胞培养 半固体培养: 以MNC 105/ml、 CD34+细胞104/ml及上述细胞因子加入半固体培养基中, 培养基含IMDM培养液、 体积分数为20%的FCS、 质量分数为10%的BSA (Sigma)和1.35%的甲基纤维素, 接种于12孔板, 每孔1 ml, 平行3孔, 培养14 d后计数细胞集落(CFU-GM、 BFU-E和CFU-GEMM)。 液体培养: 以MNC 106/ml、 CD34+细胞105/ml接种于12孔板, 每孔2 ml。培养液IMDM含体积分数为12.5%的HS、 12.5%的FCS、 5×10-7 mol/L氢化可的松, 细胞因子有或无对照, 分置于低氧及常氧下培养。分别于第24、 48小时和第7天洗涤、 计数、 收集细胞。对培养7 d的细胞再进行常氧下的造血祖细胞检测, 其余细胞固定进行流式细胞仪分析。
1.5 流式细胞仪检测CD34抗原表达和细胞周期
CD34抗原采用直接标记法, FITC标记的CD34单克隆抗体以1∶10稀释, 细胞在4℃标记30 min, 洗涤两次, 重新悬浮后用流式细胞仪检测。70%乙醇固定细胞(>1×106个), 经离心去除固定液后, 加200 μl浓度为1 mg/ml的RNA酶A (RnaseA) 37℃处理30 min, 再以800 μl浓度为0.1 mg/ml的碘化丙啶(PI)4℃避光染色30 min, 上机检测细胞周期的变化。
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1.6 实验数据的统计学处理 实验结果以均数±标准差(x±s)表示, 统计学处理按配对t检验和X2检验进行。
2 结果
2.1 低氧对半固体培养条件下造血祖细胞生长的影响
体外培养14 d时, 含3个以上细胞簇, 细胞数在100以上, 并含桔红色血红蛋白的为红系祖细胞BFU-E; 细胞数在40以上, 由粒细胞和巨噬细胞组成的集落为粒/巨噬系祖细胞CFU-GM; 混合集落(CFU-GEMM)则由粒细胞、 巨噬细胞、 巨核细胞和有核红细胞共同组成, 属更早期的造血祖细胞。在上述培养体系中, MNC培养结果见图1, 低氧条件下CFU-GM数量(51.2±6.5/105 MNC)显著减少(常氧组为89.6±11.4/105 MNC, P<0.05), 而BFU-E则无明显差异, 两组的集落产率分别为188.4±21.3/105 MNC和165.3±18.5/105 MNC (P>0.05)。CD34+细胞培养的结果见图2, 各系祖细胞集落产率均有明显增加, 低氧组BFU-E产率(324.8±29.7/104 CD34+细胞)比对照组(191.5±22.4/104 CD34+细胞)显著增多(P<0.01), CFU-GM产率(101.3±9.2/104 CD34+细胞)则明显减少(对照组为220.4±19.5/104 CD34+细胞, P<0.01)。混合集落产率无显著差异。
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2.2 低氧对液体培养条件下造血祖细胞的维持和分化的影响
培养体系中无造血生长因子时, MNC在低氧条件下培养7 d后的细胞总数与对照组相似, 两者均降低为接种细胞数的30%～40%, 无明显差异; 当造血生长因子存在时, 对照组细胞总数为接种细胞的(110.5±10.2)%, 低氧组则下降为(50.8±6.6)%, 两者存在显著差异(P<0.01)。CD34+细胞在无造血生长因子时, 低氧组与对照组的细胞总数均降低为接种细胞数的40%～60%, 无显著差异(P>0.05); 当造血生长因子存在时, 两组的细胞总数均显著增加(扩增12.4～15.3倍), 两者间也无明显差异(P>0.05), 见表1。
表1. 低氧对MNC和CD34+细胞增殖的影响
Table 1. Effect of hypoxia on total cells in liquid culture of MNC and CD34+ cells (n=4)
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MNC (105/ml)
CD34+ cells (105/ml)
GF(-)
GF(+)
GF(-)
GF(+)
Hypoxia 1%O2
3.2±0.7
5.1±0.6
0.5±0.05
6.2±0.8
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Control
3.4±0.8
11±0.4
0.45±0.04
6.9±0.7
GF: growth factors.
将液体培养的细胞再行半固体培养, 其造血集落的产率见图3。在无造血生长因子存在的条件下, 低氧组BFU-E的产率(16.6±2.1/103细胞)显著高于对照组(8.1±1.4/103细胞, P<0.01); 而造血生长因子存在时, 低氧组BFU-E的产率(20.3±3.4/103细胞)则低于对照组(33.5±5.7/103细胞, P<0.05)。可见: 有无造血生长因子对低氧组BFU-E的产率无明显影响, 两者都接近于液体培养前的BFU-E产率; 但有无造血生长因子对常氧组的BFU-E产率则有十分明显的影响, 加生长因子组的产率远远高于无生长因子组。
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2.3 低氧对培养细胞CD34抗原表达及细胞周期的影响
在造血生长因子存在的条件下, 对培养7 d的细胞进行CD34抗原表达的检测, 结果显示, 在低氧条件下, 培养细胞CD34抗原表达阳性的比例(25.7±3.8)%显著高于对照(9.1±2.3)%(P<0.01)。细胞周期的流式细胞仪分析表明, 两组的S期细胞数所占比例分别为(32.0±4.1)%(低氧组)和(36.9±4.5)%(对照组), 无显著差异。
3 讨论
脐血含有丰富的造血干/祖细胞, 借助于体外细胞培养技术, 可以用来作为低氧对造血干/祖细胞增殖与分化调控的研究。在国外的一些报告中, 应用3%～7%的低氧环境进行造血细胞的体外培养, 发现这些中度的低氧环境均能增加各系祖细胞的产率, 且不影响它们的分化与成熟。这可能是因为其氧浓度接近于体内造血环境的氧含量, 比在常氧条件下的培养体系能减少氧自由基的形成或增加细胞因子的生成[2,3]。因此, 这些培养模型不能反映低氧对造血调控的真正影响。本实验则应用1%的低氧环境, 结合细胞因子的有无及较为成熟的MNC群体和纯化的CD34+造血干/祖细胞进行比较研究, 观察到低氧能显著增加CD34+细胞产生BFU-E的数量, 且在液体培养体系中更有益于BFU-E的维持, 并减缓其向晚期红系祖细胞的分化和成熟。此外, 低氧环境可减少粒系祖细胞(CFU-GM)的生成, 更利于红系造血。然而, 利用单个核细胞的培养则无法检测出这些差异, 说明在MNC水平难以反映低氧对造血细胞增殖分化的影响, 而在纯化的造血干/祖细胞水平则能反映出这些影响。因此, CD34+细胞的增殖分化是研究低氧对造血影响较为确切的指标。
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造血生长因子是造血细胞生存和增殖分化的重要条件, 在无生长因子作用时, 无论是低氧还是常氧, MNC细胞和CD34+细胞经7 d培养后, 其细胞总数均显著降低, 这可能与细胞因子缺乏而导致细胞过多凋亡有关[4]。而在有造血生长因子存在时, 低氧培养的MNC细胞总数显著低于对照, 这是由于MNC中含有较多的终末分化细胞, 它们耐受低氧的能力较低, 从而出现细胞过多死亡。氧依赖产生的红系集落同时也是生长因子依赖性的, CD34+细胞在低氧条件下培养的细胞经再培养产生的BFU-E , 无论有无细胞因子均能保持比较稳定的数量, 且接近于未培养细胞所产生的BFU-E。说明低氧不仅能维持BFU-E的存活, 而且能促使红系祖细胞对细胞因子的依赖性较常氧状态下明显降低[5], 但CFU-GM在低氧条件下, 无论有无因子存在均明显降低。实验提示低氧环境对红系祖细胞的维持和细胞因子低依赖性的作用较为特异, 对粒系造血则无此影响。
低氧对红系分化的影响可通过测定细胞表面抗原CD34和CD36来判断。CD34+细胞包括造血干细胞和早期造血祖细胞, 而晚期红系祖细胞和幼稚红细胞则表达CD36[6]。我们的实验结果和细胞表型分析表明, 低氧扩增的红系祖细胞更多地表达CD34, 即CD34+的早期红系祖细胞(BFU-E), 且低氧能减缓它们向晚期红系祖细胞的分化和成熟, 但经过常氧再培养后, 这些祖细胞同样也具有向成熟红系分化的能力。而常氧条件下扩增的细胞更多的是较成熟的BFU-E, 它们更接近于晚期红系祖细胞(CFU-E)[7]。细胞周期检测则显示处于S期的细胞比例无明显变化, 这提示较长时间缺氧或低氧适应后的红细胞持续增多并非由于进入增殖期的细胞增加所致, 而可能是由于低氧诱使造血系统增生活跃, 且干细胞向红系分化增多, 使造血细胞(尤其是红细胞)的绝对数量(基数)增加所致, 而比例则无明显变化。
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体内造血过程是一个非常复杂而周密的调节系统, 低氧所致造血细胞增殖、 分化和凋亡的改变是由一系列细胞内信号转导、 各种生物化学反应及相关基因表达改变的综合结果。大量的研究结果表明, 低氧对红细胞的生成可能发挥着双重的调控机制, 一方面通过维持和扩增早期红系祖细胞, 并减缓其向终末细胞的分化和成熟; 另一方面低氧又可促使红细胞生成素分泌增多, 促进CFU-E进一步分化成熟, 最终使红细胞增多及供氧能力增强, 从而表明低氧对红细胞生成的调节是一个正性的刺激作用。
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Corresponding author. Tel: 010-66932240; Fax: 010-68214653; E-mail: peixt@nic.bmi.ac.cn
, 百拇医药 孙兵(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
白慈贤(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
冯凯(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
李梁(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
赵鹏(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
裴雪涛(军事医学科学院输血研究所, 国家生物医学分析中心, 北京 100850)
参 考 文 献
[1] Pei XT (裴雪涛), Wang LS (王立生), Xu L (徐 黎) et al. Studies on the committed differentiation of CD34+ hematopoietic progenitor cells. Chin J Hematol (中华血液学杂志), 1998, 19: 289～293 (in Chinese with English abstract).
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[2] Smith S, Broxmeyer HE. The influence of oxygen tension on the long-term growth in vitro of hematopoietic progenitor cells from human cord blood. Br J Haematol, 1986, 63: 29～33.
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Received 1999-07-29 Revised 1999-09-03, 百拇医药