注射热损伤大鼠纹状体mRNA的爪蟾卵母细胞对多巴胺的反应
军事医学科学院基础医学研究所； 北京 100850；1中国人民解放军总医院老年医学研究所； 北京 100853 赵永岐**,张炳烈1,王鲁明,邢成,李敏,范明
关键词：热损伤；纹状体；多巴胺；受体；卵母细胞
摘要：Untitled Document将从正常大鼠和热损伤大鼠的中枢纹状体提取的poly(A)+ mRNA, 注入非洲爪蟾卵母细胞表达。用电生理方法检测多巴胺诱发的膜电位和电流的变化, 分析热损伤对中枢多巴胺受体表达的影响。结果表明, 注射大鼠纹状体mRNA后, 卵母细胞的静息电位与注射前没有变化, 但多巴胺能诱发膜电流。 经验证, 此受体电流的主要载流离子是Cl-。注射热损伤大鼠纹状体mRNA的卵母细胞对多巴胺反应的敏感性降低, 与正常大鼠组相比有显著性差异。因此可以断定, 热损伤对大鼠纹状体中多巴胺受体的基因表达产生了明显的影响, 并可能有离子通道的参与。
热环境的持续刺激引起机体的热损伤一直是病理生理学和环境医学研究的重要课题。近年来的研究表明, 中枢多巴胺受体(DAR)参与了体温调节的过程。为了研究热损伤发生时多巴胺受体结构和功能的改变, 需要考察热损伤引起的多巴胺受体基因水平、基因转录和翻译表达这一系列过程中是否有重要变化, 体外表达多巴胺受体是研究这一过程的有效方法。非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞已经被广泛应用于体外表达各种受体蛋白, 并能进一步分析离子通道的变化[1~3]。 因此本实验中采用了这一表达系统, 将从大鼠纹状体提取的poly(A)+ mRNA移植入卵母细胞表达, 观察表达后的电生理信号, 进行热损伤大鼠纹状体mRNA平行实验, 以期发现热损伤对受体表达的影响并探讨其原因。
, 百拇医药
1材料和方法
1.1 实验动物 成年健康Wistar雄性大鼠(180~220 g)。 雌性非洲爪蟾(2~3岁), 由中国科学院发育生物研究所提供。饲养在玻璃缸内, 水温保持在19~25℃, 每周喂猪肝2次并更换清水。
1.2 卵母细胞制备 冰浴麻醉爪蟾, 腹中线旁切1 cm, 切开约0.5 cm, 取一小叶卵巢组织置于改良巴氏盐溶液(MBS)中。以铂丝环分离单个卵母细胞, 挑选直径1.0~1.2 mm、动物极和植物极黑白界限分明、无斑点无杂纹的Ⅳ-Ⅴ期卵母细胞。 剥去卵黄膜, 用MBS培养过夜, 然后再次筛除出现斑点的卵母细胞, 继续用MBS培养, 温度17~19℃。
1.3 大鼠热损伤模型 将超级恒温水浴锅的水温稳定在43℃左右, 循环水浴舱的舱温稳定在41℃左右, 大鼠置于循环水浴舱中, 定时测定肛温。大鼠肛温42.0~42.9℃维持15 min, 取出大鼠立即断头, 冰浴中取出纹状体, 提取mRNA。
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1.4 提取大鼠纹状体中poly(A)+mRNA 采用Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System和PolyTract mRNA RNAgents Isolation Systems, 分两步提取poly(A)+mRNA, 用紫外分光光度计方法定量。
1.5 大鼠mRNA在爪蟾卵母细胞中的表达[3~5] 每个卵母细胞注射50 ng poly(A)+mRNA。
1.6 记录表达的多巴胺受体电流[5~7] 采用常规双电极电压箝记录方法。电压电极内充灌3 mol/L NaCl (pH 7.0), 电阻2~4 MΩ, 电流电极内充灌2 mol/L KAC (pH 9.1), 电阻1~2 MΩ。卵母细胞置于实验小室的小孔中, 动物极向上, 电压电极垂直插入动物极, 测量卵母细胞的静息电位, 待稳定后, 将电流电极从对侧插入细胞。电极插入后静息电位下降, 待20 min后静息电位恢复至正常时再进行箝位实验。将卵母细胞从静息电位箝至-60 mV, 浴槽内加入多巴胺(Dopamine, Sigma公司产品, 用MBS配置成0.1 mol/L), 终浓度为1 mmol/L, 记录多巴胺诱发的膜电流反应。
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1.7数据处理 数据采用x±s表示, 用SAS统计软件进行方差分析。
2结果
2.1静息电位
实验观察到爪蟾卵母细胞的神经递质敏感区为动物极的顶区, 因此, 将此区作为多巴胺反应的记录点。共检测了67个细胞, 静息电位(resting membrane potential, RP)的变动范围为-10~-60 mV (通常为-30~-40 mV)。 电压箝实验表明, 注射大鼠纹状体mRNA后卵母细胞的静息电位与注射前没有明显变化。
2.2受体膜电流
注射大鼠纹状体mRNA前的卵母细胞对多巴胺没有反应, 检测不到膜电流(已经过多次试验证实), 因此注射后检测到的膜电流即为表达后的受体电流。将膜电位分别箝制在-60~+20 mV, 步幅为20 mV, 分别记录30 s后不同箝制电位水平时的膜电流。以膜电流和箝制电位做I-V关系。
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可以看出, 随着箝制电位向正向偏移, 电流幅度逐渐减小, 箝制电位在0 mV时, 受体电流逆转, 变为外向电流。对箝制电位在-60 mV~-20 mV时的内向电流峰值与箝制电位所作的线性相关分析表明, 两者之间存在明显的线性关系。受体电流的逆转电位为-15.03 mV左右, 接近Cl-平衡电位。为了进一步验证, 实验中又减半细胞外液中Cl-的浓度, 多巴胺诱导受体电流幅度下降, 逆转电位为零。因此推断Cl-可能是表达的多巴胺受体电流的主要载流离子。
2.3热损伤大鼠纹状体mRNA表达的多巴胺受体电流
将箝制电位稳定在-60 mV, 记录1 mmol/L dopamine引起的多巴胺受体电流。 注射正常大鼠纹状体mRNA的卵母细胞与注射热损伤大鼠的纹状体mRNA在爪蟾卵母细胞中表达后受体电流的峰值, 如表2所示。可以看出, 注射热损伤大鼠纹状体mRNA的卵母细胞对多巴胺反应的敏感性降低, 与正常大鼠组相比有显著性差异, 表明热损伤对于大鼠纹状体中DAR的基因表达产生了明显的影响。
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3讨论
爪蟾卵母细胞多用于神经递质受体的体外表达, 可用以直接研究特定基因的表达, 而且平行性好。 从脑组织的投入量, mRNA的产量到卵母细胞的注射量；从mRNA的提取工艺到移植受体的电生理检测方法完全体现了相同的定量观察, 确保了实验的可靠性和准确性[5~7]。正常的爪蟾卵母细胞表面没有多巴胺受体, 因此对多巴胺没有反应。实验中给卵母细胞内注入纹状体mRNA, 经表达之后, 能诱导出膜电流, 并对DA有反应, 说明此膜电流为DA受体电流, 至少有DAR参与。
近年来的研究表明, 纹状体中的多巴胺受体参与机体的体温调节, 并可能调节与体温调节密切相关的热损伤, 因此纹状体成为体温调节和热损伤研究的新热点。纹状体结构复杂, 细胞类型多, 神经递质及其受体种类繁多, 多巴胺尽管在纹状体分布最多, 但绝对浓度并不高。本实验中移植受体的组织来自大鼠纹状体, 是体内多巴胺受体最高的区域之一, 确保要移植的mRNA中有足够的DAR基因。
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在正常大鼠纹状体的mRNA与热损伤大鼠纹状体mRNA平行实验中, 后者所表达的多巴胺受体电流明显弱于前者。 可以肯定, 热损伤对于大鼠纹状体中DAR的基因表达产生了明显的影响, 可能是D1R, 也可能是D2R, 或两者都有, 而且提示有离子通道的变化。我们进一步的实验证实, 在热损伤发生时D1R和D2R基因表达均有明显变化(将另文报道), 另外相关实验结果比较少, 但参与介导电行为变化的以D1R居多, 我们正在使用D1R的拮抗剂进行封闭受体实验, 以期对热损伤所致多巴胺受体离子通道变化的机制做进一步的深入探讨。
参考文献
[1]Gurdon JB, Lane CD, Woodland HR et al. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature， 1971, 233: 177～182.
, http://www.100md.com
[2]Richeter JD, Smith LD. Differential capacity for translation and lack of competition between mRNAs that segregate to free and membrane-bound polymsomes. Cell， 1981, 27: 183～191.
[3]Manistis T, Fritsch EF, Sambrook K. Translation of messenger RNA injected into frog oocytes. In: Manist T, Fritsch EF, Sambrook K eds. Molecular Cloning (A Laboratory Manual). New York: Cdd Spring Harber Laboratory, 1982, 350~352.
[4]Gunderson CB, Miledi R, Parker I. Glutamate and kainite receptor induced by brain messenger RNA in Xenopus oocytes. Proc Soc Lond Biol, 1984, 221 (1223): 127~143.
, 百拇医药
[5]Zhang BL (张炳烈), Zhang Xi (张 熙), Li WB (李文彬). The injury of Xenopus laevis oocytes membrane and its acetylcholine receptor by free radical and the protection of Lycium Barbarum polysaccharide. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1997, 4: 322~325 (in Chinese with English abstract).
[6]Yang WP (杨卫平), Li WB (李文彬), Zhang BL (张炳烈) et al. Response induced by acetycholine, glutamic acid and serotonin in Xenopus laevis oocytes injected with mRNA of aged rat cortex. Chin J Pharmacol Toxicol (中国药理学和毒理学杂志)， 1994, 8 (1): 37~39 (in Chinese with English abstract).
[7]Chen HC (陈厚昌), Gerge PH. Expression and characteristics of nicotinic receptors in Xenopus oocytes. Chin J Pharmacol Toxicol (中国药理学和毒理学杂志) 1994, 8 (2): 110~113 (in Chinese with English abstract)., 百拇医药
关键词：热损伤；纹状体；多巴胺；受体；卵母细胞
摘要：Untitled Document将从正常大鼠和热损伤大鼠的中枢纹状体提取的poly(A)+ mRNA, 注入非洲爪蟾卵母细胞表达。用电生理方法检测多巴胺诱发的膜电位和电流的变化, 分析热损伤对中枢多巴胺受体表达的影响。结果表明, 注射大鼠纹状体mRNA后, 卵母细胞的静息电位与注射前没有变化, 但多巴胺能诱发膜电流。 经验证, 此受体电流的主要载流离子是Cl-。注射热损伤大鼠纹状体mRNA的卵母细胞对多巴胺反应的敏感性降低, 与正常大鼠组相比有显著性差异。因此可以断定, 热损伤对大鼠纹状体中多巴胺受体的基因表达产生了明显的影响, 并可能有离子通道的参与。
热环境的持续刺激引起机体的热损伤一直是病理生理学和环境医学研究的重要课题。近年来的研究表明, 中枢多巴胺受体(DAR)参与了体温调节的过程。为了研究热损伤发生时多巴胺受体结构和功能的改变, 需要考察热损伤引起的多巴胺受体基因水平、基因转录和翻译表达这一系列过程中是否有重要变化, 体外表达多巴胺受体是研究这一过程的有效方法。非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞已经被广泛应用于体外表达各种受体蛋白, 并能进一步分析离子通道的变化[1~3]。 因此本实验中采用了这一表达系统, 将从大鼠纹状体提取的poly(A)+ mRNA移植入卵母细胞表达, 观察表达后的电生理信号, 进行热损伤大鼠纹状体mRNA平行实验, 以期发现热损伤对受体表达的影响并探讨其原因。
, 百拇医药
1材料和方法
1.1 实验动物 成年健康Wistar雄性大鼠(180~220 g)。 雌性非洲爪蟾(2~3岁), 由中国科学院发育生物研究所提供。饲养在玻璃缸内, 水温保持在19~25℃, 每周喂猪肝2次并更换清水。
1.2 卵母细胞制备 冰浴麻醉爪蟾, 腹中线旁切1 cm, 切开约0.5 cm, 取一小叶卵巢组织置于改良巴氏盐溶液(MBS)中。以铂丝环分离单个卵母细胞, 挑选直径1.0~1.2 mm、动物极和植物极黑白界限分明、无斑点无杂纹的Ⅳ-Ⅴ期卵母细胞。 剥去卵黄膜, 用MBS培养过夜, 然后再次筛除出现斑点的卵母细胞, 继续用MBS培养, 温度17~19℃。
1.3 大鼠热损伤模型 将超级恒温水浴锅的水温稳定在43℃左右, 循环水浴舱的舱温稳定在41℃左右, 大鼠置于循环水浴舱中, 定时测定肛温。大鼠肛温42.0~42.9℃维持15 min, 取出大鼠立即断头, 冰浴中取出纹状体, 提取mRNA。
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1.4 提取大鼠纹状体中poly(A)+mRNA 采用Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System和PolyTract mRNA RNAgents Isolation Systems, 分两步提取poly(A)+mRNA, 用紫外分光光度计方法定量。
1.5 大鼠mRNA在爪蟾卵母细胞中的表达[3~5] 每个卵母细胞注射50 ng poly(A)+mRNA。
1.6 记录表达的多巴胺受体电流[5~7] 采用常规双电极电压箝记录方法。电压电极内充灌3 mol/L NaCl (pH 7.0), 电阻2~4 MΩ, 电流电极内充灌2 mol/L KAC (pH 9.1), 电阻1~2 MΩ。卵母细胞置于实验小室的小孔中, 动物极向上, 电压电极垂直插入动物极, 测量卵母细胞的静息电位, 待稳定后, 将电流电极从对侧插入细胞。电极插入后静息电位下降, 待20 min后静息电位恢复至正常时再进行箝位实验。将卵母细胞从静息电位箝至-60 mV, 浴槽内加入多巴胺(Dopamine, Sigma公司产品, 用MBS配置成0.1 mol/L), 终浓度为1 mmol/L, 记录多巴胺诱发的膜电流反应。
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1.7数据处理 数据采用x±s表示, 用SAS统计软件进行方差分析。
2结果
2.1静息电位
实验观察到爪蟾卵母细胞的神经递质敏感区为动物极的顶区, 因此, 将此区作为多巴胺反应的记录点。共检测了67个细胞, 静息电位(resting membrane potential, RP)的变动范围为-10~-60 mV (通常为-30~-40 mV)。 电压箝实验表明, 注射大鼠纹状体mRNA后卵母细胞的静息电位与注射前没有明显变化。
2.2受体膜电流
注射大鼠纹状体mRNA前的卵母细胞对多巴胺没有反应, 检测不到膜电流(已经过多次试验证实), 因此注射后检测到的膜电流即为表达后的受体电流。将膜电位分别箝制在-60~+20 mV, 步幅为20 mV, 分别记录30 s后不同箝制电位水平时的膜电流。以膜电流和箝制电位做I-V关系。
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可以看出, 随着箝制电位向正向偏移, 电流幅度逐渐减小, 箝制电位在0 mV时, 受体电流逆转, 变为外向电流。对箝制电位在-60 mV~-20 mV时的内向电流峰值与箝制电位所作的线性相关分析表明, 两者之间存在明显的线性关系。受体电流的逆转电位为-15.03 mV左右, 接近Cl-平衡电位。为了进一步验证, 实验中又减半细胞外液中Cl-的浓度, 多巴胺诱导受体电流幅度下降, 逆转电位为零。因此推断Cl-可能是表达的多巴胺受体电流的主要载流离子。
2.3热损伤大鼠纹状体mRNA表达的多巴胺受体电流
将箝制电位稳定在-60 mV, 记录1 mmol/L dopamine引起的多巴胺受体电流。 注射正常大鼠纹状体mRNA的卵母细胞与注射热损伤大鼠的纹状体mRNA在爪蟾卵母细胞中表达后受体电流的峰值, 如表2所示。可以看出, 注射热损伤大鼠纹状体mRNA的卵母细胞对多巴胺反应的敏感性降低, 与正常大鼠组相比有显著性差异, 表明热损伤对于大鼠纹状体中DAR的基因表达产生了明显的影响。
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3讨论
爪蟾卵母细胞多用于神经递质受体的体外表达, 可用以直接研究特定基因的表达, 而且平行性好。 从脑组织的投入量, mRNA的产量到卵母细胞的注射量；从mRNA的提取工艺到移植受体的电生理检测方法完全体现了相同的定量观察, 确保了实验的可靠性和准确性[5~7]。正常的爪蟾卵母细胞表面没有多巴胺受体, 因此对多巴胺没有反应。实验中给卵母细胞内注入纹状体mRNA, 经表达之后, 能诱导出膜电流, 并对DA有反应, 说明此膜电流为DA受体电流, 至少有DAR参与。
近年来的研究表明, 纹状体中的多巴胺受体参与机体的体温调节, 并可能调节与体温调节密切相关的热损伤, 因此纹状体成为体温调节和热损伤研究的新热点。纹状体结构复杂, 细胞类型多, 神经递质及其受体种类繁多, 多巴胺尽管在纹状体分布最多, 但绝对浓度并不高。本实验中移植受体的组织来自大鼠纹状体, 是体内多巴胺受体最高的区域之一, 确保要移植的mRNA中有足够的DAR基因。
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在正常大鼠纹状体的mRNA与热损伤大鼠纹状体mRNA平行实验中, 后者所表达的多巴胺受体电流明显弱于前者。 可以肯定, 热损伤对于大鼠纹状体中DAR的基因表达产生了明显的影响, 可能是D1R, 也可能是D2R, 或两者都有, 而且提示有离子通道的变化。我们进一步的实验证实, 在热损伤发生时D1R和D2R基因表达均有明显变化(将另文报道), 另外相关实验结果比较少, 但参与介导电行为变化的以D1R居多, 我们正在使用D1R的拮抗剂进行封闭受体实验, 以期对热损伤所致多巴胺受体离子通道变化的机制做进一步的深入探讨。
参考文献
[1]Gurdon JB, Lane CD, Woodland HR et al. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature， 1971, 233: 177～182.
, http://www.100md.com
[2]Richeter JD, Smith LD. Differential capacity for translation and lack of competition between mRNAs that segregate to free and membrane-bound polymsomes. Cell， 1981, 27: 183～191.
[3]Manistis T, Fritsch EF, Sambrook K. Translation of messenger RNA injected into frog oocytes. In: Manist T, Fritsch EF, Sambrook K eds. Molecular Cloning (A Laboratory Manual). New York: Cdd Spring Harber Laboratory, 1982, 350~352.
[4]Gunderson CB, Miledi R, Parker I. Glutamate and kainite receptor induced by brain messenger RNA in Xenopus oocytes. Proc Soc Lond Biol, 1984, 221 (1223): 127~143.
, 百拇医药
[5]Zhang BL (张炳烈), Zhang Xi (张 熙), Li WB (李文彬). The injury of Xenopus laevis oocytes membrane and its acetylcholine receptor by free radical and the protection of Lycium Barbarum polysaccharide. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1997, 4: 322~325 (in Chinese with English abstract).
[6]Yang WP (杨卫平), Li WB (李文彬), Zhang BL (张炳烈) et al. Response induced by acetycholine, glutamic acid and serotonin in Xenopus laevis oocytes injected with mRNA of aged rat cortex. Chin J Pharmacol Toxicol (中国药理学和毒理学杂志)， 1994, 8 (1): 37~39 (in Chinese with English abstract).
[7]Chen HC (陈厚昌), Gerge PH. Expression and characteristics of nicotinic receptors in Xenopus oocytes. Chin J Pharmacol Toxicol (中国药理学和毒理学杂志) 1994, 8 (2): 110~113 (in Chinese with English abstract)., 百拇医药