c-erbB2对大鼠黄体细胞hCG诱导的孕酮分泌的影响
江西医学院生理教研室；南昌；330006 金萱；方廉；郑月慧；钟志胜；况海斌
关键词：黄体细胞；c-erbB2；反义寡脱氧核苷酸；孕酮
摘要：
采用离体细胞体外孵育法, 研究反义c-erbB2寡脱氧核苷酸(antisense c-erbB2 ODN)对大鼠黄体细胞hCG 诱导的孕酮分泌的影响, 及其与外源性cAMP和Ca2+以及蛋白抑制剂放线菌酮(CYX)之间的关系。 结果表明, 反义 c-erbB2以剂量相关方式抑制黄体细胞hCG诱导的孕酮的产生, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降, 无义tat ODN没有相应的作用。 10-4 mol/L的二丁酰cAMP能明显反转反义c-erbB2 ODN对孕酮产生和c-erbB2表达的抑制作用, 钙离子通道阻断剂维拉帕米和蛋白抑制剂CYX 对此抑制作用有协同效应。 该实验说明c-erbB2参于hCG诱导黄体细胞生孕酮作用。
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原癌基因是指正常情况下相对静止的一段碱基序列, 它的表达与细胞生长分化有关, 在进化上是高度保守的。 最近, Putowski LT等用原位杂交技术发现在卵巢组织中有某些原癌基因编码的蛋白产物[1]。 原癌基因如c-myc, c-fos的正常表达与卵泡正常的生长、发育、排卵、黄体形成, 以及雌激素、孕激素的分泌功能有着密切的关系[25]。 但对c-erbB2与正常卵巢功能的关系报道较少。 Misoge[6] 等发现, 在人的胚胎发育过程中有c-erbB2表达。 在卵巢癌组织中, c-erbB2过度表达则与不良预后有关[7]。 本实验的目的是通过利用反义c-erbB2寡脱氧核苷酸(反义c-erbB2 ODN)阻断c-erbB2原癌基因表达, 观察hCG诱导大鼠黄体细胞孕酮分泌的变化并探讨外源性cAMP、Ca2+以及放线菌酮(CYX)对黄体细胞c-erbB2表达的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 孕马血清促性腺激素(PMSG): 天津实验动物中心产品, 用生理盐水配成100 IU/0.2 ml。 人绒毛膜促性腺激素(hCG): 预处理动物所用hCG为上海生物化学制药厂产品, 用生理盐水配成50 IU/0.2 ml, MEM (minimum essential medium)培养液: 美国Life Technologies产品, 内加25 mmol/L HEPES 和0.5% BSA, 以及青霉素100 U/ml和链霉素100 mg/ml, 用7.6% NaHCO3调节至pH 7.27.4。 HEPES和BSA, 离体实验所用hCG、 二丁酰cAMP、 维拉帕米(verapamil)、Ⅰ型胶原酶、 CYX均为Sigma公司产品。 寡脱氧核苷酸(ODN):上海生物工程中心合成。 反义c-erbB2 ODN序列为: 5′-CAGCTCCATGGTGCT-3′[8], 无义tat ODN序列为: 5′-CATTTCTTGCTCTCC-3′, 均用硫代磷酸修饰。 孕酮(P)放免测定药盒: 天津九鼎医学生物工程有限公司提供。 免疫组织化学试剂盒: 丹麦DAKO公司产品。
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1.2 动物模型及黄体细胞悬液的制备和孵育 选用2529 d龄未成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠, 体重70 g, 每只皮下注射(SC)PMSG65IU。 64 h后, 每只SC hCG 35 IU, 注射hCG, 7 d后断头处死, 迅速取出卵巢。 此时卵巢经超排卵后同步发育为黄体化卵巢。 去除周围脂肪和被膜, 用MEM培养液冲洗数次。 将卵巢切碎, 放入盛0.1%胶原酶的培养液中, 充入95% O2和5% CO2混合气体, 37℃恒温水浴, 振荡孕育消化1 h。 终止孵育时用吸管轻轻吹打数次以分散细胞。 消化液经尼龙网过滤, 滤液用MEM培养液离心沉淀3次, 弃上清液, 再用MEM培养液将沉淀细胞重新分散成每管含活细胞1.0×106个/ml, 每组6分。0.2%台盼蓝排斥试验测得孵育期间细胞存活率为90%以上。 预孵育30 min后, 加入处理试剂继续孵育4 h, 将细胞悬液于4℃、250 g离心10 min, 上清液储于-20℃待测P, 细胞沉淀涂于玻片上, 用2%的多聚甲醛固定, 储于4℃, 待测细胞内c-erbB2癌基因蛋白。
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1.3 测试方法 P用放射免疫分析法(RIA)测定。 批间及批内变异系数分别小于10%和5%。 细胞内c-erbB2癌基因蛋白用免疫组织化学方法测定。 抗c-erbB2癌基因蛋白多克隆抗体(兔抗)为第一抗体 1∶100, 按常规免疫组化LSAB染色, 同时设有阴性对照组, 以磷酸盐缓冲液(PBS)代替第一抗体。 染色阳性细胞为红棕色, 每片至少计算100个细胞算出染色阳性细胞的百分数。
1.4 统计处理 结果以 ±s表示, 两组间差别的显著性比较用t检验。 相关分析用直线回归分析法。 以P≤0.05为显著性差异标准, P≤0.01为极显著性差异标准。
2 结果
2.1 不同浓度反义c-erbB2 ODN对hCG诱导大鼠黄体细胞分泌孕酮的影响
反义c-erbB2对hCG诱导的黄体细胞孕酮产生有抑制作用, 随反义c-erbB2 ODN浓度增加, 黄体细胞P分泌量不断下降, 两者成负相关关系(r=-0.97 P<0.01), 在反义c-erbB2 ODN浓度达10 μmol/l时有非常显著的抑制作用(P<0.01)。 对照组(C)显示无义tat ODN对黄体细胞hCG诱导的P分泌无明显影响(表1) 。
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表 1. 不同浓度反义c-erbB2 ODN对hCG诱导大鼠黄体细胞分泌孕酮的影响
Table 1. Effects of various concentrations of c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone production in rat luteal cells
ntisense c-erbB2 ODN
(μmol/L)
Progesterone
(pmol/106 cells)
0
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281.96±13.76
5
269.26±40.91
10
208.39±29.51**
15
164.11±23.21**
Nonsense tat ODN(20 μmol/L)
283.92±34.6
n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.
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2.2 二丁酰cAMP单独以及与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌及c-erbB2癌基因蛋白表达的影响
10-4 mol/L二丁酰cAMP可极显著增加hCG诱导的黄体细胞P的产生, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数显著增加。 而10 μmol/L反义c-erbB2 ODN能极显著抑制hCG诱导的黄体细胞P产生, 并伴有c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降。 当dbcAMP与反义c-erbB2 ODN共同作用时可明显反转反义c-erbB2 ODN对黄体细胞hCG诱导的P分泌的抑制作用, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数显著增加(表2)。
表2. 二丁酰cAMP单独以及与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌及c-erbB2癌基因蛋白表达的影响
Table 2. Effects of dbcAMP alone or in combination with c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced production in rat luteal cells and the percentages of positive staining luteal cells for c-erbB2 protein
, 百拇医药
Group
P (pmol/106 cells)
Percentages of stained cells (%)
1. hCG (2.5 IU/ml)
221.83±20.82
39.01±2.60
2. hCG+cAMP (0.1 mmol/L)
427.27±132.6**
60.30±8.57**
, http://www.100md.com 3. hCG+antisensec-erbB2 ODN (10 μmol/L)
133.41±36.42**
20.41±0.76**
4. hCG+cAMP+antisensec-erbB2 ODN
252.61±21.81△△
49.01±3.49△△
5. hCG+无义TAT ODN (20 μmol/L)
218.40±18.20
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38.89±2.71
P: progesterone. n=6, △△P<0.01 vs group 3;** P<0.01 vs group 1.
2.3 Verapamil单独以及与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌及癌基因蛋白表达的影响
1 μmol/L 钙离子通道阻断剂 verapamil能极显著抑制hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数明显下降。 而10 μmol/L反义c-erbB2 ODN也能显著抑制黄体细胞hCG诱导P的分泌, 并伴有c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数降低。 当verapamil和反义c-erbB2 ODN共同作用时, hCG诱导的黄体细胞P产生和c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数与单独用反义c-erbB2 ODN比较均下降(表3)。
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表3. Verapamil及其与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌及癌基因蛋白表达的影响
Table 3. Effects of verapamil alone or in combination with c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone in rat luteal cells and the percentages of positive staining luteal cells for c-erbB2 protein
Group
P (pmol/106 cells)
Percentages of stained cells (%)
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hCG (2.25IU/ml)
221.83±20.82
39.01±2.60
hCG+verapamil (1 μmol/L)
122.86±41.82**
28.60±1.25**
hCG+antisense c-erbB2 ODN (10 μmol/l)
133.40±36.42**
20.41±0.76**
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hCG+antisense c-erbB2 ODN+verapamil
64.81±30.80△△
11.64±1.50△△
hCG+nonsense tat ODN (20 μmol/l)
218.40±18.20
38.89±2.71
P: progesterone. n=6, ** P<0.01 vs group 1; △△P<0.01 vs group 3.
2.4 CYX单独以及与反义c-erbB2 ODN 共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌的影响
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50 mg/ml 蛋白抑制剂 CYX与10 μmol/L反义c-erbB2ODN均能显著抑制hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌, 两者共同作用时黄体细胞hCG诱导的P分泌量比单独使用反义c-erbB2 ODN 明显下降(表4)。
表4. CYX单独以及与反义c-erbB2 ODN 共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌的影响
Table 4. Effects of cycloheximide alone or in combination with c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone production in rat luteal cells
Group
Progesterone (pmol/106 cells)
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hCG (2.5 IU/ml)
221.83±20.82
hCG+CYX (50 μg/ml)
132.03±36.81* *
hCG+antisensec-erbB2ODN
133.41±36.42* *
(10 μmol/L)
hCG+CYX+antisense
63.46±28.22△△
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c-erbB2 ODN
n=6. **P<0.01 vs group 1, △△P<0.01 vs group 3.
3 讨论
卵巢是一个以周期性的细胞增殖和分化为特征的器官。 Putowski等[1]通过原位杂交技术对人卵巢的c-myc mRNA进行定位检查。 发现除原始卵泡外, c-myc基因在生长的所有阶段均有表达, 且在黄体中c-myc mRNA亦反应阳性, 但在绝经后卵巢中则没有c-myc阳性染色。 结果提示c-myc的表达可能对人卵泡发育和黄体形成起着重要作用。 在卵泡发育过程中, 还有一些原癌基因参与调控, 如neu基因产物能触发卵泡成熟[9]。 颗粒细胞中有c-fos的表达蛋白[3]。 Baum[10]等发现蟾蜍的k-ras同系物在卵子发生的整个过程均有表达, r-ras虽不能直接诱导蟾蜍卵泡成熟, 但它能刺激c-fos基因的表达。 我们通过免疫组化方法发现在超排卵后的大鼠黄体细胞中有 c-erbB2基因蛋白表达, 说明在卵泡的发育和成熟过程中, 原癌基因通过其正常表达参与了调控。
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实验主要研究原癌基因c-erbB2对大鼠黄体细胞hCG诱导的孕酮生成的影响及其作用机制。已知原癌基因参与正常细胞的增殖和分化, c-erbB2 属于表达生长因子受体类原癌基因, 位于17号染色体长臂, 它的表达产物在质膜中。 研究表明, c-erbB2的大量扩增和过度表达与卵巢癌的恶性程度及预后有关。 随c-erbB2 表达强度的增加,生存期相应缩短, 两者具有相关性[7]。 但对c-erbB2正常表达与卵巢功能的关系研究甚少。本实验采用反义15聚c-erbB2寡脱氧核苷酸, 与c-erbB2的翻译起始序列互补阻断其表达。为了增加反义c-erbB2 ODN膜通透性和防止进入细胞后受到核酸酶的降解, 在磷酸基因上给于了硫代化修饰。实验发现, 反义c-erbB2 ODN呈剂量相关方式抑制hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌量, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降。无义tat ODN由于与c-erbB2无同源互补序列,示观察到此现象.说明c-erbB2可能与hCG调节卵巢黄体细胞分泌孕酮有关.
cAMP 是hCG调节卵巢孕酮分泌的第二信使,在正常卵巢组织中,cAMP 对原癌基因的表达起着一定的调节作用[11].它可能是通过提高细胞内游离Ca2+的浓度实现的.我们观察了cAMP 和verapamil对黄体细胞中c-erbB2蛋白表达的影响.结果发现,0.1mmol/L cAMP 能使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数明显增加,同时显著刺激黄体细胞hCG诱导的P产生,当与反义c-erbB2 ODN贡同作用时,能反转反义c-erbB2 ODN对黄体细胞分泌功能的抑制效应.使孕酮分泌量增加,同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数增加.由此可见,cAMP 能通过诱导c-erbB2表达增强而提高卵巢P分泌.Verapamil是Ca2+通道阴断剂,实验观察到Verapamil能减少hCG刺激的黄体细胞孕酮分泌量,与反义c-erbB2ODN对黄体细胞分泌功能的抑制有协同作用,并使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数减少.可见,当细胞内Ca2+浓度下降时,c-erbB2的表达受抑制.蛋白抑制剂CYX与反义c-erbB2ODN的抑制效应也有明显的协同作用, 但是否说明原癌基因c-erbB2对黄体细胞孕酮分泌的调节是通过促进合成某种蛋白质实现的, 还是c-erbB蛋白自身具有此调节作用尚须进一步研究。
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*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39660029)
作者单位：金萱(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
方廉(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
郑月慧(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
钟志胜(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
况海斌(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
参考文献
[1] Putowski LT, Skrzypczak M, Zielewicz J, et al. The re～le～vance of c-myc to the physiology of the human ovary. Gynecol Endocrinol, 1997, 11 (1): 5～10.
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[2] Pinotkewitz Y, Sundfeldt K, Hedin L. The expression of c-myc during follicular growth and luteal fornmation in the rat ovary in vivo. J Endocrinol, 1997, 152 (3): 395～406.
[3] Delidow BC, White BA, Peluso JJ. Gonadotropin induction of c-fos and c-myc expression and deoxyribonucleic acid synthesis in rat granulosa cells. Endocrinology, 1990, 126 (5): 2302～2306.
[4] Delidow BC, Lynch JP, White BA. Regulation of proto-oncogene expression and deoxyribonucleic acid synthesis in granulosa cells of perifused immature rat ovaries. Biol Reprod, 1992, 47 (3): 428～435.
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[6] Miosge N, Schneider W, Gotz W, et al. The oncoproteins c-erbB2, c-fos and the tumour suppressor protein p53 in human embryos and fetuses. Anat Embryol Berl, 1997, 195 (4): 345～352.
[7] Bian ML (卞美璐), Fan QB (樊庆泊), Huang SZ (黄尚志), et al. Amplification of proto-oncogenes C-myc, C-N-ras, C-Ki-ras, C-erbB2 in ovarian carcinoma. Chin J Obstet Gynecol (中华妇产科杂志), 1995, 30 (7): 406～409 (in Chinese with English abstract).
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[8] Wu LY (吴令英), Wu AR (吴爱如), Jiang K (姜 琨), et al. Effect of antisense c-erbB2 on biologic behaviour and chemotherapeutic drug sensitivity in human ovarian cancer cells. Chin J Obstet Gynecol (中华妇产科杂志), 1996, 31 (3): 169～172 (in Chinese with English abstract).
[9] Narasimhan V, Hamill O, Cerione RA, et al. The effects of the normal and oncogenic forms of the neu tyrosine kinase, and the corresponding forms of an immunoglobulin E receptor/neu tyrosine kinase fusion protein on Xenopus oocyte maturation. FEBS lett, 1992, 303 (2-3): 164～168.
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[10] Baum EZ, Bebernitz GA. k-ras oncogene expression in Xenopus laevis oncogene. 1990, 5 (5): 763～767.
[11] Pennybacker M, Herman B. Follicle-stimulating hormone in～crease c-fos mRNA levels in rat granulosa cells via a protein kinase Ca2+ -dependent mechanism. Mol Cell Endocrinol, 1991, 80 (1-3): 11～20.
Received 1999-04-29 Revised 1999-07-12, http://www.100md.com
关键词：黄体细胞；c-erbB2；反义寡脱氧核苷酸；孕酮
摘要：
采用离体细胞体外孵育法, 研究反义c-erbB2寡脱氧核苷酸(antisense c-erbB2 ODN)对大鼠黄体细胞hCG 诱导的孕酮分泌的影响, 及其与外源性cAMP和Ca2+以及蛋白抑制剂放线菌酮(CYX)之间的关系。 结果表明, 反义 c-erbB2以剂量相关方式抑制黄体细胞hCG诱导的孕酮的产生, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降, 无义tat ODN没有相应的作用。 10-4 mol/L的二丁酰cAMP能明显反转反义c-erbB2 ODN对孕酮产生和c-erbB2表达的抑制作用, 钙离子通道阻断剂维拉帕米和蛋白抑制剂CYX 对此抑制作用有协同效应。 该实验说明c-erbB2参于hCG诱导黄体细胞生孕酮作用。
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原癌基因是指正常情况下相对静止的一段碱基序列, 它的表达与细胞生长分化有关, 在进化上是高度保守的。 最近, Putowski LT等用原位杂交技术发现在卵巢组织中有某些原癌基因编码的蛋白产物[1]。 原癌基因如c-myc, c-fos的正常表达与卵泡正常的生长、发育、排卵、黄体形成, 以及雌激素、孕激素的分泌功能有着密切的关系[25]。 但对c-erbB2与正常卵巢功能的关系报道较少。 Misoge[6] 等发现, 在人的胚胎发育过程中有c-erbB2表达。 在卵巢癌组织中, c-erbB2过度表达则与不良预后有关[7]。 本实验的目的是通过利用反义c-erbB2寡脱氧核苷酸(反义c-erbB2 ODN)阻断c-erbB2原癌基因表达, 观察hCG诱导大鼠黄体细胞孕酮分泌的变化并探讨外源性cAMP、Ca2+以及放线菌酮(CYX)对黄体细胞c-erbB2表达的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 孕马血清促性腺激素(PMSG): 天津实验动物中心产品, 用生理盐水配成100 IU/0.2 ml。 人绒毛膜促性腺激素(hCG): 预处理动物所用hCG为上海生物化学制药厂产品, 用生理盐水配成50 IU/0.2 ml, MEM (minimum essential medium)培养液: 美国Life Technologies产品, 内加25 mmol/L HEPES 和0.5% BSA, 以及青霉素100 U/ml和链霉素100 mg/ml, 用7.6% NaHCO3调节至pH 7.27.4。 HEPES和BSA, 离体实验所用hCG、 二丁酰cAMP、 维拉帕米(verapamil)、Ⅰ型胶原酶、 CYX均为Sigma公司产品。 寡脱氧核苷酸(ODN):上海生物工程中心合成。 反义c-erbB2 ODN序列为: 5′-CAGCTCCATGGTGCT-3′[8], 无义tat ODN序列为: 5′-CATTTCTTGCTCTCC-3′, 均用硫代磷酸修饰。 孕酮(P)放免测定药盒: 天津九鼎医学生物工程有限公司提供。 免疫组织化学试剂盒: 丹麦DAKO公司产品。
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1.2 动物模型及黄体细胞悬液的制备和孵育 选用2529 d龄未成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠, 体重70 g, 每只皮下注射(SC)PMSG65IU。 64 h后, 每只SC hCG 35 IU, 注射hCG, 7 d后断头处死, 迅速取出卵巢。 此时卵巢经超排卵后同步发育为黄体化卵巢。 去除周围脂肪和被膜, 用MEM培养液冲洗数次。 将卵巢切碎, 放入盛0.1%胶原酶的培养液中, 充入95% O2和5% CO2混合气体, 37℃恒温水浴, 振荡孕育消化1 h。 终止孵育时用吸管轻轻吹打数次以分散细胞。 消化液经尼龙网过滤, 滤液用MEM培养液离心沉淀3次, 弃上清液, 再用MEM培养液将沉淀细胞重新分散成每管含活细胞1.0×106个/ml, 每组6分。0.2%台盼蓝排斥试验测得孵育期间细胞存活率为90%以上。 预孵育30 min后, 加入处理试剂继续孵育4 h, 将细胞悬液于4℃、250 g离心10 min, 上清液储于-20℃待测P, 细胞沉淀涂于玻片上, 用2%的多聚甲醛固定, 储于4℃, 待测细胞内c-erbB2癌基因蛋白。
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1.3 测试方法 P用放射免疫分析法(RIA)测定。 批间及批内变异系数分别小于10%和5%。 细胞内c-erbB2癌基因蛋白用免疫组织化学方法测定。 抗c-erbB2癌基因蛋白多克隆抗体(兔抗)为第一抗体 1∶100, 按常规免疫组化LSAB染色, 同时设有阴性对照组, 以磷酸盐缓冲液(PBS)代替第一抗体。 染色阳性细胞为红棕色, 每片至少计算100个细胞算出染色阳性细胞的百分数。
1.4 统计处理 结果以 ±s表示, 两组间差别的显著性比较用t检验。 相关分析用直线回归分析法。 以P≤0.05为显著性差异标准, P≤0.01为极显著性差异标准。
2 结果
2.1 不同浓度反义c-erbB2 ODN对hCG诱导大鼠黄体细胞分泌孕酮的影响
反义c-erbB2对hCG诱导的黄体细胞孕酮产生有抑制作用, 随反义c-erbB2 ODN浓度增加, 黄体细胞P分泌量不断下降, 两者成负相关关系(r=-0.97 P<0.01), 在反义c-erbB2 ODN浓度达10 μmol/l时有非常显著的抑制作用(P<0.01)。 对照组(C)显示无义tat ODN对黄体细胞hCG诱导的P分泌无明显影响(表1) 。
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表 1. 不同浓度反义c-erbB2 ODN对hCG诱导大鼠黄体细胞分泌孕酮的影响
Table 1. Effects of various concentrations of c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone production in rat luteal cells
ntisense c-erbB2 ODN
(μmol/L)
Progesterone
(pmol/106 cells)
0
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281.96±13.76
5
269.26±40.91
10
208.39±29.51**
15
164.11±23.21**
Nonsense tat ODN(20 μmol/L)
283.92±34.6
n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.
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2.2 二丁酰cAMP单独以及与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌及c-erbB2癌基因蛋白表达的影响
10-4 mol/L二丁酰cAMP可极显著增加hCG诱导的黄体细胞P的产生, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数显著增加。 而10 μmol/L反义c-erbB2 ODN能极显著抑制hCG诱导的黄体细胞P产生, 并伴有c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降。 当dbcAMP与反义c-erbB2 ODN共同作用时可明显反转反义c-erbB2 ODN对黄体细胞hCG诱导的P分泌的抑制作用, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数显著增加(表2)。
表2. 二丁酰cAMP单独以及与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌及c-erbB2癌基因蛋白表达的影响
Table 2. Effects of dbcAMP alone or in combination with c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced production in rat luteal cells and the percentages of positive staining luteal cells for c-erbB2 protein
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Group
P (pmol/106 cells)
Percentages of stained cells (%)
1. hCG (2.5 IU/ml)
221.83±20.82
39.01±2.60
2. hCG+cAMP (0.1 mmol/L)
427.27±132.6**
60.30±8.57**
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133.41±36.42**
20.41±0.76**
4. hCG+cAMP+antisensec-erbB2 ODN
252.61±21.81△△
49.01±3.49△△
5. hCG+无义TAT ODN (20 μmol/L)
218.40±18.20
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38.89±2.71
P: progesterone. n=6, △△P<0.01 vs group 3;** P<0.01 vs group 1.
2.3 Verapamil单独以及与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌及癌基因蛋白表达的影响
1 μmol/L 钙离子通道阻断剂 verapamil能极显著抑制hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数明显下降。 而10 μmol/L反义c-erbB2 ODN也能显著抑制黄体细胞hCG诱导P的分泌, 并伴有c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数降低。 当verapamil和反义c-erbB2 ODN共同作用时, hCG诱导的黄体细胞P产生和c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数与单独用反义c-erbB2 ODN比较均下降(表3)。
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表3. Verapamil及其与反义c-erbB2 ODN共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌及癌基因蛋白表达的影响
Table 3. Effects of verapamil alone or in combination with c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone in rat luteal cells and the percentages of positive staining luteal cells for c-erbB2 protein
Group
P (pmol/106 cells)
Percentages of stained cells (%)
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hCG (2.25IU/ml)
221.83±20.82
39.01±2.60
hCG+verapamil (1 μmol/L)
122.86±41.82**
28.60±1.25**
hCG+antisense c-erbB2 ODN (10 μmol/l)
133.40±36.42**
20.41±0.76**
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hCG+antisense c-erbB2 ODN+verapamil
64.81±30.80△△
11.64±1.50△△
hCG+nonsense tat ODN (20 μmol/l)
218.40±18.20
38.89±2.71
P: progesterone. n=6, ** P<0.01 vs group 1; △△P<0.01 vs group 3.
2.4 CYX单独以及与反义c-erbB2 ODN 共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌的影响
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50 mg/ml 蛋白抑制剂 CYX与10 μmol/L反义c-erbB2ODN均能显著抑制hCG诱导的大鼠黄体细胞P分泌, 两者共同作用时黄体细胞hCG诱导的P分泌量比单独使用反义c-erbB2 ODN 明显下降(表4)。
表4. CYX单独以及与反义c-erbB2 ODN 共同作用时对hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌的影响
Table 4. Effects of cycloheximide alone or in combination with c-erbB2 antisense oligodeoxynucleotide on hCG-induced progesterone production in rat luteal cells
Group
Progesterone (pmol/106 cells)
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hCG (2.5 IU/ml)
221.83±20.82
hCG+CYX (50 μg/ml)
132.03±36.81* *
hCG+antisensec-erbB2ODN
133.41±36.42* *
(10 μmol/L)
hCG+CYX+antisense
63.46±28.22△△
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c-erbB2 ODN
n=6. **P<0.01 vs group 1, △△P<0.01 vs group 3.
3 讨论
卵巢是一个以周期性的细胞增殖和分化为特征的器官。 Putowski等[1]通过原位杂交技术对人卵巢的c-myc mRNA进行定位检查。 发现除原始卵泡外, c-myc基因在生长的所有阶段均有表达, 且在黄体中c-myc mRNA亦反应阳性, 但在绝经后卵巢中则没有c-myc阳性染色。 结果提示c-myc的表达可能对人卵泡发育和黄体形成起着重要作用。 在卵泡发育过程中, 还有一些原癌基因参与调控, 如neu基因产物能触发卵泡成熟[9]。 颗粒细胞中有c-fos的表达蛋白[3]。 Baum[10]等发现蟾蜍的k-ras同系物在卵子发生的整个过程均有表达, r-ras虽不能直接诱导蟾蜍卵泡成熟, 但它能刺激c-fos基因的表达。 我们通过免疫组化方法发现在超排卵后的大鼠黄体细胞中有 c-erbB2基因蛋白表达, 说明在卵泡的发育和成熟过程中, 原癌基因通过其正常表达参与了调控。
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实验主要研究原癌基因c-erbB2对大鼠黄体细胞hCG诱导的孕酮生成的影响及其作用机制。已知原癌基因参与正常细胞的增殖和分化, c-erbB2 属于表达生长因子受体类原癌基因, 位于17号染色体长臂, 它的表达产物在质膜中。 研究表明, c-erbB2的大量扩增和过度表达与卵巢癌的恶性程度及预后有关。 随c-erbB2 表达强度的增加,生存期相应缩短, 两者具有相关性[7]。 但对c-erbB2正常表达与卵巢功能的关系研究甚少。本实验采用反义15聚c-erbB2寡脱氧核苷酸, 与c-erbB2的翻译起始序列互补阻断其表达。为了增加反义c-erbB2 ODN膜通透性和防止进入细胞后受到核酸酶的降解, 在磷酸基因上给于了硫代化修饰。实验发现, 反义c-erbB2 ODN呈剂量相关方式抑制hCG诱导的大鼠黄体细胞孕酮分泌量, 同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降。无义tat ODN由于与c-erbB2无同源互补序列,示观察到此现象.说明c-erbB2可能与hCG调节卵巢黄体细胞分泌孕酮有关.
cAMP 是hCG调节卵巢孕酮分泌的第二信使,在正常卵巢组织中,cAMP 对原癌基因的表达起着一定的调节作用[11].它可能是通过提高细胞内游离Ca2+的浓度实现的.我们观察了cAMP 和verapamil对黄体细胞中c-erbB2蛋白表达的影响.结果发现,0.1mmol/L cAMP 能使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数明显增加,同时显著刺激黄体细胞hCG诱导的P产生,当与反义c-erbB2 ODN贡同作用时,能反转反义c-erbB2 ODN对黄体细胞分泌功能的抑制效应.使孕酮分泌量增加,同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数增加.由此可见,cAMP 能通过诱导c-erbB2表达增强而提高卵巢P分泌.Verapamil是Ca2+通道阴断剂,实验观察到Verapamil能减少hCG刺激的黄体细胞孕酮分泌量,与反义c-erbB2ODN对黄体细胞分泌功能的抑制有协同作用,并使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数减少.可见,当细胞内Ca2+浓度下降时,c-erbB2的表达受抑制.蛋白抑制剂CYX与反义c-erbB2ODN的抑制效应也有明显的协同作用, 但是否说明原癌基因c-erbB2对黄体细胞孕酮分泌的调节是通过促进合成某种蛋白质实现的, 还是c-erbB蛋白自身具有此调节作用尚须进一步研究。
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*Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39660029)
作者单位：金萱(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
方廉(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
郑月慧(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
钟志胜(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
况海斌(江西医学院生理教研室, 南昌 330006)
参考文献
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Received 1999-04-29 Revised 1999-07-12, http://www.100md.com