血液流变活性药物的体外研究概况
作者：赵春景
单位：(第三军医大学附属西南医院药局) 重庆，400038
关键词：血液流变学；流变活性药物
第三军医大学学报990815 赵春景 综述 吴云鹏 审校
中图法分类号 R331.13;R91
In vitro test of blood rheologically active drugs: A review
药物流变学是药物学与流变学的交叉学科，旨在探索药物发挥作用的流变学机制，本文 就药物流变学研究的体外实验有关问题作一总结。
临床验证中的双盲法安慰剂对照研究是流变活性药物功效的最终试验，这些药物的体外 实验研究已经变得越来越主要，在寻找新药之临床前研究阶段以及临床研究阶段，流变学实 验能够补充临床结论。有关在临床前和临床试验阶段对药物进行流变学体外实验的作用如下 。
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临床前试验阶段：①发现现有药物的新用途；②确定化合物的流变学全貌(对RBC，WBC ，血小板，血浆蛋白的作用)；③对流变活性药物的同类物进行试验；④寻找具有流变活性 的新化合物；⑤在后继的临床试验中，确定合适的检验药物具有流变活性的方法。
临床试验阶段：①提供一个客观的结论；②证明药物在体内的流变学作用；③体现临床 效果与流变活性间的因果关系；④发觉不敏感人群；⑤确定量效关系和时间依赖性。
1 体外实验的原则
在设计制定评价药物临床前和临床研究的体外实验时必需遵循下列几条基本原则。
1.1 鉴定和分离靶细胞体
血液是一个混合的细胞群体，应对实验的细胞对象进行适当分离，流变活性药物可能作 用于红细胞，白细胞或血浆蛋白，亦或对它们都有作用，因而要求获得较纯的细胞群体，可 将全血经棉花过滤获得纯的红细胞，将全血经过密度梯度沉降以获得白细胞亚群，或通过低 速离心(400 g,5 min)获得富含血小板的血浆。
, 百拇医药
1.2 选择合适的药物浓度
很多药物研究时使用了较高浓度而体内不能达到如此高浓度，由于对到达靶细胞之药物 精确浓度不甚清楚，体外实验时使用的药物浓度应覆盖其发挥药效的药理学浓度范围，如同 体外流变学试验所需合适细胞浓度一样，药物与细胞的比例也很重要，在体外使用的药物浓 度应尽量调至体内药物与细胞相应的比例。
体外流变学研究时通常要将洗涤过的细胞悬浮在无蛋白质的缓冲液中，与体内富含蛋白 质的血浆相对比，由于在体内结合到血浆蛋白质上的药物相应地被体外结合到靶细胞质膜的药物代替，因而到达靶细胞群药物浓度较高。反之，如将白蛋白加入到缓冲液中，应考虑 到结合在白蛋白上的药物。缓冲液的特性也应考虑。有些缓冲液如磷酸盐和Tris能进入细胞 内增加细胞的体积，因而影响流变测量。一些缓冲液不能穿透细胞，如HEPES，作为缓冲液 相对优越些。
1.3 流变仪器和方法的选择
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不同流变学测定仪器灵敏度差异很大。同一仪器的不同参数的灵敏性亦差异很大，因此 选择使用仪器应多注意。为了提高不同实验室测量数据的可比性和结果的可靠性，应尽可能 按照国际血液标准化委员会关于血液流变学的规定和要求。
1.4 亚群分离
血液不仅是由混合的细胞群体组成，而且不同的细胞群体还由复杂的亚群组成。红细胞 按照其细胞阳离子浓度和含水量由轻到重密切排列，基于细胞年龄和ATP含量发挥其酶的活 性。白细胞由处于不同成熟期的不同细胞系组成，其成熟状态可以是静态或激活的。同样血 小板亚群依赖于其年龄和激活状态而存在。
不同亚群之间存在着流变差异，针对相应亚群流变学测量的技术包括密度梯度分离，或 当亚群在形态上可以识别时，如红细胞内含疟原，可采用微吸管吮吸法[1]。用于 单个细胞流变测量的仪器如红细胞刚性测量仪，细胞转移分析仪，已显示了一定作用。
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1.5 质量控制的要求
在临床研究中对药物流变参数的纵向研究必须严格实行质量控制，用于质量控制的流变 学方法仍处于初期，较简单的方法包括用正常样本来检测仪器的漂移情况，或设对照组及有 效治疗组。
1.6 药物对细胞膜和形态学的作用
亲脂性药物进入细胞膜脂质双层对细胞的形态和流变学发生根本影响，根据脂双层理论 这些药物有时间依赖关系，膨胀外层引起棘状红细胞症，然后进入内层引起裂口红细胞症。 经14C标记可以确定药物插入脂质双层的程度[2]，能以此方式改变细胞形状 的药物，将对红细胞的变形、聚集、沉降和粘滞产生不利影响。最显著的例子就是血管扩张 剂枸橼酸西替帝尔(cetiedil)，在低浓度时改善红细胞的变形性，而在高浓度时改变细胞膜 阳离子流动使细胞肿胀而失去变形能力[3]。
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2 其它试验是对流变学测量的补充
利用流变学试验在细胞水平证明药物的影响是非常重要的，但是其敏感性和专一性很有 限，比如说：阻止Ca2+流入和K+流出镰刀状红细胞的阳离子通道抑制剂能防止细胞 失水，研究其作用时可先将细胞脱水后，采用5 μm孔径的滤膜来定量测定细胞膜变形性的 序贯下降[3]。更为敏感的方法是用同位素如45Ca、86Rb标记， β-闪烁计数确定阳离子流动[4]，但使用流变学模型来证实其对完整细胞的作用 非常有用，两种方法可看作是互相补充。
3 采用动力学试验模型
处于代谢静止状态的静态细胞不适合用来研究药物的作用，采用适当的生理和代谢动力 模型可以增加流变学试验的敏感性和特异性。例如，对红细胞与内皮细胞粘附力测量的试验 中采用的是生理应力模型而不是静态模型[5]。非离子表面活性剂[6]对此 模型有抑制作用。
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抗镰药物的研究很困难，因为镰刀状细胞在其变形性、密度、年龄、膜性质和形态诸方 面有很大的异质性，然而采用密度梯度离心可以去除密度较大和不可逆的镰状细胞，剩下较 均匀的年轻细胞群体，体外在含钙的缓冲液中，经历还原和氧化的循环，来模拟在体内循环 时的复杂过程。这些年轻细胞将发生进行性的脱水，Ca2+通道抑制剂和钙激活K+流 动通道抑制剂，以及其它抗镰药物可用于研究对此模型中代谢应力的保护作用。
采用循环气体交换模拟体内代谢因力，可以扩展到局部贫血血管疾病，在那里循环的血 细胞暴露在低氧、低pH和/或高渗透压的环境中，在此情形下存在着的交替改变非常复杂， 并具有时间依赖性。这是因为局部贫血部位的低pH按照Gibbs-Donnan效应可引起细胞肿胀 ，随后经pH激活的KCl转移导致细胞K+丢失，细胞再次收缩[7]，局部贫血部位的 乳酸累积，由于渗透作用也引起细胞脱水。通过将正常红细胞重复多次置于低氧、酸性和含 有不同药物浓度的高渗透液中，采用循环气体交换可以验证药物的预防作用。这种体外的试 验模型要比血管疾病的静脉血样本接近病理，因为一旦离开局部贫血部位的代谢应力环境， 而循环到静脉抽血处，红细胞迅速恢复正常代谢和流变状态。
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4 不可预见性的药物作用
药物对血细胞流变学作用不可能总是能够借助药理文献而预料，并由此在体外以合适模 型进行实验。血管扩张剂和钙阻滞剂硝苯地平就是一个很好的例子，在兴奋组织这个二氢吡 啶类化合物能阻断Ca2+进入细胞，它对循环血细胞作用尚未广泛研究，除了能阻止Ca 2+流入红细胞外，它还是一个作用很强的Ca2+激活的K+通道抑制剂[4 ]。因此其作为抗镰药物的优势可能在于其血管扩张作用，Ca2+进入阻滞及K+流 动抑制作用之间的综合，在局部贫血血管疾病，硝苯地平的流变学作用很复杂，除了对红细 胞的作用外，对激活嗜中性白细胞与血管内皮细胞间的粘附有着浓度依赖性的抑制作用 [8]。
总之，流变活性药物的体外实验有着巨大的潜在优势，因为这些实验能解释流变学效应 和药物的作用。体外实验方法特别适合于一系列药物浓度的研究和寻找活性化合物如中草药 ，因其组成复杂，需经分离以寻找有效的类似物，在药物试验的预试阶段，流变学方法研究 药物对完整血细胞的功效非常优越，而生化和同位素研究往往是针对破碎细胞。
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在临床试验中对体外获得的血样进行试验来确定临床效果和流变学作用的关系很有价值 。另外流变学试验能补充临床结论，增加临床试验的价值，提供简易方法用于先导性研究， 证明新试化合物的作用。流变学方法在解释血管疾病的病理生理和确定合理有效药物治疗方 面具有优越性。
作者简介：赵春景，男，34岁，主管药师，博士
重庆大学生物工程研究院 重庆，400044
考文献
1 Nash G B, Obrien E, Gordon E C. Abnormalities in the mechanical flow properties of red blood cells caused by plasmodium falciparum. Blood,1989, 74(2):855
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2 Bilto Y Y, Ellory J C, Stuart J. Binding of oxpentifylline to the eryth rocyte membrane and effects on cell ATP, cation content, and membrane area. Clin Hemorheol,1988,8(3):901
3 Stuart J, Stone P C W, Billto Y Y,et al. Oxpentifylline and cetiedi l citrate improve deformability of dehydrated sickle cells. J Clin. Pathol,1987, 40(6):1182
4 Ellory J C, Nash G B, Stone P C W. et al. Mode of action and compar ative efficacy of pharmacological agents that inhibit calcium-dependent dehydra tion of sickle cells. Br J Pharmacol,1992,106(4):972
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5 Nash G B, Cooke B M, Marsh K,et al. Rheological analysis of the adh esive interactions of red blood cells parasitised by plasmodium falciparum. Bloo d,1992,79(2):798
6 Carterl C, Fisher T C, Hamai H, et al. Haemorheological effects of a nonionic copolymer surfactant (Poloxamer 188). Clin Hemorheol,1992,12(1):109
7 Ellory J C, Hall A C, Amess J A. Passive potassium transport in human r ed cells. Biochim Acta,1987,46(2-3):S31
8 Perry I, Buttrum S M, Cooke B M, et al. Adhesion of neutrophils to unstimulated, cultured endothelium under the influence of flow. Int J Microcirc Clin Exper,1992,12(Suppl 1):103
(收稿：1999-01-08；修回：1999-04-21), 百拇医药
单位：(第三军医大学附属西南医院药局) 重庆，400038
关键词：血液流变学；流变活性药物
第三军医大学学报990815 赵春景 综述 吴云鹏 审校
中图法分类号 R331.13;R91
In vitro test of blood rheologically active drugs: A review
药物流变学是药物学与流变学的交叉学科，旨在探索药物发挥作用的流变学机制，本文 就药物流变学研究的体外实验有关问题作一总结。
临床验证中的双盲法安慰剂对照研究是流变活性药物功效的最终试验，这些药物的体外 实验研究已经变得越来越主要，在寻找新药之临床前研究阶段以及临床研究阶段，流变学实 验能够补充临床结论。有关在临床前和临床试验阶段对药物进行流变学体外实验的作用如下 。
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临床前试验阶段：①发现现有药物的新用途；②确定化合物的流变学全貌(对RBC，WBC ，血小板，血浆蛋白的作用)；③对流变活性药物的同类物进行试验；④寻找具有流变活性 的新化合物；⑤在后继的临床试验中，确定合适的检验药物具有流变活性的方法。
临床试验阶段：①提供一个客观的结论；②证明药物在体内的流变学作用；③体现临床 效果与流变活性间的因果关系；④发觉不敏感人群；⑤确定量效关系和时间依赖性。
1 体外实验的原则
在设计制定评价药物临床前和临床研究的体外实验时必需遵循下列几条基本原则。
1.1 鉴定和分离靶细胞体
血液是一个混合的细胞群体，应对实验的细胞对象进行适当分离，流变活性药物可能作 用于红细胞，白细胞或血浆蛋白，亦或对它们都有作用，因而要求获得较纯的细胞群体，可 将全血经棉花过滤获得纯的红细胞，将全血经过密度梯度沉降以获得白细胞亚群，或通过低 速离心(400 g,5 min)获得富含血小板的血浆。
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1.2 选择合适的药物浓度
很多药物研究时使用了较高浓度而体内不能达到如此高浓度，由于对到达靶细胞之药物 精确浓度不甚清楚，体外实验时使用的药物浓度应覆盖其发挥药效的药理学浓度范围，如同 体外流变学试验所需合适细胞浓度一样，药物与细胞的比例也很重要，在体外使用的药物浓 度应尽量调至体内药物与细胞相应的比例。
体外流变学研究时通常要将洗涤过的细胞悬浮在无蛋白质的缓冲液中，与体内富含蛋白 质的血浆相对比，由于在体内结合到血浆蛋白质上的药物相应地被体外结合到靶细胞质膜的药物代替，因而到达靶细胞群药物浓度较高。反之，如将白蛋白加入到缓冲液中，应考虑 到结合在白蛋白上的药物。缓冲液的特性也应考虑。有些缓冲液如磷酸盐和Tris能进入细胞 内增加细胞的体积，因而影响流变测量。一些缓冲液不能穿透细胞，如HEPES，作为缓冲液 相对优越些。
1.3 流变仪器和方法的选择
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不同流变学测定仪器灵敏度差异很大。同一仪器的不同参数的灵敏性亦差异很大，因此 选择使用仪器应多注意。为了提高不同实验室测量数据的可比性和结果的可靠性，应尽可能 按照国际血液标准化委员会关于血液流变学的规定和要求。
1.4 亚群分离
血液不仅是由混合的细胞群体组成，而且不同的细胞群体还由复杂的亚群组成。红细胞 按照其细胞阳离子浓度和含水量由轻到重密切排列，基于细胞年龄和ATP含量发挥其酶的活 性。白细胞由处于不同成熟期的不同细胞系组成，其成熟状态可以是静态或激活的。同样血 小板亚群依赖于其年龄和激活状态而存在。
不同亚群之间存在着流变差异，针对相应亚群流变学测量的技术包括密度梯度分离，或 当亚群在形态上可以识别时，如红细胞内含疟原，可采用微吸管吮吸法[1]。用于 单个细胞流变测量的仪器如红细胞刚性测量仪，细胞转移分析仪，已显示了一定作用。
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1.5 质量控制的要求
在临床研究中对药物流变参数的纵向研究必须严格实行质量控制，用于质量控制的流变 学方法仍处于初期，较简单的方法包括用正常样本来检测仪器的漂移情况，或设对照组及有 效治疗组。
1.6 药物对细胞膜和形态学的作用
亲脂性药物进入细胞膜脂质双层对细胞的形态和流变学发生根本影响，根据脂双层理论 这些药物有时间依赖关系，膨胀外层引起棘状红细胞症，然后进入内层引起裂口红细胞症。 经14C标记可以确定药物插入脂质双层的程度[2]，能以此方式改变细胞形状 的药物，将对红细胞的变形、聚集、沉降和粘滞产生不利影响。最显著的例子就是血管扩张 剂枸橼酸西替帝尔(cetiedil)，在低浓度时改善红细胞的变形性，而在高浓度时改变细胞膜 阳离子流动使细胞肿胀而失去变形能力[3]。
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2 其它试验是对流变学测量的补充
利用流变学试验在细胞水平证明药物的影响是非常重要的，但是其敏感性和专一性很有 限，比如说：阻止Ca2+流入和K+流出镰刀状红细胞的阳离子通道抑制剂能防止细胞 失水，研究其作用时可先将细胞脱水后，采用5 μm孔径的滤膜来定量测定细胞膜变形性的 序贯下降[3]。更为敏感的方法是用同位素如45Ca、86Rb标记， β-闪烁计数确定阳离子流动[4]，但使用流变学模型来证实其对完整细胞的作用 非常有用，两种方法可看作是互相补充。
3 采用动力学试验模型
处于代谢静止状态的静态细胞不适合用来研究药物的作用，采用适当的生理和代谢动力 模型可以增加流变学试验的敏感性和特异性。例如，对红细胞与内皮细胞粘附力测量的试验 中采用的是生理应力模型而不是静态模型[5]。非离子表面活性剂[6]对此 模型有抑制作用。
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抗镰药物的研究很困难，因为镰刀状细胞在其变形性、密度、年龄、膜性质和形态诸方 面有很大的异质性，然而采用密度梯度离心可以去除密度较大和不可逆的镰状细胞，剩下较 均匀的年轻细胞群体，体外在含钙的缓冲液中，经历还原和氧化的循环，来模拟在体内循环 时的复杂过程。这些年轻细胞将发生进行性的脱水，Ca2+通道抑制剂和钙激活K+流 动通道抑制剂，以及其它抗镰药物可用于研究对此模型中代谢应力的保护作用。
采用循环气体交换模拟体内代谢因力，可以扩展到局部贫血血管疾病，在那里循环的血 细胞暴露在低氧、低pH和/或高渗透压的环境中，在此情形下存在着的交替改变非常复杂， 并具有时间依赖性。这是因为局部贫血部位的低pH按照Gibbs-Donnan效应可引起细胞肿胀 ，随后经pH激活的KCl转移导致细胞K+丢失，细胞再次收缩[7]，局部贫血部位的 乳酸累积，由于渗透作用也引起细胞脱水。通过将正常红细胞重复多次置于低氧、酸性和含 有不同药物浓度的高渗透液中，采用循环气体交换可以验证药物的预防作用。这种体外的试 验模型要比血管疾病的静脉血样本接近病理，因为一旦离开局部贫血部位的代谢应力环境， 而循环到静脉抽血处，红细胞迅速恢复正常代谢和流变状态。
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4 不可预见性的药物作用
药物对血细胞流变学作用不可能总是能够借助药理文献而预料，并由此在体外以合适模 型进行实验。血管扩张剂和钙阻滞剂硝苯地平就是一个很好的例子，在兴奋组织这个二氢吡 啶类化合物能阻断Ca2+进入细胞，它对循环血细胞作用尚未广泛研究，除了能阻止Ca 2+流入红细胞外，它还是一个作用很强的Ca2+激活的K+通道抑制剂[4 ]。因此其作为抗镰药物的优势可能在于其血管扩张作用，Ca2+进入阻滞及K+流 动抑制作用之间的综合，在局部贫血血管疾病，硝苯地平的流变学作用很复杂，除了对红细 胞的作用外，对激活嗜中性白细胞与血管内皮细胞间的粘附有着浓度依赖性的抑制作用 [8]。
总之，流变活性药物的体外实验有着巨大的潜在优势，因为这些实验能解释流变学效应 和药物的作用。体外实验方法特别适合于一系列药物浓度的研究和寻找活性化合物如中草药 ，因其组成复杂，需经分离以寻找有效的类似物，在药物试验的预试阶段，流变学方法研究 药物对完整血细胞的功效非常优越，而生化和同位素研究往往是针对破碎细胞。
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在临床试验中对体外获得的血样进行试验来确定临床效果和流变学作用的关系很有价值 。另外流变学试验能补充临床结论，增加临床试验的价值，提供简易方法用于先导性研究， 证明新试化合物的作用。流变学方法在解释血管疾病的病理生理和确定合理有效药物治疗方 面具有优越性。
作者简介：赵春景，男，34岁，主管药师，博士
重庆大学生物工程研究院 重庆，400044
考文献
1 Nash G B, Obrien E, Gordon E C. Abnormalities in the mechanical flow properties of red blood cells caused by plasmodium falciparum. Blood,1989, 74(2):855
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2 Bilto Y Y, Ellory J C, Stuart J. Binding of oxpentifylline to the eryth rocyte membrane and effects on cell ATP, cation content, and membrane area. Clin Hemorheol,1988,8(3):901
3 Stuart J, Stone P C W, Billto Y Y,et al. Oxpentifylline and cetiedi l citrate improve deformability of dehydrated sickle cells. J Clin. Pathol,1987, 40(6):1182
4 Ellory J C, Nash G B, Stone P C W. et al. Mode of action and compar ative efficacy of pharmacological agents that inhibit calcium-dependent dehydra tion of sickle cells. Br J Pharmacol,1992,106(4):972
, http://www.100md.com
5 Nash G B, Cooke B M, Marsh K,et al. Rheological analysis of the adh esive interactions of red blood cells parasitised by plasmodium falciparum. Bloo d,1992,79(2):798
6 Carterl C, Fisher T C, Hamai H, et al. Haemorheological effects of a nonionic copolymer surfactant (Poloxamer 188). Clin Hemorheol,1992,12(1):109
7 Ellory J C, Hall A C, Amess J A. Passive potassium transport in human r ed cells. Biochim Acta,1987,46(2-3):S31
8 Perry I, Buttrum S M, Cooke B M, et al. Adhesion of neutrophils to unstimulated, cultured endothelium under the influence of flow. Int J Microcirc Clin Exper,1992,12(Suppl 1):103
(收稿：1999-01-08；修回：1999-04-21), 百拇医药