心肌缺血预处理延迟保护作用的实验研究
作者：冉擘力* 司良毅** 王国超
单位：重庆第三军医大学西南医院(400038)心内科
关键词：缺血预处理；细胞间粘附分子-1；超氧化物歧化酶
心肺血管病杂志9901223 摘要 本实验旨在探讨心肌缺血预处理延迟保护的作用机制。采用大鼠心脏缺血预处理模型，检测缺血预处理后即刻、12、24、48和72h各时相点再行心肌缺血1h复灌12h时心肌细胞间粘附分子(ICAM-1)的表达及心肌梗塞范围、超氧化物歧化酶(SOD)含量及白细胞(PMNs)浸润数的变化。结果显示，与单纯缺血再灌注组比较，预处理后24～72h ICAM-1表达明显减少，SOD含量增高，PMN浸润数减少，心肌梗塞范围缩小(P<0.05)，以48h最显著。本实验表明，预处理后24～72h心肌对再次长时间缺血/再灌注的损伤有保护作用，其产生可能与ICAM-1表达降低所介导的PMNs浸润减少及SOD含量增加有关。
, 百拇医药
Experimental Study on the Delayed Protection of Myocardial
Ischemic Preconditioning
Ran Boli,Si Liangyi,Wang Guochao
Department of Cardiology,Southwest Hosptial,Third Military Medical
University of PLA,Chongqing(400038)
Abstract This experiment is attempt to explore the mechanism of delayed protection (DP) of ischemic preconditioning(IPC).In the IPC model,myocardial expression of intercellar adhesion molecules(ICAM-1),the content of superoxides dismutase(SOD),polymorphonuclear leukocytes(PMNs) and the infarct size were detemined at the end of 1h myocardial ischemia followed by 12h reperfusion after IPC 0,12h,24h,48h,72h.The results showed that in IPC group,ICAM-1 expression,PMN infiltration and infarct size were significantly decreased and SOD contents were increased as compared with that in I/R(Ischemia/Reperfusion) group P<0.05.The most significant difference occur at 48h after IPC. but no difference was observed at 12h after IPC.So we concluded that DP was induced by IPC occur at 24～72 hours after IPC ,and that was associated with the decreased ICAM-1 expression and PMNs infiltration,and increased SOD contents .
, 百拇医药
Key words： Ischemic preconditioning; Intercellar adhesion molecules-1; Superoxides dismutase
缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)的保护作用在预处理后即刻出现，持续2～3h消失。而24h后可重现，并持续数日，称为延迟保护作用(delayed protection,DP)[1]，其产生机制尚未阐明。研究显示，细胞间粘附分子(intercellar adhesion molecules-1,ICAM-1)和IPC两者对细胞的刺激信号均遵循同一信号通路而影响核基因的转录及表达[2]。DP的产生是否与IPC影响心肌ICAM-1的表达有关，极需证实。由于超氧化物歧化酶(superoxides dismutase,SOD)是氧自由基清除剂，与IPC心肌保护作用密切相关。本实验通过大鼠心肌缺血预处理模型，观察IPC后24～72h，ICAM-1的表达和SOD含量、中性白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMNs)侵润数变化规律及其与心梗面积的关系，探讨DP的发生机制。
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材料与方法
1.动物模型及实验分组 成年Wistar大鼠55只，雌雄不限，体重250±30g(第三军医大学动物中心供应)。用5%戊巴比妥纳30mg/kg腹腔注射，麻醉后，气管切开插管，呼吸机控制呼吸，沿胸骨左缘2～5肋开胸暴露左冠状动脉，于主干下1/3处穿线备结扎用。在结扎线的两端分别套入丝线环作为再灌注拉线，收紧结扎线以造成心肌缺血，牵拉再灌注线使结扎线放松后即行再灌注。以收紧结扎线后与QRS波融合的S-T段抬高，放松后S-T段下降1/2以上为模型成功。随机分组：(1)假手术对照组(sham)，完成全部操作，只穿线不结扎，观察13h作总体对照，(2)预处理组(IPC)，先结扎左冠脉5min，松解后再灌注10min,反复2次，关胸后于0、12、48、72h各时相点再行缺血1h再灌注12h。(3)单纯缺血再灌注组(I/R)，仅于上述各时相点缺血1h，再灌注12h。于各时相点活杀动物，摘取心脏，留取左心室，随机等分为3份备用。
2.主要试剂 ICAM-1单克隆抗体购于美国G&D公司，SOD试剂盒购于南京建成生物制品研究所，SP免疫组化试剂盒购于福建迈新公司。其它试剂均为分析纯级。
, 百拇医药
3.指标测定 (1)ICAM-1的测定：用SP免疫组化染色方法进行测定，以DAB显色，阳性反应颗粒呈棕黄色，用CMIAS 007医学图像分析仪进行半定量分析，结果用面密度(目标总面积/目标场总面积)表示。(2)心肌梗塞范围用TTC染色法测定，梗塞区呈灰白色，以称重法计算心肌梗塞范围。(3)心肌SOD测定：用邻苯三酚自氧化法[4]进行测定。(4)心肌PMNs浸润数测定：参照Bradely[5]方法，利用每个PMN中含MPO量是固定的特性，通过公式计算PMN浸润数。1单位MPO=1.385×106个PMNs。
4.统计学处理 采用单因素方差分析，用SPMR软件(第三军医大学统计学教研室)进行处理，结果以
±s表示，结果
1. 心肌组织ICAM-1表达的变化规律(表1)。
, 百拇医药
表1 心肌ICAM-1表达量(面密度)的变化(各时相点n=5,±s) 组别
时相点(h)
0
12
24
48
72
对照组
0.011±0.003
缺血再灌组
0.116±0.032*
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0.115±0.035*
0.114±0.038**
0.116±0.040
0.116±0.042*
预处理组
0.111±0.028*
0.108±0.025*
0.074±0.007*+
0.064±0.003*++
, http://www.100md.com 0.072±0.002*+
注：与对照组比较*P<0.01，与缺血再灌注组比较 +P<0.05,++P<0.01
IPC组和I/R组虽然于I/R后ICAM-1表达均较对照组明显增多，但增多程度IPC组明显减轻，2组比较，在预处理后24～72h差异显著，IPC组ICAM-1的表达明显低于I/R组，P<0.05，以48h差异最明显P<0.01，而预处理后即刻、12h差异不显著(P>0.05)。
2. 心肌组织SOD含量变化规律(表2)。
表2 心肌组织SOD含量(NU/mg.pro)变化(各时相点n=5,±s) 组别
时相点(h)
, http://www.100md.com
0
12
24
48
72
对照组
67.22±4.61
缺血再灌组
15.66±4.01*
15.20±4.52*
16.34±5.23*
14.98±5.02*
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15.07±4.25*
预处理组
33.84±2.44*
18.39±3.32*
42.30±2.84*+
48.66±2.98*++
38.44±3.73*+
注：与对照组比较*P<0.01，与缺血再灌组比较 +P<0.05，++P<0.01
IPC组和I/R组虽然于I/R后SOD含量均较对照组明显下降(P<0.05)，但降低幅度IPC组明显减轻，2组间比较，预处理后即刻、24～72h SOD含量差异显著(P<0.05)，以48h差异最显著(P<0.01),而预处理后12h SOD含量则无显著差异(P>0.05)。
, 百拇医药
3. 心肌PMN浸润数变化规律(表3)。
表3 心肌组织PMN浸润数的变化(104/g.wt，各时相点n=5,±s) 组别
时相点(h)
0
12
24
48
72
对照组
0.158±0.016
, 百拇医药
缺血再灌组
1.426±0.083*
1.331±0.074*
1.331±0.090*
1.385±0.062*
1.358±0.043*
预处理组
1.021±0.059*+
1.334±0.058*
1.025±0.071*+
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0.880±0.065*++
1.046±0.047*+
注：与对照比较*P<0.01,与缺血再灌注组比较+P<0.05,++P<0.01
IPC组和I/R组尽管于I/R后PMN浸润数均较对照组升高(P<0.05)，但IPC组升幅明显低于I/R组，2组间比较，IPC组在0、24～72h PMN 浸润数明显降低，P<0.05,以48h下降更为明显(P<0.01)，而在12h时则差异不明显(P>0.05)。
4 心肌梗塞面积的变化规律(表4)。
表4 心肌梗塞面积(梗塞区/左室，湿重%)的变化(各时相点n=5,±s) 组别
, 百拇医药
时相点(h)
0
12
24
48
72
缺血再灌组
23.5±5.64
24.4±6.33
24.8±4.78
22.7±5.20
25.0±6.84
预处理组
, 百拇医药
12.4±2.57*
22.8±5.06
12.9±3.32*+
12.5±2.86**
13.4±4.21*
注：与缺血再灌注组比较*P<0.05,**P<0.01
缺血预处理后即刻、24～72h心肌梗塞面积减少，与单纯I/R组比较，减少50.0%～55.1%(P<0.05～0.01),而预处理后12h心梗范围与单纯I/R组比较无减少(P>0.05)。
讨论
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预处理的延迟保护现象在犬、兔、大鼠等模型上都获得证实[1～3]，但机制仍不清楚。由于预处理的延迟保护作用较早期保护作用持久，近来受到高度重视，文献报道[1，2]，预处理后24～72h心肌热休克蛋白，SOD等内源性保护物质合成增加，当阻断这些蛋白的表达，则预处理后延迟保护作用消失[6]，推测预处理诱导内源性蛋白类保护物质合成增加，可能是延迟保护作用的物质基础，这与本实验结果发现预处理延迟相中SOD含量显著增加所致的心肌梗塞面积减小是相符的。然而，DP的产生是否与某些介导细胞损伤的物质的表达下降有关尚不清楚。研究显示，ICAM-1是一种很强的蛋白类致损因子，在缺血和再灌注损伤中，细胞粘附分子介导了PMNs与内皮细胞粘附，PMNs内皮下迁移而导致细胞损伤，使用单克隆抗体抑制ICAM-1表达而阻断PMNs的粘附及用SOD均可有效地限制再灌注期心肌梗塞范围的扩大[7]。预处理的保护作用是否与ICAM-1表达下降有关尚不清楚。研究表明，ICAM-1和预处理两者对细胞的刺激信号均通过同一信号途径而传递到细胞核，影响核内基因的转录。两者均刺激蛋白酪氨酸激酶激活Ras-GTP，再激活Raf-1，后者进一步激活丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)，最后通过转录因子STAT传递到细胞核，影响核内基因的转录，而MAPK和PKC均参与了预处理的延迟保护作用[8，9]。本实验结果显示，预处理后24～72h ICAM-1的表达明显减少，从而证实了预处理确可减少ICAM-1的表达，这可能是由于缺血预处理刺激了内皮细胞膜上ICAM-1，其信号通过上述传导途径反馈性的影响了ICAM-1mRNA的转录，使其在后期ICAM-1蛋白质表达明显减少，导致PMNs浸润数量下降，心肌细胞坏死程度减轻，心肌梗塞范围明显缩小。
, 百拇医药
研究结果提示：缺血预处理可能一方面通过诱导SODmRNA的转录，使预处理延迟相中其蛋白质的表达显著增加。另一方面，又通过抑制内皮细胞膜上ICAM-1mRNA的转录，使其后期蛋白质合成下降，从而使PMNs浸润数明显减少，缺血再灌注所致的无复流现象明显减轻，心肌坏死程度得到明显改善，这可能是缺血预处理产生心肌延迟保护作用的机制之一。
* 硕士研究生
** 导师
参考文献
[1] Marber M S,Latchman DS,Walker JM,et al.Cardiac stress protein elevation 24 hours after brief ischemia or heat stress is associated with resistance to myocardial infarction. Circulation, 1993, 88:1264～1272.
, 百拇医药
[2] Hoshida S,Kuzuya T,Fuji H,et al.Sublethel ischemia alters myocardial antioxidantactivity in canine heart.Am J Physiol,1993,264:33～39.
[3] Ahn NG.The MAP kinase cascade:discovery of a
new signal transduction pathway.Mol Cell Biochem, 1993,127/128:201～209.
[4] Oyanagui Y:Reevaluation of assay methods and establishnent of kit for superoxide dismutase activity.Annal Biochem,1984,142:290～311.
, 百拇医药
[5] Bradely PP,Priebat DA,Christensen RD,et al.Measurement of cutaneous inflammation:estimation of neutrophil content with an enzyme marker.J Invest Dermatol ,1982,78:206～209.
[6] Yamashita N,Nishidn M,Hoshida S, et al. Induction of manganese superoxide dismutase in rat cardiac myocytes increases to lerance to hypoxia 24 hours after preconditioning. J Clin Invest ,1994,94:2193～2199.
[7] Lehtr HA,Menger MD,Messmer K.Impact of leukocyte adhesion on myocardial ischemia/reperfusion injury:conceivable mechanisms and proven facts.J Lab Clin Med ,1993,121:539～545.
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[8] Barxter GF,Goma FM,Yellon DM,et al.Involvement of protein kinase c in the delayed cytoprotection following sublethal ischemia in rabbit myocardium.Br J Phamac,1995,115:222～224.
[9] 张钧华，陈魁，陈健，等.丝裂素活化蛋白激酶参与缺血预适应的延迟保护作用.中华心血管病杂志，1997，25：215～218.
(1998-04-28收稿)
(1998-07-10修回), 百拇医药(冉擘力* 司良毅** 王国超)
单位：重庆第三军医大学西南医院(400038)心内科
关键词：缺血预处理；细胞间粘附分子-1；超氧化物歧化酶
心肺血管病杂志9901223 摘要 本实验旨在探讨心肌缺血预处理延迟保护的作用机制。采用大鼠心脏缺血预处理模型，检测缺血预处理后即刻、12、24、48和72h各时相点再行心肌缺血1h复灌12h时心肌细胞间粘附分子(ICAM-1)的表达及心肌梗塞范围、超氧化物歧化酶(SOD)含量及白细胞(PMNs)浸润数的变化。结果显示，与单纯缺血再灌注组比较，预处理后24～72h ICAM-1表达明显减少，SOD含量增高，PMN浸润数减少，心肌梗塞范围缩小(P<0.05)，以48h最显著。本实验表明，预处理后24～72h心肌对再次长时间缺血/再灌注的损伤有保护作用，其产生可能与ICAM-1表达降低所介导的PMNs浸润减少及SOD含量增加有关。
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Experimental Study on the Delayed Protection of Myocardial
Ischemic Preconditioning
Ran Boli,Si Liangyi,Wang Guochao
Department of Cardiology,Southwest Hosptial,Third Military Medical
University of PLA,Chongqing(400038)
Abstract This experiment is attempt to explore the mechanism of delayed protection (DP) of ischemic preconditioning(IPC).In the IPC model,myocardial expression of intercellar adhesion molecules(ICAM-1),the content of superoxides dismutase(SOD),polymorphonuclear leukocytes(PMNs) and the infarct size were detemined at the end of 1h myocardial ischemia followed by 12h reperfusion after IPC 0,12h,24h,48h,72h.The results showed that in IPC group,ICAM-1 expression,PMN infiltration and infarct size were significantly decreased and SOD contents were increased as compared with that in I/R(Ischemia/Reperfusion) group P<0.05.The most significant difference occur at 48h after IPC. but no difference was observed at 12h after IPC.So we concluded that DP was induced by IPC occur at 24～72 hours after IPC ,and that was associated with the decreased ICAM-1 expression and PMNs infiltration,and increased SOD contents .
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Key words： Ischemic preconditioning; Intercellar adhesion molecules-1; Superoxides dismutase
缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)的保护作用在预处理后即刻出现，持续2～3h消失。而24h后可重现，并持续数日，称为延迟保护作用(delayed protection,DP)[1]，其产生机制尚未阐明。研究显示，细胞间粘附分子(intercellar adhesion molecules-1,ICAM-1)和IPC两者对细胞的刺激信号均遵循同一信号通路而影响核基因的转录及表达[2]。DP的产生是否与IPC影响心肌ICAM-1的表达有关，极需证实。由于超氧化物歧化酶(superoxides dismutase,SOD)是氧自由基清除剂，与IPC心肌保护作用密切相关。本实验通过大鼠心肌缺血预处理模型，观察IPC后24～72h，ICAM-1的表达和SOD含量、中性白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMNs)侵润数变化规律及其与心梗面积的关系，探讨DP的发生机制。
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材料与方法
1.动物模型及实验分组 成年Wistar大鼠55只，雌雄不限，体重250±30g(第三军医大学动物中心供应)。用5%戊巴比妥纳30mg/kg腹腔注射，麻醉后，气管切开插管，呼吸机控制呼吸，沿胸骨左缘2～5肋开胸暴露左冠状动脉，于主干下1/3处穿线备结扎用。在结扎线的两端分别套入丝线环作为再灌注拉线，收紧结扎线以造成心肌缺血，牵拉再灌注线使结扎线放松后即行再灌注。以收紧结扎线后与QRS波融合的S-T段抬高，放松后S-T段下降1/2以上为模型成功。随机分组：(1)假手术对照组(sham)，完成全部操作，只穿线不结扎，观察13h作总体对照，(2)预处理组(IPC)，先结扎左冠脉5min，松解后再灌注10min,反复2次，关胸后于0、12、48、72h各时相点再行缺血1h再灌注12h。(3)单纯缺血再灌注组(I/R)，仅于上述各时相点缺血1h，再灌注12h。于各时相点活杀动物，摘取心脏，留取左心室，随机等分为3份备用。
2.主要试剂 ICAM-1单克隆抗体购于美国G&D公司，SOD试剂盒购于南京建成生物制品研究所，SP免疫组化试剂盒购于福建迈新公司。其它试剂均为分析纯级。
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3.指标测定 (1)ICAM-1的测定：用SP免疫组化染色方法进行测定，以DAB显色，阳性反应颗粒呈棕黄色，用CMIAS 007医学图像分析仪进行半定量分析，结果用面密度(目标总面积/目标场总面积)表示。(2)心肌梗塞范围用TTC染色法测定，梗塞区呈灰白色，以称重法计算心肌梗塞范围。(3)心肌SOD测定：用邻苯三酚自氧化法[4]进行测定。(4)心肌PMNs浸润数测定：参照Bradely[5]方法，利用每个PMN中含MPO量是固定的特性，通过公式计算PMN浸润数。1单位MPO=1.385×106个PMNs。
4.统计学处理 采用单因素方差分析，用SPMR软件(第三军医大学统计学教研室)进行处理，结果以
±s表示，结果1. 心肌组织ICAM-1表达的变化规律(表1)。
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表1 心肌ICAM-1表达量(面密度)的变化(各时相点n=5,
±s) 组别时相点(h)
0
12
24
48
72
对照组
0.011±0.003
缺血再灌组
0.116±0.032*
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0.115±0.035*
0.114±0.038**
0.116±0.040
0.116±0.042*
预处理组
0.111±0.028*
0.108±0.025*
0.074±0.007*+
0.064±0.003*++
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注：与对照组比较*P<0.01，与缺血再灌注组比较 +P<0.05,++P<0.01
IPC组和I/R组虽然于I/R后ICAM-1表达均较对照组明显增多，但增多程度IPC组明显减轻，2组比较，在预处理后24～72h差异显著，IPC组ICAM-1的表达明显低于I/R组，P<0.05，以48h差异最明显P<0.01，而预处理后即刻、12h差异不显著(P>0.05)。
2. 心肌组织SOD含量变化规律(表2)。
表2 心肌组织SOD含量(NU/mg.pro)变化(各时相点n=5,
±s) 组别时相点(h)
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0
12
24
48
72
对照组
67.22±4.61
缺血再灌组
15.66±4.01*
15.20±4.52*
16.34±5.23*
14.98±5.02*
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15.07±4.25*
预处理组
33.84±2.44*
18.39±3.32*
42.30±2.84*+
48.66±2.98*++
38.44±3.73*+
注：与对照组比较*P<0.01，与缺血再灌组比较 +P<0.05，++P<0.01
IPC组和I/R组虽然于I/R后SOD含量均较对照组明显下降(P<0.05)，但降低幅度IPC组明显减轻，2组间比较，预处理后即刻、24～72h SOD含量差异显著(P<0.05)，以48h差异最显著(P<0.01),而预处理后12h SOD含量则无显著差异(P>0.05)。
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3. 心肌PMN浸润数变化规律(表3)。
表3 心肌组织PMN浸润数的变化(104/g.wt，各时相点n=5,
±s) 组别时相点(h)
0
12
24
48
72
对照组
0.158±0.016
, 百拇医药
缺血再灌组
1.426±0.083*
1.331±0.074*
1.331±0.090*
1.385±0.062*
1.358±0.043*
预处理组
1.021±0.059*+
1.334±0.058*
1.025±0.071*+
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0.880±0.065*++
1.046±0.047*+
注：与对照比较*P<0.01,与缺血再灌注组比较+P<0.05,++P<0.01
IPC组和I/R组尽管于I/R后PMN浸润数均较对照组升高(P<0.05)，但IPC组升幅明显低于I/R组，2组间比较，IPC组在0、24～72h PMN 浸润数明显降低，P<0.05,以48h下降更为明显(P<0.01)，而在12h时则差异不明显(P>0.05)。
4 心肌梗塞面积的变化规律(表4)。
表4 心肌梗塞面积(梗塞区/左室，湿重%)的变化(各时相点n=5,
±s) 组别, 百拇医药
时相点(h)
0
12
24
48
72
缺血再灌组
23.5±5.64
24.4±6.33
24.8±4.78
22.7±5.20
25.0±6.84
预处理组
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12.4±2.57*
22.8±5.06
12.9±3.32*+
12.5±2.86**
13.4±4.21*
注：与缺血再灌注组比较*P<0.05,**P<0.01
缺血预处理后即刻、24～72h心肌梗塞面积减少，与单纯I/R组比较，减少50.0%～55.1%(P<0.05～0.01),而预处理后12h心梗范围与单纯I/R组比较无减少(P>0.05)。
讨论
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预处理的延迟保护现象在犬、兔、大鼠等模型上都获得证实[1～3]，但机制仍不清楚。由于预处理的延迟保护作用较早期保护作用持久，近来受到高度重视，文献报道[1，2]，预处理后24～72h心肌热休克蛋白，SOD等内源性保护物质合成增加，当阻断这些蛋白的表达，则预处理后延迟保护作用消失[6]，推测预处理诱导内源性蛋白类保护物质合成增加，可能是延迟保护作用的物质基础，这与本实验结果发现预处理延迟相中SOD含量显著增加所致的心肌梗塞面积减小是相符的。然而，DP的产生是否与某些介导细胞损伤的物质的表达下降有关尚不清楚。研究显示，ICAM-1是一种很强的蛋白类致损因子，在缺血和再灌注损伤中，细胞粘附分子介导了PMNs与内皮细胞粘附，PMNs内皮下迁移而导致细胞损伤，使用单克隆抗体抑制ICAM-1表达而阻断PMNs的粘附及用SOD均可有效地限制再灌注期心肌梗塞范围的扩大[7]。预处理的保护作用是否与ICAM-1表达下降有关尚不清楚。研究表明，ICAM-1和预处理两者对细胞的刺激信号均通过同一信号途径而传递到细胞核，影响核内基因的转录。两者均刺激蛋白酪氨酸激酶激活Ras-GTP，再激活Raf-1，后者进一步激活丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)，最后通过转录因子STAT传递到细胞核，影响核内基因的转录，而MAPK和PKC均参与了预处理的延迟保护作用[8，9]。本实验结果显示，预处理后24～72h ICAM-1的表达明显减少，从而证实了预处理确可减少ICAM-1的表达，这可能是由于缺血预处理刺激了内皮细胞膜上ICAM-1，其信号通过上述传导途径反馈性的影响了ICAM-1mRNA的转录，使其在后期ICAM-1蛋白质表达明显减少，导致PMNs浸润数量下降，心肌细胞坏死程度减轻，心肌梗塞范围明显缩小。
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研究结果提示：缺血预处理可能一方面通过诱导SODmRNA的转录，使预处理延迟相中其蛋白质的表达显著增加。另一方面，又通过抑制内皮细胞膜上ICAM-1mRNA的转录，使其后期蛋白质合成下降，从而使PMNs浸润数明显减少，缺血再灌注所致的无复流现象明显减轻，心肌坏死程度得到明显改善，这可能是缺血预处理产生心肌延迟保护作用的机制之一。
* 硕士研究生
** 导师
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(1998-04-28收稿)
(1998-07-10修回), 百拇医药(冉擘力* 司良毅** 王国超)