外源性P53和Rb基因对血管平滑肌细胞迁移的影响*
作者：满 咏 王 抒 黎 健
单位：卫生部北京老年医学研究所 卫生部老年医学重点实验室(100730)
关键词：血管平滑肌细胞；迁移；P53基因；Rb基因
心肺心血病杂志990103 摘要 为研究外源性P53和Rb基因对血管平滑肌细胞迁移的影响，体外培养人脐动脉平滑肌细胞，将P53基因和Rb基因重组腺病毒载体转染平滑肌细胞72h后，检测平滑肌细胞的迁移。结果显示，对照组平滑肌细胞的迁移距离为0.84±0.36 cm(
±S)，而P53基因转染组和Rb基因转染组的细胞迁移距离分别为0.53±0.45 cm和0.37±0.29 cm，显著低于对照组(P<0.05,P<0.001)。提示外源性P53基因和Rb基因导入可显著抑制血管平滑肌细胞迁移。
, 百拇医药
Effect of Exogenous P53Gene and Rb Gene on Migration
of Vascular Smooth Muscle Cells
Man Yong,Wang Shu,Li Jian
Department of Biochemistry,Beijing Institute of Geriatrics (100730)
Abstract To study the effect of exogenous P53 gene and Rb gene on migration of vascular smooth muscle cells(VSMC),a P53 gene recombinant adenovirus vecter,AdCMV P53，and a Rb gene recombinant adenovirus vector,AdCMV Rb，were transfected into the cultured VSMC derived from human umbilical artery. The migration of VSMC was tested after introduction of exogenous P53 gene and Rb gene for 72 h.The results showed that migration distances of VSMC in control group were significantly longer than those of VSMC transfected with AdCMV P53 and AdCMV Rb(P<0.05,P<0.001).It is suggested that introduction of exogenous P53 gene and Rb gene could markedly inhibit VSMC migration.
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Key words:Vascular smooth muscle cell; Migration; P53 gene; Rb gene
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在正常情况下主要位于血管中膜。当血管内皮细胞受损时，中膜的VSMC向内膜迁移并大量增殖，因此，VSMC的迁移和增殖是动脉粥样硬化及经皮腔内冠状动脉成形术后血管再狭窄发生过程中的关键因素。我室近年的研究表明，将外源性P53基因和Rb基因导入VSMC可抑制细胞增殖[1,2]。但是否影响VSMC迁移尚不清楚。本文旨在观察外源性P53和Rb基因对体外培养的VSMC迁移的影响。
材料和方法
1. 血管平滑肌细胞的培养 取人脐动脉，剥离中膜，贴块法接种于培养瓶。用含20%胎牛血清的DMEM培养基培养，传2～3代后用于实验。
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2. 野生型P53和Rb基因重组腺病毒载体的构建 将编码人P53蛋白或Rb蛋白的P53cDNA或Rb cDNA插入pRC/CMV载体(美国Invitrogen公司)，酶切和回收含有CMV启动子、P53 cDNA或Rb cDNA及BGH加poly A信号的片段，将此片段插入腺病毒质粒载体pXCJL-l的Bamh l位点，以此质粒与质粒PJM 17共转染293细胞，筛选并克隆复制缺陷型重组腺病毒载体，经293细胞扩增得到病毒颗粒，将含有P53基因和Rb基因的重组腺病毒载体分别命名为AdCMV P53和AdCMV Rb。病毒滴度为1010pfu/ml，转染效率达100%。含有Lac Z基因的重组腺病毒(AdCMV Lac Z)作为对照载体也以同样方法构建。
3. 血管平滑肌细胞迁移距离的测定 参照Sarkar等[3]建立的方法进行。将盖玻片置于6孔培养板中，接种传代培养的VSMC，细胞长满后，取出盖玻片，在显微镜下用无菌刮刀将盖玻片上的VSMC沿直线刮除一侧，放回培养板中，继续培养72 h作为对照组，或用腺病毒载体转染72 h，或加入5 mmol/L羟基脲培养72 h。在显微镜下观察细胞迁移情况，以测定迁移最远的VSMC至刮线边缘的距离作为VSMC的迁移距离。每组观察16个盖玻片的细胞迁移距离，取均值。
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4. 统计学处理 所有实验结果均采用±S表示，差异的显著性检验采用组间t检验。
结果
从表1可见，对照组VSMC的迁移距离显著高于P53基因转染组和Rb基因转染组VSMC的迁移(P<0.05,P<0.001)。提示外源性 P53基因和Rb基因导入可显著抑制VSMC的迁移。此外，导入含Lac Z基因的腺病毒载体不显著抑制VSMC迁移，说明抑制VSMC迁移的作用是由野生型P53基因和Rb基因引起的，与病毒载体无关。羟基脲具有抑制细胞增殖作用，然而羟基脲的加入并未明显抑制VSMC迁移，说明VSMC的迁移并不是由其增殖造成的。
表1 血管平滑肌细胞的迁移(cm,±S) 对照组
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P53基因转染组
Rb基因转染组
Lac Z基因转染组
羟基脲组
0.84
0.53*
0.37**
0.74
0.81
±0.36
±0.45
±0.29
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±0.30
±0.34
注：与对照组相比，*P<0.05,**P<0.001
讨论
P53基因和Rb基因都是重要的抑癌基因。野生型P53基因和Rb基因可以调节细胞周期，抑制细胞的过度增生[4,5]。我室曾应用细胞计数、同位素掺入、流式细胞仪等检测手段，观察P53基因和Rb基因对VSMC生长的作用。结果表明，野生型P53基因和Rb基因导入可抑制VSMC增殖[1,2]。本文的结果也显示，外源性P53基因和Rb基因能显著抑制VSMC迁移。为了证明VSMC迁移的抑制是否与VSMC增殖的抑制有关，我们采用细胞增殖抑制剂羟基脲来抑制细胞增殖，检查细胞增殖对迁移的可能影响，结果显示VSMC的增殖被羟基脲抑制后，其迁移距离并未发生明显改变，说明外源性P53基因和Rb基因抑制VSMC迁移可能与它们抑制VSMC增殖的作用无关。
, 百拇医药
有研究表明VSMC迁移与细胞外基质如IV型胶原降解及细胞收缩蛋白基因过度表达有关[6]。另据报道，P21基因对VSMC迁移、增殖有显著的抑制作用。Fukui等[7]将P21基因转染到兔主动脉VSMC后发现，P21基因的导入改变了VSMC形态，抑制了α-actin和vinculin等细胞骨架蛋白的伸展，从而抑制了VSMC的迁移。P21基因编码的蛋白是一种细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的抑制蛋白，它通过调控细胞周期的进程，参与细胞的生长、分化及死亡[8]。我室曾将野生型P53基因和Rb基因导入VSMC后，应用逆转录-聚合酶链反应半定量测定P21mRNA水平，以免疫组化法观察P21蛋白表达的变化。结果发现，正常生长的VSMC中P21mRNA水平较低，用免疫组化法检测不到P21蛋白。野生型P53基因和Rb基因导入并在VSMC中表达后。显著增加了P21mRNA水平，在免疫组化检测中显现很强的阳性显色反应。说明野生型P53基因和Rb基因可诱导P21基因高表达[9]。结合本文的结果进行分析，我们推测，P53基因和Rb基因可能通过诱导P21基因表达来抑制VSMC的迁移，这个问题尚待进一步探讨。
, 百拇医药
* 本文为国家自然科学基金资助项目(39570775)
参考文献
[1] 蒋雷，夏永静，黎健.野生型P53基因导入对培养的兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用.中华心血管病杂志,1997,25:301.
[2] 夏永静，蒋雷，黎健.Rb基因对血管平滑肌细胞生长抑制作用的研究.中华医学杂志，1997，77：252.
[3] Sarkar R,Meinberg EG,Stanley JC,et al. Nitric oxide reversibly inhibits the migration of P53 cultured vascular smooth muscle cells. Circ Res,1996,78:225.
, 百拇医药
[4] Lane DP.P53,guardian of the genome.Nature,1992,358:15.
[5] Wang CY,Petryniak BB,Thompson CB,et al.Regulation of the Eif-l by binding to the retinoblasoma protein. Science,1993,260:1330.
[6] Pauly RR,Passaniti A,Bilato C,et al.Migration of cultured vascular smooth muscle cells through a basement membrane barrier requires type Ⅳ collagenase activity and is inhibited by cellular differentiation.Circ Res,1994,75:417.
, 百拇医药
[7] Fukui R, Shibata N,Kohbayashi E,et al. Inhibition of smooth muscle cell migration by the P21 cyclin-dependent kinase inhibitor. Atherosclerosis,1997,132:53.
[8] Harper JW, Adami GR,Wei N,et al. The p21 CDK-interacting protein cip l is a potent inhibitor of G l cyclin-dependent kinase. Cell,1993,75:805.
[9] 唐蔚青，王抒，黎健.野生型P53基因诱导血管平滑肌细胞P21基因表达.中国动脉硬化杂志，1998，6:283.
(1998-11-20收稿), 百拇医药
单位：卫生部北京老年医学研究所 卫生部老年医学重点实验室(100730)
关键词：血管平滑肌细胞；迁移；P53基因；Rb基因
心肺心血病杂志990103 摘要 为研究外源性P53和Rb基因对血管平滑肌细胞迁移的影响，体外培养人脐动脉平滑肌细胞，将P53基因和Rb基因重组腺病毒载体转染平滑肌细胞72h后，检测平滑肌细胞的迁移。结果显示，对照组平滑肌细胞的迁移距离为0.84±0.36 cm(
±S)，而P53基因转染组和Rb基因转染组的细胞迁移距离分别为0.53±0.45 cm和0.37±0.29 cm，显著低于对照组(P<0.05,P<0.001)。提示外源性P53基因和Rb基因导入可显著抑制血管平滑肌细胞迁移。, 百拇医药
Effect of Exogenous P53Gene and Rb Gene on Migration
of Vascular Smooth Muscle Cells
Man Yong,Wang Shu,Li Jian
Department of Biochemistry,Beijing Institute of Geriatrics (100730)
Abstract To study the effect of exogenous P53 gene and Rb gene on migration of vascular smooth muscle cells(VSMC),a P53 gene recombinant adenovirus vecter,AdCMV P53，and a Rb gene recombinant adenovirus vector,AdCMV Rb，were transfected into the cultured VSMC derived from human umbilical artery. The migration of VSMC was tested after introduction of exogenous P53 gene and Rb gene for 72 h.The results showed that migration distances of VSMC in control group were significantly longer than those of VSMC transfected with AdCMV P53 and AdCMV Rb(P<0.05,P<0.001).It is suggested that introduction of exogenous P53 gene and Rb gene could markedly inhibit VSMC migration.
, http://www.100md.com
Key words:Vascular smooth muscle cell; Migration; P53 gene; Rb gene
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在正常情况下主要位于血管中膜。当血管内皮细胞受损时，中膜的VSMC向内膜迁移并大量增殖，因此，VSMC的迁移和增殖是动脉粥样硬化及经皮腔内冠状动脉成形术后血管再狭窄发生过程中的关键因素。我室近年的研究表明，将外源性P53基因和Rb基因导入VSMC可抑制细胞增殖[1,2]。但是否影响VSMC迁移尚不清楚。本文旨在观察外源性P53和Rb基因对体外培养的VSMC迁移的影响。
材料和方法
1. 血管平滑肌细胞的培养 取人脐动脉，剥离中膜，贴块法接种于培养瓶。用含20%胎牛血清的DMEM培养基培养，传2～3代后用于实验。
, http://www.100md.com
2. 野生型P53和Rb基因重组腺病毒载体的构建 将编码人P53蛋白或Rb蛋白的P53cDNA或Rb cDNA插入pRC/CMV载体(美国Invitrogen公司)，酶切和回收含有CMV启动子、P53 cDNA或Rb cDNA及BGH加poly A信号的片段，将此片段插入腺病毒质粒载体pXCJL-l的Bamh l位点，以此质粒与质粒PJM 17共转染293细胞，筛选并克隆复制缺陷型重组腺病毒载体，经293细胞扩增得到病毒颗粒，将含有P53基因和Rb基因的重组腺病毒载体分别命名为AdCMV P53和AdCMV Rb。病毒滴度为1010pfu/ml，转染效率达100%。含有Lac Z基因的重组腺病毒(AdCMV Lac Z)作为对照载体也以同样方法构建。
3. 血管平滑肌细胞迁移距离的测定 参照Sarkar等[3]建立的方法进行。将盖玻片置于6孔培养板中，接种传代培养的VSMC，细胞长满后，取出盖玻片，在显微镜下用无菌刮刀将盖玻片上的VSMC沿直线刮除一侧，放回培养板中，继续培养72 h作为对照组，或用腺病毒载体转染72 h，或加入5 mmol/L羟基脲培养72 h。在显微镜下观察细胞迁移情况，以测定迁移最远的VSMC至刮线边缘的距离作为VSMC的迁移距离。每组观察16个盖玻片的细胞迁移距离，取均值。
, http://www.100md.com
4. 统计学处理 所有实验结果均采用
±S表示，差异的显著性检验采用组间t检验。结果
从表1可见，对照组VSMC的迁移距离显著高于P53基因转染组和Rb基因转染组VSMC的迁移(P<0.05,P<0.001)。提示外源性 P53基因和Rb基因导入可显著抑制VSMC的迁移。此外，导入含Lac Z基因的腺病毒载体不显著抑制VSMC迁移，说明抑制VSMC迁移的作用是由野生型P53基因和Rb基因引起的，与病毒载体无关。羟基脲具有抑制细胞增殖作用，然而羟基脲的加入并未明显抑制VSMC迁移，说明VSMC的迁移并不是由其增殖造成的。
表1 血管平滑肌细胞的迁移(cm,
±S) 对照组, http://www.100md.com
P53基因转染组
Rb基因转染组
Lac Z基因转染组
羟基脲组
0.84
0.53*
0.37**
0.74
0.81
±0.36
±0.45
±0.29
, http://www.100md.com
±0.30
±0.34
注：与对照组相比，*P<0.05,**P<0.001
讨论
P53基因和Rb基因都是重要的抑癌基因。野生型P53基因和Rb基因可以调节细胞周期，抑制细胞的过度增生[4,5]。我室曾应用细胞计数、同位素掺入、流式细胞仪等检测手段，观察P53基因和Rb基因对VSMC生长的作用。结果表明，野生型P53基因和Rb基因导入可抑制VSMC增殖[1,2]。本文的结果也显示，外源性P53基因和Rb基因能显著抑制VSMC迁移。为了证明VSMC迁移的抑制是否与VSMC增殖的抑制有关，我们采用细胞增殖抑制剂羟基脲来抑制细胞增殖，检查细胞增殖对迁移的可能影响，结果显示VSMC的增殖被羟基脲抑制后，其迁移距离并未发生明显改变，说明外源性P53基因和Rb基因抑制VSMC迁移可能与它们抑制VSMC增殖的作用无关。
, 百拇医药
有研究表明VSMC迁移与细胞外基质如IV型胶原降解及细胞收缩蛋白基因过度表达有关[6]。另据报道，P21基因对VSMC迁移、增殖有显著的抑制作用。Fukui等[7]将P21基因转染到兔主动脉VSMC后发现，P21基因的导入改变了VSMC形态，抑制了α-actin和vinculin等细胞骨架蛋白的伸展，从而抑制了VSMC的迁移。P21基因编码的蛋白是一种细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的抑制蛋白，它通过调控细胞周期的进程，参与细胞的生长、分化及死亡[8]。我室曾将野生型P53基因和Rb基因导入VSMC后，应用逆转录-聚合酶链反应半定量测定P21mRNA水平，以免疫组化法观察P21蛋白表达的变化。结果发现，正常生长的VSMC中P21mRNA水平较低，用免疫组化法检测不到P21蛋白。野生型P53基因和Rb基因导入并在VSMC中表达后。显著增加了P21mRNA水平，在免疫组化检测中显现很强的阳性显色反应。说明野生型P53基因和Rb基因可诱导P21基因高表达[9]。结合本文的结果进行分析，我们推测，P53基因和Rb基因可能通过诱导P21基因表达来抑制VSMC的迁移，这个问题尚待进一步探讨。
, 百拇医药
* 本文为国家自然科学基金资助项目(39570775)
参考文献
[1] 蒋雷，夏永静，黎健.野生型P53基因导入对培养的兔血管平滑肌细胞生长的抑制作用.中华心血管病杂志,1997,25:301.
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[6] Pauly RR,Passaniti A,Bilato C,et al.Migration of cultured vascular smooth muscle cells through a basement membrane barrier requires type Ⅳ collagenase activity and is inhibited by cellular differentiation.Circ Res,1994,75:417.
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[8] Harper JW, Adami GR,Wei N,et al. The p21 CDK-interacting protein cip l is a potent inhibitor of G l cyclin-dependent kinase. Cell,1993,75:805.
[9] 唐蔚青，王抒，黎健.野生型P53基因诱导血管平滑肌细胞P21基因表达.中国动脉硬化杂志，1998，6:283.
(1998-11-20收稿), 百拇医药