应用表达序列片段测定法初步筛选心血管病相关基因
作者：蔺洁 刘玉清 王绿娅 龚菁 李丽 陆立鹤
单位：蔺洁(北京市心肺血管疾病研究所动脉硬化研究室 100029)；刘玉清(中国医学科学院心血管病研究所阜外心血管病医院)；王绿娅(北京市心肺血管疾病研究所动脉硬化研究室 100029)；龚菁(中国医学科学院心血管病研究所阜外心血管病医院)；李丽(西安医科大学)；陆立鹤(中国医学科学院心血管病研究所阜外心血管病医院)
关键词：人主动脉cDNA文库；PCR；表达序列片段
心肺血管病杂志000220
摘要 本文介绍表达序列片段法在筛选心血管病相关基因中的应用。从人主动脉文库中挑取有目的基因片段插入的噬菌斑，选用双向通用引物做PCR扩增，以纯化后的产物做测序模板，用全自动DNA测序仪测定基因表达序列并与GenBank作同源性分析。PCR扩增阳性克隆产率大于70%，新ESTs占15%。结果表明利用正常人主动脉cDNA文库，用PCR扩增方法制备测序模板为筛选心血管病相关基因快速有效的方法。
, 百拇医药
Cardiovascular Associated Genes Screening by Express Sequencing Tags Technique
Lin Jie,Lui Yuqing,Wang Luya,et al.
(Beijing Institute of Heart,Lung & Blood Vessel Diseases 100029)
Abstract Cardiovascular associated genes were screened with Express Sequence Tags (ESTs) technique in this report.Plaques were picked up from nomal human artery cDNA library and then PCR with vector primers was performed.And the purified PCR products were used for cycles sequencing.ESTs were obtained with DNA sequencer and they were compared with GenBank data base.Positive clone rate was more than 70% and about 15% of them were new ESTs.The results suggest that the technique of screening ESTs from human artery cDNA library is useful for screening cardiovascular associated genes.
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Key words：Human Artery cDNA Library; PCR; Express Sequence Tags
心血管疾病是一类多基因、有遗传倾向的疾病[1]，寻找心血管病相关基因对研究其发病机理和指导防治都有重要意义。获取目的基因，尤其是重要的表达序列，是基因诊断、基因治疗和开发基因工程品种的物质基础，有广泛的社会效益和经济效益。心血管系统基因组DNA数目庞大，含有重复序列和非编码序列，如完全采用克隆筛选和排列的方法获得其编码基因序列，大量的时间和精力将被消耗在模板DNA的制备上。cDNA文库中一个克隆的已测序部分为一个ESTs，长度一般为150～500 bp，可作为遗传标志用于检测基因组中的编码序列[4]。本文简要介绍一种简便的表达克隆的方法，利用正常人主动脉cDNA文库随机挑选克隆，用PCR法制备模板直接测序获得ESTs，将结果输入GenBank，经同源序列比较排列起来以获得全长cDNA，并用于筛选心血管病相关基因。
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材料与方法
材料 正常人主动脉cDNA文库由阜外医院构建，库容量为1×109，噬菌体为λ-ZAPⅡ，Taq DNA聚合酶等由北京鼎国生物制品公司提供，引物为T3、T7通用引物。
仪器 美国PE公司ABI377全自动DNA测序仪。
方法1.重组后cDNA文库的鉴定 (1)cDNA文库的扩增 在25 ml含有四环素(终浓度50 ug/ml)的LB培养液中接种一个XL1-Blue MRF’单菌落，37℃振摇过夜，200转/min。次日将0.5 ml过夜培养菌液、0.5 ml 20%麦牙糖、0.5 ml 10 mmol/L MgSO4加入50 ml LB培养基中，37℃振摇4～6 h,200转/min，离心，2500 rpm，10 min，4 ℃，弃上清，用10 mmol/L冰浴的MgSO4悬浮沉淀，将浓度调至OD600为0.5～0.6 (10 000 pfu/ml)。将600 μl OD600为0.5的菌液加入10 μl cDNA文库稀释液，混匀，37℃水浴20 min后与10 ml顶层琼脂糖混匀，立即倒入已铺有NZY培养基的培养皿中，室温下放置20 min后倒置于37℃温箱培养8～12 h。(2)PCR扩增 将长有噬菌斑的培养皿置4℃ 2 h后用巴斯德吸管挑取单个噬菌斑放入含75 μl SM缓冲液和5 μl氯仿的Eppendorf管中，振荡、离心，取上清2.5 μl加入Taq DNA聚合酶1U，1 mmol/L的dNTP 2.5 μl，5～10 pmol/L的T3、T7引物各1 μl及10×缓冲液，总反应体系为25 μl。PCR扩增条件为94℃ 4 min变性，94℃30秒，55℃20秒，72℃3 min共32个循环，72℃延伸5 min终止反应。取扩增产物2.5 μl以λHindⅢ为标准分子量，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.cDNA片段ESTs的测定和分析(1)PCR产物的纯化 20 μl PCR产物加等体积的5 M NH4AC和5倍体积的无水乙醇，混匀后置于-70℃30 min,4 000 rpm 10 min水平离心，再12 000 rpm 10 min角头离心弃上清，70%乙醇洗二次后室温干燥，加15 μl TE溶解，再以1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物。(2)序列模板DNA的置备 挑选单一阳性电泳带的纯化产物做测序DNA模板，用Big Dye Teminator试剂盒(PE公司)做测序反应。(3)序列模板DNA纯化 纯化方法同PCR产物纯化。上样前置95℃ 1 min变性后加沉淀缓冲液3 μl。(4)ESTs测定 采用4.25% 29∶1聚丙烯酰胺凝胶，上样前样品于95℃变性5 min后插入冰中，每孔上样1 μl，同时电泳64份样品。电泳液为1×TBE，电压2 400伏，52℃ 40 mw激光强度下电泳7.5～10 h。(5)将测得的ESTs运用BLASTP软件与GenBank数据库做序列同源性比较，确定所测片段是已知或未知的基因。
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结 果
1.阳性克隆的检测 见图1。(1)PCR产物的检测 随机从该cDNA文库中挑PCR产物2 000个，其中阳性克隆1 440个，检出率为72%。(2)纯化后PCR产物回收率 获得可测序模板1 296个，回收率为90%。2.cDNA片段的测序 用上述电泳条件共测序1296个PCR产物，获得912个ESTs，序列片段为250～600 bp，平均400 bp，测出率为70%。3.序列同源性分析 将912个ESTs输入GenBank数据库比较，其中137个(15%) ESTs与Gene Bank收录的基因序列无明显同源性，为心血管系统新基因表达片段。
图1 PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳的鉴定
讨 论
目前认为心血管系统多数疾病受遗传和环境因素的影响，且环境因素是通过影响基因的表达而致病。人类基因组中编码心血管系统的基因数目庞大，是多种复杂心血管疾病的遗传物质基础。因而寻找致病及相关基因，探讨这些基因的致病机理，确定遗传危险因素对改变未来心血管疾病的治疗和预防有重要意义。
, 百拇医药
此前为确定疾病相关基因的序列可采用表达克隆的方法，利用高频分布易于检测的DNA标志建立克隆之间的联系，组成有序排列的连续克隆系[2]，因此模板DNA的制备是获得理想测序结果的关键。首先将待测DNA排列后逐段测定，再将DNA序列连接起来，大量的时间和精力被消耗在模板DNA的克隆筛选和排列上。如采用探针杂交的方法亦可能碰到某些同源序列的干扰[5]。Green等[3]首先采用PCR方法筛选酵母基因组文库，获得满意效果。根据其原理本文直接从正常人主动脉cDNA文库中筛选阳性克隆，用PCR扩增测定目的基因并判断测序模板，无需进行酚/氯仿抽提、酶切等过程，减少了克隆筛选和排列等繁琐工作，在短期内即得到大量来自cDNA文库的表达序列，即表达标签序列(ESTs)，通过全球互联网EST资料库进行同源性比较分析，获取大量正在表达的遗传信息，且避免探针序列的干扰，具有高度特异性，是目前寻找和发现新基因及疾病相关基因的快速有效方法。
本文从测序的1 296个PCR产物中获得912个ESTs，序列测出率为70%。从中发现137个新EST，占15%，待测全长后对其进行结构和功能的研究，进一步探讨它们在心血管疾病中的作用。本文所用方法快速、准确，使在短时间内从组织中分离高度特异表达的全长cDNA成为可能，值得推广并应用于其他多基因疾病的研究。
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国家攀登计划项目资助
参考文献
1，Kalz AM.Heart Failure in 2001:A prophecy.Am J Cardiol,1992,70:126.
2，吴乃虎，主编.基因工程原理.第二版.北京：科学出版社，1997，293～295.
3，Green ED,Olson MV.Systematic screening of yeast artificial chromosome libraries by use of polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:1213.
4，Marra MA,Hillier L,Waaterston RH,et al.Expressed sequence taqs-EST ablishing bridges between genomes.TIG,1998,14:4～7.
5，Rawlings CJ,Searls DB.Computational gene discovery and human disease.Curr Opin Genet Dev,1997,7:416～423.
收稿日期：1999-10-22
修回日期：2000-01-20, 百拇医药
单位：蔺洁(北京市心肺血管疾病研究所动脉硬化研究室 100029)；刘玉清(中国医学科学院心血管病研究所阜外心血管病医院)；王绿娅(北京市心肺血管疾病研究所动脉硬化研究室 100029)；龚菁(中国医学科学院心血管病研究所阜外心血管病医院)；李丽(西安医科大学)；陆立鹤(中国医学科学院心血管病研究所阜外心血管病医院)
关键词：人主动脉cDNA文库；PCR；表达序列片段
心肺血管病杂志000220
摘要 本文介绍表达序列片段法在筛选心血管病相关基因中的应用。从人主动脉文库中挑取有目的基因片段插入的噬菌斑，选用双向通用引物做PCR扩增，以纯化后的产物做测序模板，用全自动DNA测序仪测定基因表达序列并与GenBank作同源性分析。PCR扩增阳性克隆产率大于70%，新ESTs占15%。结果表明利用正常人主动脉cDNA文库，用PCR扩增方法制备测序模板为筛选心血管病相关基因快速有效的方法。
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Cardiovascular Associated Genes Screening by Express Sequencing Tags Technique
Lin Jie,Lui Yuqing,Wang Luya,et al.
(Beijing Institute of Heart,Lung & Blood Vessel Diseases 100029)
Abstract Cardiovascular associated genes were screened with Express Sequence Tags (ESTs) technique in this report.Plaques were picked up from nomal human artery cDNA library and then PCR with vector primers was performed.And the purified PCR products were used for cycles sequencing.ESTs were obtained with DNA sequencer and they were compared with GenBank data base.Positive clone rate was more than 70% and about 15% of them were new ESTs.The results suggest that the technique of screening ESTs from human artery cDNA library is useful for screening cardiovascular associated genes.
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Key words：Human Artery cDNA Library; PCR; Express Sequence Tags
心血管疾病是一类多基因、有遗传倾向的疾病[1]，寻找心血管病相关基因对研究其发病机理和指导防治都有重要意义。获取目的基因，尤其是重要的表达序列，是基因诊断、基因治疗和开发基因工程品种的物质基础，有广泛的社会效益和经济效益。心血管系统基因组DNA数目庞大，含有重复序列和非编码序列，如完全采用克隆筛选和排列的方法获得其编码基因序列，大量的时间和精力将被消耗在模板DNA的制备上。cDNA文库中一个克隆的已测序部分为一个ESTs，长度一般为150～500 bp，可作为遗传标志用于检测基因组中的编码序列[4]。本文简要介绍一种简便的表达克隆的方法，利用正常人主动脉cDNA文库随机挑选克隆，用PCR法制备模板直接测序获得ESTs，将结果输入GenBank，经同源序列比较排列起来以获得全长cDNA，并用于筛选心血管病相关基因。
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材料与方法
材料 正常人主动脉cDNA文库由阜外医院构建，库容量为1×109，噬菌体为λ-ZAPⅡ，Taq DNA聚合酶等由北京鼎国生物制品公司提供，引物为T3、T7通用引物。
仪器 美国PE公司ABI377全自动DNA测序仪。
方法1.重组后cDNA文库的鉴定 (1)cDNA文库的扩增 在25 ml含有四环素(终浓度50 ug/ml)的LB培养液中接种一个XL1-Blue MRF’单菌落，37℃振摇过夜，200转/min。次日将0.5 ml过夜培养菌液、0.5 ml 20%麦牙糖、0.5 ml 10 mmol/L MgSO4加入50 ml LB培养基中，37℃振摇4～6 h,200转/min，离心，2500 rpm，10 min，4 ℃，弃上清，用10 mmol/L冰浴的MgSO4悬浮沉淀，将浓度调至OD600为0.5～0.6 (10 000 pfu/ml)。将600 μl OD600为0.5的菌液加入10 μl cDNA文库稀释液，混匀，37℃水浴20 min后与10 ml顶层琼脂糖混匀，立即倒入已铺有NZY培养基的培养皿中，室温下放置20 min后倒置于37℃温箱培养8～12 h。(2)PCR扩增 将长有噬菌斑的培养皿置4℃ 2 h后用巴斯德吸管挑取单个噬菌斑放入含75 μl SM缓冲液和5 μl氯仿的Eppendorf管中，振荡、离心，取上清2.5 μl加入Taq DNA聚合酶1U，1 mmol/L的dNTP 2.5 μl，5～10 pmol/L的T3、T7引物各1 μl及10×缓冲液，总反应体系为25 μl。PCR扩增条件为94℃ 4 min变性，94℃30秒，55℃20秒，72℃3 min共32个循环，72℃延伸5 min终止反应。取扩增产物2.5 μl以λHindⅢ为标准分子量，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.cDNA片段ESTs的测定和分析(1)PCR产物的纯化 20 μl PCR产物加等体积的5 M NH4AC和5倍体积的无水乙醇，混匀后置于-70℃30 min,4 000 rpm 10 min水平离心，再12 000 rpm 10 min角头离心弃上清，70%乙醇洗二次后室温干燥，加15 μl TE溶解，再以1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物。(2)序列模板DNA的置备 挑选单一阳性电泳带的纯化产物做测序DNA模板，用Big Dye Teminator试剂盒(PE公司)做测序反应。(3)序列模板DNA纯化 纯化方法同PCR产物纯化。上样前置95℃ 1 min变性后加沉淀缓冲液3 μl。(4)ESTs测定 采用4.25% 29∶1聚丙烯酰胺凝胶，上样前样品于95℃变性5 min后插入冰中，每孔上样1 μl，同时电泳64份样品。电泳液为1×TBE，电压2 400伏，52℃ 40 mw激光强度下电泳7.5～10 h。(5)将测得的ESTs运用BLASTP软件与GenBank数据库做序列同源性比较，确定所测片段是已知或未知的基因。
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结 果
1.阳性克隆的检测 见图1。(1)PCR产物的检测 随机从该cDNA文库中挑PCR产物2 000个，其中阳性克隆1 440个，检出率为72%。(2)纯化后PCR产物回收率 获得可测序模板1 296个，回收率为90%。2.cDNA片段的测序 用上述电泳条件共测序1296个PCR产物，获得912个ESTs，序列片段为250～600 bp，平均400 bp，测出率为70%。3.序列同源性分析 将912个ESTs输入GenBank数据库比较，其中137个(15%) ESTs与Gene Bank收录的基因序列无明显同源性，为心血管系统新基因表达片段。
图1 PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳的鉴定
讨 论
目前认为心血管系统多数疾病受遗传和环境因素的影响，且环境因素是通过影响基因的表达而致病。人类基因组中编码心血管系统的基因数目庞大，是多种复杂心血管疾病的遗传物质基础。因而寻找致病及相关基因，探讨这些基因的致病机理，确定遗传危险因素对改变未来心血管疾病的治疗和预防有重要意义。
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此前为确定疾病相关基因的序列可采用表达克隆的方法，利用高频分布易于检测的DNA标志建立克隆之间的联系，组成有序排列的连续克隆系[2]，因此模板DNA的制备是获得理想测序结果的关键。首先将待测DNA排列后逐段测定，再将DNA序列连接起来，大量的时间和精力被消耗在模板DNA的克隆筛选和排列上。如采用探针杂交的方法亦可能碰到某些同源序列的干扰[5]。Green等[3]首先采用PCR方法筛选酵母基因组文库，获得满意效果。根据其原理本文直接从正常人主动脉cDNA文库中筛选阳性克隆，用PCR扩增测定目的基因并判断测序模板，无需进行酚/氯仿抽提、酶切等过程，减少了克隆筛选和排列等繁琐工作，在短期内即得到大量来自cDNA文库的表达序列，即表达标签序列(ESTs)，通过全球互联网EST资料库进行同源性比较分析，获取大量正在表达的遗传信息，且避免探针序列的干扰，具有高度特异性，是目前寻找和发现新基因及疾病相关基因的快速有效方法。
本文从测序的1 296个PCR产物中获得912个ESTs，序列测出率为70%。从中发现137个新EST，占15%，待测全长后对其进行结构和功能的研究，进一步探讨它们在心血管疾病中的作用。本文所用方法快速、准确，使在短时间内从组织中分离高度特异表达的全长cDNA成为可能，值得推广并应用于其他多基因疾病的研究。
, http://www.100md.com
国家攀登计划项目资助
参考文献
1，Kalz AM.Heart Failure in 2001:A prophecy.Am J Cardiol,1992,70:126.
2，吴乃虎，主编.基因工程原理.第二版.北京：科学出版社，1997，293～295.
3，Green ED,Olson MV.Systematic screening of yeast artificial chromosome libraries by use of polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:1213.
4，Marra MA,Hillier L,Waaterston RH,et al.Expressed sequence taqs-EST ablishing bridges between genomes.TIG,1998,14:4～7.
5，Rawlings CJ,Searls DB.Computational gene discovery and human disease.Curr Opin Genet Dev,1997,7:416～423.
收稿日期：1999-10-22
修回日期：2000-01-20, 百拇医药