肾血管性高血压大鼠运动区NPY阳性神经元的变化
作者：王省,高凤兰，董华丽,原志庆，文小军
单位：王省,董华丽,原志庆，文小军：新乡医学院解剖学教研室 河南新乡 453003；高凤兰:河南漯河卫校病理教研室
关键词：神经肽Y；免疫组化；运动区；高血压；大鼠
高血压杂志990332
目的:研究肾血管性高血压大鼠运动区NPY阳性神经元的变化。方法:雄性SD大鼠60只，随机分为两组(n=30)。手术组用单夹肾动脉法复制高血压模型，对照组手术过程同手术组，但不上银夹。于术后7 d，30 d，90 d处死动物，取脑，用ABC免疫组化方法对大鼠运动区NPY阳性神经元进行定量分析。结果:对照组运动区NPY阳性神经元密度随年龄增加而减少，而手术组NPY阳性神经元密度先减少，后增加，最后保持不变。手术组和对照组NPY神经元密度相比，术后7 d两组间无显著差异；术后30 d手术组小于对照组(P<0.05)；术后90 d手术组大于对照组(P<0.01)。结论:NPY阳性神经元在高血压的发生、发展过程中起一定调控作用。
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要点：神经系统运动区NPY阳性神经元密度在正常大鼠随年龄增加而减少。肾血管性高血压大鼠术后NPY阳性神经元减少，30天开始较正常大鼠有明显增加。NPY可能对大鼠的高血压发生上有调控作用。
中图分类号：R544.1;R338.2 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)02-0282-03
Changes of NPY Neurons in the Motor Area in Renovascular
Hypertensive Rats
WANG Xing,GAO Fenglan,DONG Huali，YUAN Zhiqing,WEN Xiaojun
(Department of Anatomy,Xinxiang Medical College,Xinxiang,453003)
, 百拇医药
ABSTRACT Purpose:To research the changes of NPY neurons in the brain motor area in renovascular hypertensive rats.Methods:Sixty male SD rats were divided randomly into operated group and sham control group (n=30).In operated rats,renal arteries were constricted bilaterally with silver clips(0.3 mm in internal diameter)to induce RHR.7 d,30 d,90 d after operation the rats were killed,their brains were removed and analysed by ABC immunohistochemistry in the motor area.Result: In control sham group，the density of NPY positive neurons in the motor area decrease with the increase of age,whereas those of the operated group the NPY positive neurons decrease first and then increase,then after remain relatively constant.Comparing the density of NPY of operated group with control group,in the early period(7 d after operation),no significant difference has been found in the density of NPY neuron; in the middle period(30 d after operation) the density of NPY neurons in operated group are lesser than that of control group (P<0.01); in the late period(90 d after operation),the density of NPY neuron in operated group are greater than control group (P<0.05).Conclusions:NPY neurons system might mediate the development of hypertension.
, 百拇医药
Key Words:NPY;immunohistochemistry;motor area;hypertensive;rat
神经肽Y(neuropepited Y NPY)是含有36个氨基酸的多肽，在神经系统中分布较广，是一种重要的神经递质。有研究提示[1]，NPY能神经元系统可能参与血压的调节，与高血压的发生和发展有关；但在高血压大鼠脑皮质含量较低[2]。本实验利用肾血管性高血压大鼠模型，用ABC免疫组化方法对运动区内NPY阳性神经元进行了研究，探讨高血压和脑卒中的发病机制。
MATERIALS AND METHODS
1 动物:雄性SD大鼠90～110g/只60只，随机分为两组，每组30只。手术组：用单夹右肾动脉法复制肾血管性高血压大鼠(Renovascular Hypertensive Rat，RHR)模型，7%水合氯醛0.5 ml/100 g体重，腹腔麻醉，仰卧固定、暴露肾脏，用直径0.3 mm的银夹钳夹右侧肾动脉起始部。对照组：手术过程同手术组，但不上银夹。两组动物均正常饮食，自由饮水。用尾袖法测量大鼠尾动脉血压，术后血压>20.0kPa(150 mmHg)为高血压大鼠。
, 百拇医药
2 材料:分别于术后7 d，30 d，90 d三时期处死动物。7%水合氯醛0.5 ml/100 g体重腹腔注射麻醉，经升主动脉灌注4℃生理盐水100 ml，后灌注4℃ 4%多聚甲醛磷酸缓冲液200 ml，先快后慢，灌注时间约2 h。取大鼠大脑，于同样固定液中后固定48 h，石蜡常规包埋切片。运动区定位见文献[3]，经视上核、蓝斑进行冠状连续切片，片厚10 μm。
3 ABC染色:用0.01 mol/L PBS(pH7.6)漂洗3×5 min，正常血清室温下孵育一小时，不漂洗。第一抗体(兔抗NPY抗体),后入4℃冰箱内作用48 h；生物素化的第二抗体，室温下作用2 h；ABC复合物，室温下作用1 h；0.05% DAB-0.01% H2O2Tris缓冲液显色5 min。以上每一步骤后均用0.01 M PBS(pH7.6)漂洗3×5 min，整个染色过程在湿盒内进行。后脱水、透明、封片。对照实验用正常小牛血清替代第一抗体。
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RESULTS
1 血压变化:术后手术组血压上升，假手术组血压在正常范围内。
2 NPY阳性神经元变化:对照组大鼠运动区NPY阳性神经元随年龄增加而显著减少(图1④,⑥)；手术组大鼠运动区NPY神经元随年龄的增加先减少(图1①)，再增加(图1⑤)，然后保持不变；与对照组相比，高血压早期手术组NPY能神经元无变化(图1③)，中期手术组NPY神经元减少(图1①)，晚期NPY神经元增加(图1⑤)。运动区内NPY阳性神经元密度变化如表1。
表1 高血压各期运动区NPY阳性神经元密度(
±s)(个/mm2)
7 d
30 d
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90d
手术组
24.9±1.4
14.3±1.9*
16.1±2.1**
对照组
25.1±1.7
17.7±1.8
8.8±1.5
*：P<0.05，**：P<0.01 vs Control
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图1:
① 术后7d手术组运动区NPY阳性神经元×40; ② 术后7d对照组运动区NPY阳性神经元×40; ③ 术后30d手术组运动区NPY阳性神经元×40; ④ 术后30d对照组运动区NPY阳性神经元×40; ⑤ 术后90d手术组运动区NPY阳性神经元×40; ⑥ 术后90d对照组运动区NPY阳性神经元×40
DISCUSSION
传统认为，肾血流灌注减少时，肾素分泌增多，使交感神经末梢释放递质增多，作用于中枢内一些神经元的血管紧张素受体，使交感缩血管紧张加强。在动脉血压的长期调节中肾起重要的作用，而神经调节主要是在短时间内血压变化情况下起一定的调节作用。
自NPY从猪脑中分离出来后，人们对NPY在中枢神经系统中的作用进行了不断的研究[4]，发现NPY除具有直接收缩血管的作用外[5]，还能增强缩血管物质的作用，抑制舒血管物质的活性，促进血管平滑肌细胞的增生，从而引起外周血管阻力增加。Kowalski等[6]通过对不同年龄Wistar-Kyoto rats(WKY)大鼠脑内NPY的研究，发现下丘脑、海马和额叶内NPY水平随年龄的增加而减少，而纹状体内NPY水平随年龄的增加先升高后减少。而Zoli[7]的研究认为新纹状体内NPY神经元并不随年龄的变化而减少。说明纹状体内NPY能神经元的变化发生在苍白球。SHR大鼠视前正中核和弓状核NPY含量高于WKY，而大脑皮质和颈、胸段脊髓的NPY浓度明显低于WKY[8]。SHR脑室内注射NPY使血压呈剂量依赖性降低，说明NPY的降压作用与脊髓的交感节前神经元密切相关。向SHR大鼠的孤束核内注射小剂量的NPY，通过抑制α2-肾上腺能受体，引起血管压力增加和心动过缓，从而促成高血压的进一步发展[9，10]；下丘脑后核单侧注射NPY能使血压、肾血管阻力和肾神经活性升高，在SHR中NPY的加压作用增强；电刺激SHR下丘脑，能引起NPY大量释放，NPY和α2激动剂UK 304能依赖性地抑制NE释放，提示，NPY和α2-肾上腺素受体可能参与了高血压时中枢交感神经活性的调节；NPY对NE释放的抑制作用减弱,可能导致交感神经活性增强。
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本实验观察到对照组大鼠运动区NPY阳性神经元随年龄增加而显著减少，与Kowalski的结果一致。RHR大鼠运动区NPY神经元随年龄的增加先减少，再增加，然后保持不变；与对照组相比，高血压早期RHR的NPY能神经元无变化，中期RHR的NPY神经元减少，晚期NPY神经元增加。提示NPY能神经元系统对逐渐形成的高血压无反应，而在高血压晚期可能引起了NPY能神经元的变化。运动区和纹状体的NPY能神经元系统可能与高血压的调节和发病过程中感觉、运动和行为的改变有关。本实验的结果还提示与传统的血压调节理论相吻合。
因此，NPY能神经元在高血压的发生、发展过程中起着一定的调控作用。
REFERENCES
1 Michel MC,Rascher W.Neuropeptide Y: A possible role in hypertension? [J] J Hypertens 1995;13(4):385-395
, http://www.100md.com
2 Michel MC,Lewejohann K,Farke W,et al.Regulation of NPY/NPY Y1 receptor/G protein system in rat brain cortex[J] Am J physiol 1995;268(1 pt 2):R192-R200
3 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M] 北京人民卫生出版社，1991：27
4 Shine J,Potter EK,Biden T,et al.Neuropeptide Y and regulation of the cardiovascular system[J] J Hypertens Suppl 1994;12(10):S41-S45
5 Zukowska GZ,Golczynska M,Shen GH,et al.Modulation of vascular fundation by neuropeptide Y during development of hypertension in spontaneously hypertensive rats[J] Pediatr Nephrol 1993;7(6):845-852
, 百拇医药
6 Kowalski C,Mioheau J,Corder R,et al.Age-related changes in cortico-releasing factor,somatostatin,neuropeptide Y,methionine enkephalin and endorphin in specific rat brain areas[J] Brain Res 1992;582:38
7 Zoli M,Ferraguti F,Toffano G et al.Neurochemical alterations but not nerve cell loss in aged rat neostriatum[J] J Chem Neuroanat 1993;6(3):131
8 Clark JK,Sahu A,Mrotek JJ et al.Sexual function and neuropeptide Y levels in selected brain regions in male spontaneously hypertensive rats[J] Am J Physiol 1991;261(5 pt 2):R1234
, 百拇医药
9 Takesako T,Takeda K,Kuwahara K,et al.Alteration of response to neuropeptide Y in the nucleus tractus solitarius of spontaneously hypertennsive rats[J] Hypertens 1994;23(1 supp1):193-196
10 Yang SN,Fior DR,Hansson AC et al.Increased potency of neuropeptide Y to antagonize alpha2-adrenoceptor function in the nucleus tractus solitarii of the spontaneously hypertensive rat[J] Neuroscience 1997;78(3):803-813
11 Han S,Chen X,Cox B et al.Role of neuropeptide Y in cold stress-induced hypertension[J] Peptide 1998;19(2):351-358
收稿日期：1999-03-01, 百拇医药
单位：王省,董华丽,原志庆，文小军：新乡医学院解剖学教研室 河南新乡 453003；高凤兰:河南漯河卫校病理教研室
关键词：神经肽Y；免疫组化；运动区；高血压；大鼠
高血压杂志990332
目的:研究肾血管性高血压大鼠运动区NPY阳性神经元的变化。方法:雄性SD大鼠60只，随机分为两组(n=30)。手术组用单夹肾动脉法复制高血压模型，对照组手术过程同手术组，但不上银夹。于术后7 d，30 d，90 d处死动物，取脑，用ABC免疫组化方法对大鼠运动区NPY阳性神经元进行定量分析。结果:对照组运动区NPY阳性神经元密度随年龄增加而减少，而手术组NPY阳性神经元密度先减少，后增加，最后保持不变。手术组和对照组NPY神经元密度相比，术后7 d两组间无显著差异；术后30 d手术组小于对照组(P<0.05)；术后90 d手术组大于对照组(P<0.01)。结论:NPY阳性神经元在高血压的发生、发展过程中起一定调控作用。
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要点：神经系统运动区NPY阳性神经元密度在正常大鼠随年龄增加而减少。肾血管性高血压大鼠术后NPY阳性神经元减少，30天开始较正常大鼠有明显增加。NPY可能对大鼠的高血压发生上有调控作用。
中图分类号：R544.1;R338.2 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)02-0282-03
Changes of NPY Neurons in the Motor Area in Renovascular
Hypertensive Rats
WANG Xing,GAO Fenglan,DONG Huali，YUAN Zhiqing,WEN Xiaojun
(Department of Anatomy,Xinxiang Medical College,Xinxiang,453003)
, 百拇医药
ABSTRACT Purpose:To research the changes of NPY neurons in the brain motor area in renovascular hypertensive rats.Methods:Sixty male SD rats were divided randomly into operated group and sham control group (n=30).In operated rats,renal arteries were constricted bilaterally with silver clips(0.3 mm in internal diameter)to induce RHR.7 d,30 d,90 d after operation the rats were killed,their brains were removed and analysed by ABC immunohistochemistry in the motor area.Result: In control sham group，the density of NPY positive neurons in the motor area decrease with the increase of age,whereas those of the operated group the NPY positive neurons decrease first and then increase,then after remain relatively constant.Comparing the density of NPY of operated group with control group,in the early period(7 d after operation),no significant difference has been found in the density of NPY neuron; in the middle period(30 d after operation) the density of NPY neurons in operated group are lesser than that of control group (P<0.01); in the late period(90 d after operation),the density of NPY neuron in operated group are greater than control group (P<0.05).Conclusions:NPY neurons system might mediate the development of hypertension.
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Key Words:NPY;immunohistochemistry;motor area;hypertensive;rat
神经肽Y(neuropepited Y NPY)是含有36个氨基酸的多肽，在神经系统中分布较广，是一种重要的神经递质。有研究提示[1]，NPY能神经元系统可能参与血压的调节，与高血压的发生和发展有关；但在高血压大鼠脑皮质含量较低[2]。本实验利用肾血管性高血压大鼠模型，用ABC免疫组化方法对运动区内NPY阳性神经元进行了研究，探讨高血压和脑卒中的发病机制。
MATERIALS AND METHODS
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2 材料:分别于术后7 d，30 d，90 d三时期处死动物。7%水合氯醛0.5 ml/100 g体重腹腔注射麻醉，经升主动脉灌注4℃生理盐水100 ml，后灌注4℃ 4%多聚甲醛磷酸缓冲液200 ml，先快后慢，灌注时间约2 h。取大鼠大脑，于同样固定液中后固定48 h，石蜡常规包埋切片。运动区定位见文献[3]，经视上核、蓝斑进行冠状连续切片，片厚10 μm。
3 ABC染色:用0.01 mol/L PBS(pH7.6)漂洗3×5 min，正常血清室温下孵育一小时，不漂洗。第一抗体(兔抗NPY抗体),后入4℃冰箱内作用48 h；生物素化的第二抗体，室温下作用2 h；ABC复合物，室温下作用1 h；0.05% DAB-0.01% H2O2Tris缓冲液显色5 min。以上每一步骤后均用0.01 M PBS(pH7.6)漂洗3×5 min，整个染色过程在湿盒内进行。后脱水、透明、封片。对照实验用正常小牛血清替代第一抗体。
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RESULTS
1 血压变化:术后手术组血压上升，假手术组血压在正常范围内。
2 NPY阳性神经元变化:对照组大鼠运动区NPY阳性神经元随年龄增加而显著减少(图1④,⑥)；手术组大鼠运动区NPY神经元随年龄的增加先减少(图1①)，再增加(图1⑤)，然后保持不变；与对照组相比，高血压早期手术组NPY能神经元无变化(图1③)，中期手术组NPY神经元减少(图1①)，晚期NPY神经元增加(图1⑤)。运动区内NPY阳性神经元密度变化如表1。
表1 高血压各期运动区NPY阳性神经元密度(
±s)(个/mm2)7 d
30 d
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90d
手术组
24.9±1.4
14.3±1.9*
16.1±2.1**
对照组
25.1±1.7
17.7±1.8
8.8±1.5
*：P<0.05，**：P<0.01 vs Control
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图1:
① 术后7d手术组运动区NPY阳性神经元×40; ② 术后7d对照组运动区NPY阳性神经元×40; ③ 术后30d手术组运动区NPY阳性神经元×40; ④ 术后30d对照组运动区NPY阳性神经元×40; ⑤ 术后90d手术组运动区NPY阳性神经元×40; ⑥ 术后90d对照组运动区NPY阳性神经元×40
DISCUSSION
传统认为，肾血流灌注减少时，肾素分泌增多，使交感神经末梢释放递质增多，作用于中枢内一些神经元的血管紧张素受体，使交感缩血管紧张加强。在动脉血压的长期调节中肾起重要的作用，而神经调节主要是在短时间内血压变化情况下起一定的调节作用。
自NPY从猪脑中分离出来后，人们对NPY在中枢神经系统中的作用进行了不断的研究[4]，发现NPY除具有直接收缩血管的作用外[5]，还能增强缩血管物质的作用，抑制舒血管物质的活性，促进血管平滑肌细胞的增生，从而引起外周血管阻力增加。Kowalski等[6]通过对不同年龄Wistar-Kyoto rats(WKY)大鼠脑内NPY的研究，发现下丘脑、海马和额叶内NPY水平随年龄的增加而减少，而纹状体内NPY水平随年龄的增加先升高后减少。而Zoli[7]的研究认为新纹状体内NPY神经元并不随年龄的变化而减少。说明纹状体内NPY能神经元的变化发生在苍白球。SHR大鼠视前正中核和弓状核NPY含量高于WKY，而大脑皮质和颈、胸段脊髓的NPY浓度明显低于WKY[8]。SHR脑室内注射NPY使血压呈剂量依赖性降低，说明NPY的降压作用与脊髓的交感节前神经元密切相关。向SHR大鼠的孤束核内注射小剂量的NPY，通过抑制α2-肾上腺能受体，引起血管压力增加和心动过缓，从而促成高血压的进一步发展[9，10]；下丘脑后核单侧注射NPY能使血压、肾血管阻力和肾神经活性升高，在SHR中NPY的加压作用增强；电刺激SHR下丘脑，能引起NPY大量释放，NPY和α2激动剂UK 304能依赖性地抑制NE释放，提示，NPY和α2-肾上腺素受体可能参与了高血压时中枢交感神经活性的调节；NPY对NE释放的抑制作用减弱,可能导致交感神经活性增强。
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因此，NPY能神经元在高血压的发生、发展过程中起着一定的调控作用。
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