反义c-myc寡核苷酸对AVP诱导鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用
作者：赵连友,卢少平,李雪,乔怀宇,杨学东
单位：第四军医大学唐都医院心血管内科，西安 710038
关键词：反义c-myc；精氨酸加压素；血管平滑肌细胞
反义c
摘要 目的:探讨AVP对鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸对AVP作用的干预效应。
方法:以培养的SD大鼠VSMC为模型，采用培养细胞计数、蛋白质定量和细胞周期分析方法及mRNA打点杂交技术，动态观察AVP对VSMC增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸的干预效果。
结果:(1)AVP促VSMC数目增加，在48h时与对照组比较，有统计学意义(P<0.05);(2)AVP促VSMC的S期百分率增加，与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01);(3) AVP促单个VSMC的蛋白质含量增加，在48h时与对照组比较，差异非常显著(P<0.01);(4)AVP使VSMC的c-myc的mRNA杂交信号比对照组明显地增强；反义c-myc 寡核苷酸与对照组比较，VSMC的c-myc的mRNA杂交信号明显地减弱;(5)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组的VSMC数目和细胞S期百分率均小于AVP组和对照组，并均有非常显著性差异(P<0.01);(6)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组 VSMC的c-myc癌基因mRNA杂交信号强度明显地高于对照组，而低于AVP组;(7)反义c-myc寡核苷酸和AVP共同作用组的单个VSMC蛋白质含量高于对照组(P<0.01);与AVP组比较无显著性差异(P>0.05)。
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结论:AVP促VSMC增殖作用与c-myc癌基因超常表达有关；反义c-myc寡核苷酸特异性抑制VSMC的c-myc癌基因表达，并拮抗AVP的促VSMC增殖作用。但反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC蛋白质合成作用，说明VSMC的蛋白质合成不依赖于c-myc癌基因的表达。此提示反义c-myc 寡核苷酸不能完全逆转高血压引起的血管重构，说明反义c-myc寡核苷酸在防治高血压病的临床应用中具有局限性。
要点：精氨酸加压素(AVP)会使培养的血管平滑肌细胞数量增加，细胞进入S期的数量增加，细胞c-myc癌基因的mRNA表达增加。由DNA自动合成仪合成的反义c-myc核酸片段5 μmol/L加入AVP 1×10-7mmol/L的培养中，表现细胞数量减少，S期细胞数量减少，细胞c-myc癌基因的mRNA表达减少，但不能拮抗AVP的促VDMC一般蛋白质合成，存在一定的局限性。
中图分类号：R331;Q781;Q7 文献标识码：A
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文章编号：1006-2866(1999)04-0360-03
The Despression of Antisense c-myc Oligodeoxynucleotides on AVP Inducing Proliferation of Rat Vascular Smooth Muscle Cells
ZHAO Lianyou，LU Shaoping，LI Xue，QIAO Huaiyu，YANG Xuedong
(The Cardiology Department,Tangdu Hospital,the Fouth Military Medical University,Xi'an)
ABSTRACT Aim:To investgate the effect of AVP on rat smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and observe the interference effect of antisence c-myc oligodeoxynucleotides on AVP action.
, http://www.100md.com
Methods:By means of the cell counting method,protein content measurement,cell cycle analysis and mRNA dot blot hybridzation techniques,cultured VSMCs derived from the aorta of Sprague-Dawley (SD) rat were used to dynamically observe the effect of AVP on VSMCs proliferation and interference effect of antisense c-myc oligodeoxynucleotides.
Results:(1) the number of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.05); (2) the percentage of S stage of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control (P<0.01); (3) protein content of single VSMC induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.01); (4) compared with the control,AVP could enhance the level of c-myc mRNA expression,but antisence c-myc could decrease the level of c-myc mRNA expression; (5) the cell number and the percentage of S stage VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP together decreased more remarkably than those of the control and AVP group (P<0.01); (6) the level of c-myc mRNA expression of VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP was higher than that of the control,but lower than that of AVP group;(7) protein content of single VSMC incubated with antisense c-myc and AVP together was remarkly higher than that of the control (P<0.01),but was not different from that of AVP group (P>0.05).
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Conclusion:The effect of AVP-induced VSMCs proliferation and hypertrophy was related to c-myc overexpression,antisense c-myc oligonucleotides specially inhibited c-myc expression and AVP-induced VSMCs proliferation. But antisense c-myc could not inhibit the effect of AVP-induced VSMCs protein synthesis. It suggests that VSMCs protein synthesis was independent of the c-myc oncogene expression and that antisense c-myc could not completely reverse the vascular remodeling of EH. The clinical value of antisense c-myc in preventing and treating EH is limited.
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Key Words:antisense c-myc; vasopressin; vascular smooth muscle cell
业已证实，血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖在高血压发病中具有重要意义。精氨酸加压素(AVP)作为一种心血管调节肽,广泛存在于循环和组织中,VSMC中也含有AVP的多肽及其mRNA[1]。文献报道，AVP与高血压发病有关[2];VSMC的增殖与癌基因的异常表达亦有关,其中c-myc在VSMC的增殖中起重要作用[3,4]。本实验在研究 AVP促VSMC增殖的基础上,进一步探讨反义c-myc寡核苷酸(c-myc asON)对AVP诱导VSMC增殖作用的干预效应。
MATERIALS AND METHODS
1 动物及试剂:SD大鼠,体重150～200 g,8～12周龄,由本校实验动物研究中心提供。c-myc的反义核酸片段(5'-AACGTTGAGGGGCAT-3')由DNA自动合成仪(ABI381A型)合成。Lipofectin(LR)为GIBOCOBRL产品。新生牛血清(NBS)由浙江三力公司提供。DMEM培养基为GIBCO产品。
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2 方法
2.1 细胞培养:无菌操作取SD大鼠胸主动脉段,按ROSS法培养VSMC。实验用3～5代传代细胞。
2.2 分组:实验分对照组、AVP组、反义c-myc寡核苷酸组、AVP+反义c-myc 寡核苷酸组。AVP和反义c-myc寡核苷酸的终浓度分别为1×10-7mmol/L和5 μmol/L。
2.3 细胞周期分析:将培养的VSMC消化成单个细胞,用含20%NBS的DMEM培养液调整活细胞数为1×105个/ml,分别加入到50 ml培养瓶中,每瓶加2 ml。置37℃、5%CO2培养箱孵育24 h,换成不含NBS的DMEM培养液,加入不同试剂,继续培养并分别在24 h和48 h 后终止反应,按流式细胞仪(Eilte profile Ⅱ,Coulter公司)说明书进行VSMC 细胞周期分析。
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2.4 细胞蛋白质含量测定:调整活细胞数为2×105个/ml,加入到 24孔培养板上,每孔加1 ml。按上述方法分别在24 h和48 h时收集细胞,用血球计数板计数,用考马斯亮兰法测定细胞总蛋白含量,计算单个VSMC的蛋白质含量。
2.5 RNA打点杂交:培养的VSMC按实验分组加入刺激物后,在 24 h时收获细胞,细胞总数在2×107左右,经PBS洗涤离心后,提取总RNA,进行RNA质和量测定,经点膜、预杂交，杂交后,洗膜,进行放射自显影。
3 统计学处理:实验数据以均数±标准差(
±s)表示,两实验组均数比较应用团体t检验;多组间比较应用F检验。P<0.05为相差显著,P<0.01为相差非常显著。
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RESULTS
1 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC数目增殖的影响:从附图1可知:(1)在作用24 h时,AVP组VSMC数为(38.50±0.85)×104,与对照组(38.30±3.40)×104比较无统计学意义(P>0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为(35.25±0.96)×104,明显地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(2)在作用48 h时,AVP组VSMC数为(55.0±3.56)×104,高于对照组(51.50±4.43)×104,两组比较有统计学意义(P<0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为( 46.50±1.29)×104,显著地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(3)在作用48h时,对照组、AVP组和反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC 数显著地高于24 h时相应各组(P<0.01)。
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Fig 1 Effect of antisense c-myc on AVP induced VSMC proliferation▲ P<0.01,vs control group and AVP group;△ P<0.05,vs control group;* P<0.01,vs 24h group.
2 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC蛋白质合成的影响:见表1。
Tab 1 Effect of antisense c-myc on AVP-Induced per-VSMC protein synthesis(±s)
Group
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VSMC protein content(pg/cell)
24 h
48 h
Ⅰ(control)
439.08±37.26
620.77±28.77△
Ⅱ(AVP)
467.61±7.01
760.67±11.55*△
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
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753.97±13.74*△
*:P<0.01,vsⅠgroup; △:P<0.01,vs 24h group,respectively.
从表1可知:(1)加入不同试剂作用24h时,Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组间单个VSMC蛋白质含量无显著性差异(P>0.05);(2)加入不同试剂作用48 h时,Ⅱ组和Ⅲ组单个VSMC蛋白质含量显著地高于Ⅰ组(P<0.01)。Ⅱ组单个VSMC蛋白质含量高于Ⅲ组，但无显著性差异(P>0.05);(3)加入不同试剂48 h时,各组单个VSMC蛋白质含量显著高于24h时相应各组(P<0.01)。
3 反义c-myc寡核苷酸对VSMC细胞周期变化的影响:见表2。
Tab 2 Cell cycle of the VSMC(±s)
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Groups
Cell cycle of the VSMC (%)
G0/G1
S phase
G2M
Ⅰ(control)
34.97±4.13
58.60±1.40
6.40±2.82
Ⅱ(AVP)
18.90±0.56△
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73.40±2.11△
7.70±2.02
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
49.47±2.57*
47.23±0.81*
6.70±2.12
△:P<0.01,vsⅠgroup;* P<0.01,vs Ⅰgroup and Ⅱ group.
由表2可知:(1)在作用48h时,Ⅱ组的VSMC的S期百分率明显地高于Ⅰ组,而其G0/G1期百分率明显低于Ⅰ组,且两组比较均有显著性差异(P<0.01)。Ⅱ组的G2M期百分率高于Ⅰ组和Ⅲ组,但无统计学意义(P>0.05);(2)在作用48 h时,Ⅲ组的VSMC的G0/G1期百分率均明显高于Ⅰ组和Ⅱ组,而其S期百分率明显地低于Ⅰ组和Ⅱ组,两组比较均有非常显著性差异(P<0.01)。
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4 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC的c-myc癌基因表达的影响:见Fig 2。
Fig 2 不同因素对VSMC的c-myc癌基因表达的影响
A:control; B:AVP; C:c-myc asON+AVP; D:c-myc asON
从照片1可以看出:(1)AVP组VSMC的mRNA杂交信号强度明显高于对照组；(2)反义c-myc寡核苷酸组VSMC的mRNA杂交信号强度明显低于对照组和AVP组；(3)反义c-myc寡核苷酸+AVP组的VSMC的mRNA杂交信号强度明显地低于AVP组。
DISCUSSION
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1 AVP诱导VSMC增殖肥大的作用
高血压的发病机制较为复杂,迄今为止还不十分清楚。晚近研究表明，许多血管活性物质参与了高血压的发生和发展过程。AVP 是一个具有缩血管作用的活性物质,但由于循环AVP的缩血管作用可以被窦弓反射所缓解,故其在高血压发病中的作用一直未被重视。近年来研究表明，SHR、SHRsp、DOCA盐高血压大鼠血浆中AVP水平均较实验鼠明显升高。高血压病患者血浆AVP浓度亦比正常人明显升高,且AVP浓度与病情有关[2]。故有人指出，循环血容量中AVP 浓度的升高可能是造成高血压的重要原因之一。Simon和Barry[1]又在局部VSMC中发现存在AVP的多肽及其mRNA。本研究结果也显示:AVP可促培养的VSMC 细胞数增加,使VSMC的S期百分率(即DNA合成)和单个细胞蛋白质含量增加,且AVP促VSMC 增加、S期百分率和蛋白质合成增加作用与其作用时间有关。说明AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。提示AVP不仅可以调节VSMC的生长 ,促进蛋白质的表达,而且可能还是VSMC分化期间的重要调节因子。因此,AVP在高血压发病中的作用不可忽视。
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目前认为,高血压与心血管的结构改变有关。Mulvany等人[5] 用三维切片方法发现SHR在血压升高前在肠系膜动脉中就已经存在VSMC增殖。Amann等[6]人用体视学方法发现,在高血压大鼠的心肌重构过程中,心肌内小动脉中存在VSMC的增殖和肥大,VSMC的增殖肥大不仅提高了对高血压的反应性,而且有助于血压的进一步升高。因此,高血压的细胞学本质是VSMC的增殖肥大。故抑制VSMC的增殖肥大在高血压病治疗中有重要意义。
2 反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC增殖肥大的生物效应
高血压是以VSMC增殖肥大为主要病理改变的疾病。现已证实，AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。本研究结果还证实，AVP促培养的VSMC的c-myc 癌基因的杂交信号明显增强,说明AVP可使c-myc癌基因超常表达,提示AVP致VSMC 增殖肥大作用与c-myc癌基因的超常表达有关。亦说明c-myc癌基因与高血压的发病密切相关。这提示c-myc 原癌基因在高血压和其它血管增殖性疾病中可作为理想的靶分子。
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本研究以与人c-myc核苷酸前五个密码子互补的碱基为顺序,合成反义c-myc 寡核苷酸,作硫代型修饰,研究反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC增殖肥大作用的影响。本实验结果表明:反义c-myc寡核苷酸组c-myc的mRNA杂交信号强度明显低于对照组,说明反义c-myc寡核苷酸可特异地抑制c-myc癌基因的表达。这与Bennett等人[7] 的研究结果相似。在此基础上,本研究进一步显示反义c-myc寡核苷酸与AVP 共同作用组的VSMC的S期百分率、细胞数目明显低于AVP组。说明反义c-myc 寡核苷酸可拮抗AVP的促VSMC增殖作用;当反义c-myc寡核苷酸使VSMC的S期百分率减少时,其G0/G1期百分率均明显增加,这说明反义c-myc寡核苷酸可抑制VSMC进入S期,但可能不阻止VSMC从G0到G1期的转化。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸通过抑制c-myc癌基因表达,阻止VSMC从G0/G1期向S期的转化,抑制AVP促VSMC的增殖作用。VSMC的增殖中包含c-myc的作用,c-myc癌基因及其表达产物在AVP促VSMC增殖中是必不可少的。
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本研究结果还显示:反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组单个VSMC 的蛋白质含量与AVP组比较无明显差异。表明反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC一般 蛋白质合成作用,这进一步说明AVP促VSMC的蛋白质合成作用可能不依赖c-myc癌基因。 这可能是反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC进入S期,使VSMC的DNA合成减少,VSMC 增殖受到抑制。但作为一个活细胞,VSMC要完成它的生理功能,必须进行蛋白质合成,它的DNA转录成mRNA的过程不受c-myc癌基因抑制,AVP可加强DNA到mRNA的转录过程,而不增加蛋白质的降解速度,因此单个VSMC的蛋白质含量增加。反义c-myc 寡核酸可能通过抑制c-myc癌基因表达来拮抗AVP的促VSMC增殖作用,但它不能拮抗AVP的促VSMC一般蛋白质合成作用。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP促VSMC肥大作用。故认为,反义c-myc寡核苷酸在防治高血压引起血管增殖肥厚的临床应用中具有局限性。
本文得到陕西省自然科学基金资助
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REFERENCES
1 Simon J,Barry GK.Identification of vasopressin mRNA in rat aorta[J] Hypertens 1995;25:1030-1033
2 曹世平,赵连友.精氨酸加压素在高血压发病中的作用及其与P物质的关系[J] 中华内科杂志 1993;32:306-9
3 Gadeau AP,Campan M,Desgranges C. Induction of cell cycle- dependent gene during cell cycle progression of arterial smooth muscle cell in culture[J] J Cell Physiol 1991;146:356-361
4 Campan M,Desgranges C,Gadeau AP,et al. Cell cycle depent gene expression in quiescent stimulated and asynchronously cycling arterial smooth muscle cells in culture[J] J cell physiol 1992;150:493-500
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5 Mulvany MJ,Baandrup V,Gundersen HJG. Evidence for hyperplasia in mesenteric resistance vessels of spontanceously hypertensive rats using a three-demensional disector[J] Cir Res 1985;57:794-800
6 Amann K,Gharehbaghi H,Stephan S,et al.Hypertrophy and hyperplasia of smooth muscle cells of small intramyocardial arteries in spontanceously hypertensive rats[J] Hypertens 1995;25:124-131
7 Bennett MR,Anglin S,McEwan JR,et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo by c-myc antisense digodeoxynucleotides[J] J clin Invest 1994;93:820-828
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收稿日期：1999-04-20
反义c-myc寡核苷酸对AVP诱导鼠血管平滑肌
细胞增殖的抑制作用
赵连友,卢少平,李雪,乔怀宇,杨学东
摘要 目的:探讨AVP对鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸对AVP作用的干预效应。
方法:以培养的SD大鼠VSMC为模型，采用培养细胞计数、蛋白质定量和细胞周期分析方法及mRNA打点杂交技术，动态观察AVP对VSMC增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸的干预效果。
结果:(1)AVP促VSMC数目增加，在48h时与对照组比较，有统计学意义(P<0.05);(2)AVP促VSMC的S期百分率增加，与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01);(3) AVP促单个VSMC的蛋白质含量增加，在48h时与对照组比较，差异非常显著(P<0.01);(4)AVP使VSMC的c-myc的mRNA杂交信号比对照组明显地增强；反义c-myc 寡核苷酸与对照组比较，VSMC的c-myc的mRNA杂交信号明显地减弱;(5)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组的VSMC数目和细胞S期百分率均小于AVP组和对照组，并均有非常显著性差异(P<0.01);(6)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组 VSMC的c-myc癌基因mRNA杂交信号强度明显地高于对照组，而低于AVP组;(7)反义c-myc寡核苷酸和AVP共同作用组的单个VSMC蛋白质含量高于对照组(P<0.01);与AVP组比较无显著性差异(P>0.05)。
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结论:AVP促VSMC增殖作用与c-myc癌基因超常表达有关；反义c-myc寡核苷酸特异性抑制VSMC的c-myc癌基因表达，并拮抗AVP的促VSMC增殖作用。但反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC蛋白质合成作用，说明VSMC的蛋白质合成不依赖于c-myc癌基因的表达。此提示反义c-myc 寡核苷酸不能完全逆转高血压引起的血管重构，说明反义c-myc寡核苷酸在防治高血压病的临床应用中具有局限性。
关键词:反义c-myc; 精氨酸加压素; 血管平滑肌细胞
要点：精氨酸加压素(AVP)会使培养的血管平滑肌细胞数量增加，细胞进入S期的数量增加，细胞c-myc癌基因的mRNA表达增加。由DNA自动合成仪合成的反义c-myc核酸片段5 μmol/L加入AVP 1×10-7mmol/L的培养中，表现细胞数量减少，S期细胞数量减少，细胞c-myc癌基因的mRNA表达减少，但不能拮抗AVP的促VDMC一般蛋白质合成，存在一定的局限性。
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中图分类号：R331;Q781;Q7 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0360-03
The Despression of Antisense c-myc Oligodeoxynucleotides on AVP Inducing Proliferation of Rat Vascular Smooth Muscle Cells
ZHAO Lianyou，LU Shaoping，LI Xue，QIAO Huaiyu，YANG Xuedong
(The Cardiology Department,Tangdu Hospital,the Fouth Military Medical University,Xi'an)
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Methods:By means of the cell counting method,protein content measurement,cell cycle analysis and mRNA dot blot hybridzation techniques,cultured VSMCs derived from the aorta of Sprague-Dawley (SD) rat were used to dynamically observe the effect of AVP on VSMCs proliferation and interference effect of antisense c-myc oligodeoxynucleotides.
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Results:(1) the number of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.05); (2) the percentage of S stage of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control (P<0.01); (3) protein content of single VSMC induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.01); (4) compared with the control,AVP could enhance the level of c-myc mRNA expression,but antisence c-myc could decrease the level of c-myc mRNA expression; (5) the cell number and the percentage of S stage VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP together decreased more remarkably than those of the control and AVP group (P<0.01); (6) the level of c-myc mRNA expression of VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP was higher than that of the control,but lower than that of AVP group;(7) protein content of single VSMC incubated with antisense c-myc and AVP together was remarkly higher than that of the control (P<0.01),but was not different from that of AVP group (P>0.05).
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Conclusion:The effect of AVP-induced VSMCs proliferation and hypertrophy was related to c-myc overexpression,antisense c-myc oligonucleotides specially inhibited c-myc expression and AVP-induced VSMCs proliferation. But antisense c-myc could not inhibit the effect of AVP-induced VSMCs protein synthesis. It suggests that VSMCs protein synthesis was independent of the c-myc oncogene expression and that antisense c-myc could not completely reverse the vascular remodeling of EH. The clinical value of antisense c-myc in preventing and treating EH is limited.
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Key Words:antisense c-myc; vasopressin; vascular smooth muscle cell
业已证实，血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖在高血压发病中具有重要意义。精氨酸加压素(AVP)作为一种心血管调节肽,广泛存在于循环和组织中,VSMC中也含有AVP的多肽及其mRNA[1]。文献报道，AVP与高血压发病有关[2];VSMC的增殖与癌基因的异常表达亦有关,其中c-myc在VSMC的增殖中起重要作用[3,4]。本实验在研究 AVP促VSMC增殖的基础上,进一步探讨反义c-myc寡核苷酸(c-myc asON)对AVP诱导VSMC增殖作用的干预效应。
MATERIALS AND METHODS
1 动物及试剂:SD大鼠,体重150～200 g,8～12周龄,由本校实验动物研究中心提供。c-myc的反义核酸片段(5'-AACGTTGAGGGGCAT-3')由DNA自动合成仪(ABI381A型)合成。Lipofectin(LR)为GIBOCOBRL产品。新生牛血清(NBS)由浙江三力公司提供。DMEM培养基为GIBCO产品。
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2 方法
2.1 细胞培养:无菌操作取SD大鼠胸主动脉段,按ROSS法培养VSMC。实验用3～5代传代细胞。
2.2 分组:实验分对照组、AVP组、反义c-myc寡核苷酸组、AVP+反义c-myc 寡核苷酸组。AVP和反义c-myc寡核苷酸的终浓度分别为1×10-7mmol/L和5 μmol/L。
2.3 细胞周期分析:将培养的VSMC消化成单个细胞,用含20%NBS的DMEM培养液调整活细胞数为1×105个/ml,分别加入到50 ml培养瓶中,每瓶加2 ml。置37℃、5%CO2培养箱孵育24 h,换成不含NBS的DMEM培养液,加入不同试剂,继续培养并分别在24 h和48 h 后终止反应,按流式细胞仪(Eilte profile Ⅱ,Coulter公司)说明书进行VSMC 细胞周期分析。
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2.4 细胞蛋白质含量测定:调整活细胞数为2×105个/ml,加入到 24孔培养板上,每孔加1 ml。按上述方法分别在24 h和48 h时收集细胞,用血球计数板计数,用考马斯亮兰法测定细胞总蛋白含量,计算单个VSMC的蛋白质含量。
2.5 RNA打点杂交:培养的VSMC按实验分组加入刺激物后,在 24 h时收获细胞,细胞总数在2×107左右,经PBS洗涤离心后,提取总RNA,进行RNA质和量测定,经点膜、预杂交，杂交后,洗膜,进行放射自显影。
3 统计学处理:实验数据以均数±标准差(±s)表示,两实验组均数比较应用团体t检验;多组间比较应用F检验。P<0.05为相差显著,P<0.01为相差非常显著。
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RESULTS
1 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC数目增殖的影响:从附图1可知:(1)在作用24 h时,AVP组VSMC数为(38.50±0.85)×104,与对照组(38.30±3.40)×104比较无统计学意义(P>0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为(35.25±0.96)×104,明显地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(2)在作用48 h时,AVP组VSMC数为(55.0±3.56)×104,高于对照组(51.50±4.43)×104,两组比较有统计学意义(P<0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为( 46.50±1.29)×104,显著地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(3)在作用48h时,对照组、AVP组和反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC 数显著地高于24 h时相应各组(P<0.01)。
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Fig 1 Effect of antisense c-myc on AVP induced VSMC proliferation▲ P<0.01,vs control group and AVP group;△ P<0.05,vs control group;* P<0.01,vs 24h group.
2 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC蛋白质合成的影响:见表1。
Tab 1 Effect of antisense c-myc on AVP-Induced per-VSMC protein synthesis(±s)
Group
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VSMC protein content(pg/cell)
24 h
48 h
Ⅰ(control)
439.08±37.26
620.77±28.77△
Ⅱ(AVP)
467.61±7.01
760.67±11.55*△
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
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753.97±13.74*△
*:P<0.01,vsⅠgroup; △:P<0.01,vs 24h group,respectively.
从表1可知:(1)加入不同试剂作用24h时,Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组间单个VSMC蛋白质含量无显著性差异(P>0.05);(2)加入不同试剂作用48 h时,Ⅱ组和Ⅲ组单个VSMC蛋白质含量显著地高于Ⅰ组(P<0.01)。Ⅱ组单个VSMC蛋白质含量高于Ⅲ组，但无显著性差异(P>0.05);(3)加入不同试剂48 h时,各组单个VSMC蛋白质含量显著高于24h时相应各组(P<0.01)。
3 反义c-myc寡核苷酸对VSMC细胞周期变化的影响:见表2。
Tab 2 Cell cycle of the VSMC(±s)
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Groups
Cell cycle of the VSMC (%)
G0/G1
S phase
G2M
Ⅰ(control)
34.97±4.13
58.60±1.40
6.40±2.82
Ⅱ(AVP)
18.90±0.56△
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73.40±2.11△
7.70±2.02
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
49.47±2.57*
47.23±0.81*
6.70±2.12
△:P<0.01,vsⅠgroup;* P<0.01,vs Ⅰgroup and Ⅱ group.
由表2可知:(1)在作用48h时,Ⅱ组的VSMC的S期百分率明显地高于Ⅰ组,而其G0/G1期百分率明显低于Ⅰ组,且两组比较均有显著性差异(P<0.01)。Ⅱ组的G2M期百分率高于Ⅰ组和Ⅲ组,但无统计学意义(P>0.05);(2)在作用48 h时,Ⅲ组的VSMC的G0/G1期百分率均明显高于Ⅰ组和Ⅱ组,而其S期百分率明显地低于Ⅰ组和Ⅱ组,两组比较均有非常显著性差异(P<0.01)。
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4 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC的c-myc癌基因表达的影响:见Fig 2。
Fig 2 不同因素对VSMC的c-myc癌基因表达的影响
A:control; B:AVP; C:c-myc asON+AVP; D:c-myc asON
从照片1可以看出:(1)AVP组VSMC的mRNA杂交信号强度明显高于对照组；(2)反义c-myc寡核苷酸组VSMC的mRNA杂交信号强度明显低于对照组和AVP组；(3)反义c-myc寡核苷酸+AVP组的VSMC的mRNA杂交信号强度明显地低于AVP组。
DISCUSSION
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1 AVP诱导VSMC增殖肥大的作用
高血压的发病机制较为复杂,迄今为止还不十分清楚。晚近研究表明，许多血管活性物质参与了高血压的发生和发展过程。AVP 是一个具有缩血管作用的活性物质,但由于循环AVP的缩血管作用可以被窦弓反射所缓解,故其在高血压发病中的作用一直未被重视。近年来研究表明，SHR、SHRsp、DOCA盐高血压大鼠血浆中AVP水平均较实验鼠明显升高。高血压病患者血浆AVP浓度亦比正常人明显升高,且AVP浓度与病情有关[2]。故有人指出，循环血容量中AVP 浓度的升高可能是造成高血压的重要原因之一。Simon和Barry[1]又在局部VSMC中发现存在AVP的多肽及其mRNA。本研究结果也显示:AVP可促培养的VSMC 细胞数增加,使VSMC的S期百分率(即DNA合成)和单个细胞蛋白质含量增加,且AVP促VSMC 增加、S期百分率和蛋白质合成增加作用与其作用时间有关。说明AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。提示AVP不仅可以调节VSMC的生长 ,促进蛋白质的表达,而且可能还是VSMC分化期间的重要调节因子。因此,AVP在高血压发病中的作用不可忽视。
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目前认为,高血压与心血管的结构改变有关。Mulvany等人[5] 用三维切片方法发现SHR在血压升高前在肠系膜动脉中就已经存在VSMC增殖。Amann等[6]人用体视学方法发现,在高血压大鼠的心肌重构过程中,心肌内小动脉中存在VSMC的增殖和肥大,VSMC的增殖肥大不仅提高了对高血压的反应性,而且有助于血压的进一步升高。因此,高血压的细胞学本质是VSMC的增殖肥大。故抑制VSMC的增殖肥大在高血压病治疗中有重要意义。
2 反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC增殖肥大的生物效应
高血压是以VSMC增殖肥大为主要病理改变的疾病。现已证实，AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。本研究结果还证实，AVP促培养的VSMC的c-myc 癌基因的杂交信号明显增强,说明AVP可使c-myc癌基因超常表达,提示AVP致VSMC 增殖肥大作用与c-myc癌基因的超常表达有关。亦说明c-myc癌基因与高血压的发病密切相关。这提示c-myc 原癌基因在高血压和其它血管增殖性疾病中可作为理想的靶分子。
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本研究以与人c-myc核苷酸前五个密码子互补的碱基为顺序,合成反义c-myc 寡核苷酸,作硫代型修饰,研究反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC增殖肥大作用的影响。本实验结果表明:反义c-myc寡核苷酸组c-myc的mRNA杂交信号强度明显低于对照组,说明反义c-myc寡核苷酸可特异地抑制c-myc癌基因的表达。这与Bennett等人[7] 的研究结果相似。在此基础上,本研究进一步显示反义c-myc寡核苷酸与AVP 共同作用组的VSMC的S期百分率、细胞数目明显低于AVP组。说明反义c-myc 寡核苷酸可拮抗AVP的促VSMC增殖作用;当反义c-myc寡核苷酸使VSMC的S期百分率减少时,其G0/G1期百分率均明显增加,这说明反义c-myc寡核苷酸可抑制VSMC进入S期,但可能不阻止VSMC从G0到G1期的转化。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸通过抑制c-myc癌基因表达,阻止VSMC从G0/G1期向S期的转化,抑制AVP促VSMC的增殖作用。VSMC的增殖中包含c-myc的作用,c-myc癌基因及其表达产物在AVP促VSMC增殖中是必不可少的。
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本研究结果还显示:反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组单个VSMC 的蛋白质含量与AVP组比较无明显差异。表明反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC一般 蛋白质合成作用,这进一步说明AVP促VSMC的蛋白质合成作用可能不依赖c-myc癌基因。 这可能是反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC进入S期,使VSMC的DNA合成减少,VSMC 增殖受到抑制。但作为一个活细胞,VSMC要完成它的生理功能,必须进行蛋白质合成,它的DNA转录成mRNA的过程不受c-myc癌基因抑制,AVP可加强DNA到mRNA的转录过程,而不增加蛋白质的降解速度,因此单个VSMC的蛋白质含量增加。反义c-myc 寡核酸可能通过抑制c-myc癌基因表达来拮抗AVP的促VSMC增殖作用,但它不能拮抗AVP的促VSMC一般蛋白质合成作用。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP促VSMC肥大作用。故认为,反义c-myc寡核苷酸在防治高血压引起血管增殖肥厚的临床应用中具有局限性。
本文得到陕西省自然科学基金资助
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作者单位：第四军医大学唐都医院心血管内科，西安 710038
REFERENCES
1 Simon J,Barry GK.Identification of vasopressin mRNA in rat aorta[J] Hypertens 1995;25:1030-1033
2 曹世平,赵连友.精氨酸加压素在高血压发病中的作用及其与P物质的关系[J] 中华内科杂志 1993;32:306-9
3 Gadeau AP,Campan M,Desgranges C. Induction of cell cycle- dependent gene during cell cycle progression of arterial smooth muscle cell in culture[J] J Cell Physiol 1991;146:356-361
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4 Campan M,Desgranges C,Gadeau AP,et al. Cell cycle depent gene expression in quiescent stimulated and asynchronously cycling arterial smooth muscle cells in culture[J] J cell physiol 1992;150:493-500
5 Mulvany MJ,Baandrup V,Gundersen HJG. Evidence for hyperplasia in mesenteric resistance vessels of spontanceously hypertensive rats using a three-demensional disector[J] Cir Res 1985;57:794-800
6 Amann K,Gharehbaghi H,Stephan S,et al.Hypertrophy and hyperplasia of smooth muscle cells of small intramyocardial arteries in spontanceously hypertensive rats[J] Hypertens 1995;25:124-131
7 Bennett MR,Anglin S,McEwan JR,et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo by c-myc antisense digodeoxynucleotides[J] J clin Invest 1994;93:820-828
收稿日期：1999-04-20, 百拇医药
单位：第四军医大学唐都医院心血管内科，西安 710038
关键词：反义c-myc；精氨酸加压素；血管平滑肌细胞
反义c
摘要 目的:探讨AVP对鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸对AVP作用的干预效应。
方法:以培养的SD大鼠VSMC为模型，采用培养细胞计数、蛋白质定量和细胞周期分析方法及mRNA打点杂交技术，动态观察AVP对VSMC增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸的干预效果。
结果:(1)AVP促VSMC数目增加，在48h时与对照组比较，有统计学意义(P<0.05);(2)AVP促VSMC的S期百分率增加，与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01);(3) AVP促单个VSMC的蛋白质含量增加，在48h时与对照组比较，差异非常显著(P<0.01);(4)AVP使VSMC的c-myc的mRNA杂交信号比对照组明显地增强；反义c-myc 寡核苷酸与对照组比较，VSMC的c-myc的mRNA杂交信号明显地减弱;(5)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组的VSMC数目和细胞S期百分率均小于AVP组和对照组，并均有非常显著性差异(P<0.01);(6)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组 VSMC的c-myc癌基因mRNA杂交信号强度明显地高于对照组，而低于AVP组;(7)反义c-myc寡核苷酸和AVP共同作用组的单个VSMC蛋白质含量高于对照组(P<0.01);与AVP组比较无显著性差异(P>0.05)。
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结论:AVP促VSMC增殖作用与c-myc癌基因超常表达有关；反义c-myc寡核苷酸特异性抑制VSMC的c-myc癌基因表达，并拮抗AVP的促VSMC增殖作用。但反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC蛋白质合成作用，说明VSMC的蛋白质合成不依赖于c-myc癌基因的表达。此提示反义c-myc 寡核苷酸不能完全逆转高血压引起的血管重构，说明反义c-myc寡核苷酸在防治高血压病的临床应用中具有局限性。
要点：精氨酸加压素(AVP)会使培养的血管平滑肌细胞数量增加，细胞进入S期的数量增加，细胞c-myc癌基因的mRNA表达增加。由DNA自动合成仪合成的反义c-myc核酸片段5 μmol/L加入AVP 1×10-7mmol/L的培养中，表现细胞数量减少，S期细胞数量减少，细胞c-myc癌基因的mRNA表达减少，但不能拮抗AVP的促VDMC一般蛋白质合成，存在一定的局限性。
中图分类号：R331;Q781;Q7 文献标识码：A
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文章编号：1006-2866(1999)04-0360-03
The Despression of Antisense c-myc Oligodeoxynucleotides on AVP Inducing Proliferation of Rat Vascular Smooth Muscle Cells
ZHAO Lianyou，LU Shaoping，LI Xue，QIAO Huaiyu，YANG Xuedong
(The Cardiology Department,Tangdu Hospital,the Fouth Military Medical University,Xi'an)
ABSTRACT Aim:To investgate the effect of AVP on rat smooth muscle cells (VSMCs) proliferation and observe the interference effect of antisence c-myc oligodeoxynucleotides on AVP action.
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Methods:By means of the cell counting method,protein content measurement,cell cycle analysis and mRNA dot blot hybridzation techniques,cultured VSMCs derived from the aorta of Sprague-Dawley (SD) rat were used to dynamically observe the effect of AVP on VSMCs proliferation and interference effect of antisense c-myc oligodeoxynucleotides.
Results:(1) the number of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.05); (2) the percentage of S stage of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control (P<0.01); (3) protein content of single VSMC induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.01); (4) compared with the control,AVP could enhance the level of c-myc mRNA expression,but antisence c-myc could decrease the level of c-myc mRNA expression; (5) the cell number and the percentage of S stage VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP together decreased more remarkably than those of the control and AVP group (P<0.01); (6) the level of c-myc mRNA expression of VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP was higher than that of the control,but lower than that of AVP group;(7) protein content of single VSMC incubated with antisense c-myc and AVP together was remarkly higher than that of the control (P<0.01),but was not different from that of AVP group (P>0.05).
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Conclusion:The effect of AVP-induced VSMCs proliferation and hypertrophy was related to c-myc overexpression,antisense c-myc oligonucleotides specially inhibited c-myc expression and AVP-induced VSMCs proliferation. But antisense c-myc could not inhibit the effect of AVP-induced VSMCs protein synthesis. It suggests that VSMCs protein synthesis was independent of the c-myc oncogene expression and that antisense c-myc could not completely reverse the vascular remodeling of EH. The clinical value of antisense c-myc in preventing and treating EH is limited.
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Key Words:antisense c-myc; vasopressin; vascular smooth muscle cell
业已证实，血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖在高血压发病中具有重要意义。精氨酸加压素(AVP)作为一种心血管调节肽,广泛存在于循环和组织中,VSMC中也含有AVP的多肽及其mRNA[1]。文献报道，AVP与高血压发病有关[2];VSMC的增殖与癌基因的异常表达亦有关,其中c-myc在VSMC的增殖中起重要作用[3,4]。本实验在研究 AVP促VSMC增殖的基础上,进一步探讨反义c-myc寡核苷酸(c-myc asON)对AVP诱导VSMC增殖作用的干预效应。
MATERIALS AND METHODS
1 动物及试剂:SD大鼠,体重150～200 g,8～12周龄,由本校实验动物研究中心提供。c-myc的反义核酸片段(5'-AACGTTGAGGGGCAT-3')由DNA自动合成仪(ABI381A型)合成。Lipofectin(LR)为GIBOCOBRL产品。新生牛血清(NBS)由浙江三力公司提供。DMEM培养基为GIBCO产品。
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2 方法
2.1 细胞培养:无菌操作取SD大鼠胸主动脉段,按ROSS法培养VSMC。实验用3～5代传代细胞。
2.2 分组:实验分对照组、AVP组、反义c-myc寡核苷酸组、AVP+反义c-myc 寡核苷酸组。AVP和反义c-myc寡核苷酸的终浓度分别为1×10-7mmol/L和5 μmol/L。
2.3 细胞周期分析:将培养的VSMC消化成单个细胞,用含20%NBS的DMEM培养液调整活细胞数为1×105个/ml,分别加入到50 ml培养瓶中,每瓶加2 ml。置37℃、5%CO2培养箱孵育24 h,换成不含NBS的DMEM培养液,加入不同试剂,继续培养并分别在24 h和48 h 后终止反应,按流式细胞仪(Eilte profile Ⅱ,Coulter公司)说明书进行VSMC 细胞周期分析。
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2.4 细胞蛋白质含量测定:调整活细胞数为2×105个/ml,加入到 24孔培养板上,每孔加1 ml。按上述方法分别在24 h和48 h时收集细胞,用血球计数板计数,用考马斯亮兰法测定细胞总蛋白含量,计算单个VSMC的蛋白质含量。
2.5 RNA打点杂交:培养的VSMC按实验分组加入刺激物后,在 24 h时收获细胞,细胞总数在2×107左右,经PBS洗涤离心后,提取总RNA,进行RNA质和量测定,经点膜、预杂交，杂交后,洗膜,进行放射自显影。
3 统计学处理:实验数据以均数±标准差(
±s)表示,两实验组均数比较应用团体t检验;多组间比较应用F检验。P<0.05为相差显著,P<0.01为相差非常显著。, http://www.100md.com
RESULTS
1 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC数目增殖的影响:从附图1可知:(1)在作用24 h时,AVP组VSMC数为(38.50±0.85)×104,与对照组(38.30±3.40)×104比较无统计学意义(P>0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为(35.25±0.96)×104,明显地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(2)在作用48 h时,AVP组VSMC数为(55.0±3.56)×104,高于对照组(51.50±4.43)×104,两组比较有统计学意义(P<0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为( 46.50±1.29)×104,显著地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(3)在作用48h时,对照组、AVP组和反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC 数显著地高于24 h时相应各组(P<0.01)。
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Fig 1 Effect of antisense c-myc on AVP induced VSMC proliferation▲ P<0.01,vs control group and AVP group;△ P<0.05,vs control group;* P<0.01,vs 24h group.
2 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC蛋白质合成的影响:见表1。
Tab 1 Effect of antisense c-myc on AVP-Induced per-VSMC protein synthesis(
±s)Group
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VSMC protein content(pg/cell)
24 h
48 h
Ⅰ(control)
439.08±37.26
620.77±28.77△
Ⅱ(AVP)
467.61±7.01
760.67±11.55*△
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
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753.97±13.74*△
*:P<0.01,vsⅠgroup; △:P<0.01,vs 24h group,respectively.
从表1可知:(1)加入不同试剂作用24h时,Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组间单个VSMC蛋白质含量无显著性差异(P>0.05);(2)加入不同试剂作用48 h时,Ⅱ组和Ⅲ组单个VSMC蛋白质含量显著地高于Ⅰ组(P<0.01)。Ⅱ组单个VSMC蛋白质含量高于Ⅲ组，但无显著性差异(P>0.05);(3)加入不同试剂48 h时,各组单个VSMC蛋白质含量显著高于24h时相应各组(P<0.01)。
3 反义c-myc寡核苷酸对VSMC细胞周期变化的影响:见表2。
Tab 2 Cell cycle of the VSMC(
±s), 百拇医药
Groups
Cell cycle of the VSMC (%)
G0/G1
S phase
G2M
Ⅰ(control)
34.97±4.13
58.60±1.40
6.40±2.82
Ⅱ(AVP)
18.90±0.56△
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73.40±2.11△
7.70±2.02
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
49.47±2.57*
47.23±0.81*
6.70±2.12
△:P<0.01,vsⅠgroup;* P<0.01,vs Ⅰgroup and Ⅱ group.
由表2可知:(1)在作用48h时,Ⅱ组的VSMC的S期百分率明显地高于Ⅰ组,而其G0/G1期百分率明显低于Ⅰ组,且两组比较均有显著性差异(P<0.01)。Ⅱ组的G2M期百分率高于Ⅰ组和Ⅲ组,但无统计学意义(P>0.05);(2)在作用48 h时,Ⅲ组的VSMC的G0/G1期百分率均明显高于Ⅰ组和Ⅱ组,而其S期百分率明显地低于Ⅰ组和Ⅱ组,两组比较均有非常显著性差异(P<0.01)。
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4 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC的c-myc癌基因表达的影响:见Fig 2。
Fig 2 不同因素对VSMC的c-myc癌基因表达的影响
A:control; B:AVP; C:c-myc asON+AVP; D:c-myc asON
从照片1可以看出:(1)AVP组VSMC的mRNA杂交信号强度明显高于对照组；(2)反义c-myc寡核苷酸组VSMC的mRNA杂交信号强度明显低于对照组和AVP组；(3)反义c-myc寡核苷酸+AVP组的VSMC的mRNA杂交信号强度明显地低于AVP组。
DISCUSSION
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1 AVP诱导VSMC增殖肥大的作用
高血压的发病机制较为复杂,迄今为止还不十分清楚。晚近研究表明，许多血管活性物质参与了高血压的发生和发展过程。AVP 是一个具有缩血管作用的活性物质,但由于循环AVP的缩血管作用可以被窦弓反射所缓解,故其在高血压发病中的作用一直未被重视。近年来研究表明，SHR、SHRsp、DOCA盐高血压大鼠血浆中AVP水平均较实验鼠明显升高。高血压病患者血浆AVP浓度亦比正常人明显升高,且AVP浓度与病情有关[2]。故有人指出，循环血容量中AVP 浓度的升高可能是造成高血压的重要原因之一。Simon和Barry[1]又在局部VSMC中发现存在AVP的多肽及其mRNA。本研究结果也显示:AVP可促培养的VSMC 细胞数增加,使VSMC的S期百分率(即DNA合成)和单个细胞蛋白质含量增加,且AVP促VSMC 增加、S期百分率和蛋白质合成增加作用与其作用时间有关。说明AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。提示AVP不仅可以调节VSMC的生长 ,促进蛋白质的表达,而且可能还是VSMC分化期间的重要调节因子。因此,AVP在高血压发病中的作用不可忽视。
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目前认为,高血压与心血管的结构改变有关。Mulvany等人[5] 用三维切片方法发现SHR在血压升高前在肠系膜动脉中就已经存在VSMC增殖。Amann等[6]人用体视学方法发现,在高血压大鼠的心肌重构过程中,心肌内小动脉中存在VSMC的增殖和肥大,VSMC的增殖肥大不仅提高了对高血压的反应性,而且有助于血压的进一步升高。因此,高血压的细胞学本质是VSMC的增殖肥大。故抑制VSMC的增殖肥大在高血压病治疗中有重要意义。
2 反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC增殖肥大的生物效应
高血压是以VSMC增殖肥大为主要病理改变的疾病。现已证实，AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。本研究结果还证实，AVP促培养的VSMC的c-myc 癌基因的杂交信号明显增强,说明AVP可使c-myc癌基因超常表达,提示AVP致VSMC 增殖肥大作用与c-myc癌基因的超常表达有关。亦说明c-myc癌基因与高血压的发病密切相关。这提示c-myc 原癌基因在高血压和其它血管增殖性疾病中可作为理想的靶分子。
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本研究以与人c-myc核苷酸前五个密码子互补的碱基为顺序,合成反义c-myc 寡核苷酸,作硫代型修饰,研究反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC增殖肥大作用的影响。本实验结果表明:反义c-myc寡核苷酸组c-myc的mRNA杂交信号强度明显低于对照组,说明反义c-myc寡核苷酸可特异地抑制c-myc癌基因的表达。这与Bennett等人[7] 的研究结果相似。在此基础上,本研究进一步显示反义c-myc寡核苷酸与AVP 共同作用组的VSMC的S期百分率、细胞数目明显低于AVP组。说明反义c-myc 寡核苷酸可拮抗AVP的促VSMC增殖作用;当反义c-myc寡核苷酸使VSMC的S期百分率减少时,其G0/G1期百分率均明显增加,这说明反义c-myc寡核苷酸可抑制VSMC进入S期,但可能不阻止VSMC从G0到G1期的转化。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸通过抑制c-myc癌基因表达,阻止VSMC从G0/G1期向S期的转化,抑制AVP促VSMC的增殖作用。VSMC的增殖中包含c-myc的作用,c-myc癌基因及其表达产物在AVP促VSMC增殖中是必不可少的。
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本研究结果还显示:反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组单个VSMC 的蛋白质含量与AVP组比较无明显差异。表明反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC一般 蛋白质合成作用,这进一步说明AVP促VSMC的蛋白质合成作用可能不依赖c-myc癌基因。 这可能是反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC进入S期,使VSMC的DNA合成减少,VSMC 增殖受到抑制。但作为一个活细胞,VSMC要完成它的生理功能,必须进行蛋白质合成,它的DNA转录成mRNA的过程不受c-myc癌基因抑制,AVP可加强DNA到mRNA的转录过程,而不增加蛋白质的降解速度,因此单个VSMC的蛋白质含量增加。反义c-myc 寡核酸可能通过抑制c-myc癌基因表达来拮抗AVP的促VSMC增殖作用,但它不能拮抗AVP的促VSMC一般蛋白质合成作用。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP促VSMC肥大作用。故认为,反义c-myc寡核苷酸在防治高血压引起血管增殖肥厚的临床应用中具有局限性。
本文得到陕西省自然科学基金资助
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REFERENCES
1 Simon J,Barry GK.Identification of vasopressin mRNA in rat aorta[J] Hypertens 1995;25:1030-1033
2 曹世平,赵连友.精氨酸加压素在高血压发病中的作用及其与P物质的关系[J] 中华内科杂志 1993;32:306-9
3 Gadeau AP,Campan M,Desgranges C. Induction of cell cycle- dependent gene during cell cycle progression of arterial smooth muscle cell in culture[J] J Cell Physiol 1991;146:356-361
4 Campan M,Desgranges C,Gadeau AP,et al. Cell cycle depent gene expression in quiescent stimulated and asynchronously cycling arterial smooth muscle cells in culture[J] J cell physiol 1992;150:493-500
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5 Mulvany MJ,Baandrup V,Gundersen HJG. Evidence for hyperplasia in mesenteric resistance vessels of spontanceously hypertensive rats using a three-demensional disector[J] Cir Res 1985;57:794-800
6 Amann K,Gharehbaghi H,Stephan S,et al.Hypertrophy and hyperplasia of smooth muscle cells of small intramyocardial arteries in spontanceously hypertensive rats[J] Hypertens 1995;25:124-131
7 Bennett MR,Anglin S,McEwan JR,et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo by c-myc antisense digodeoxynucleotides[J] J clin Invest 1994;93:820-828
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收稿日期：1999-04-20
反义c-myc寡核苷酸对AVP诱导鼠血管平滑肌
细胞增殖的抑制作用
赵连友,卢少平,李雪,乔怀宇,杨学东
摘要 目的:探讨AVP对鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸对AVP作用的干预效应。
方法:以培养的SD大鼠VSMC为模型，采用培养细胞计数、蛋白质定量和细胞周期分析方法及mRNA打点杂交技术，动态观察AVP对VSMC增殖的影响和反义c-myc寡核苷酸的干预效果。
结果:(1)AVP促VSMC数目增加，在48h时与对照组比较，有统计学意义(P<0.05);(2)AVP促VSMC的S期百分率增加，与对照组比较有非常显著性差异(P<0.01);(3) AVP促单个VSMC的蛋白质含量增加，在48h时与对照组比较，差异非常显著(P<0.01);(4)AVP使VSMC的c-myc的mRNA杂交信号比对照组明显地增强；反义c-myc 寡核苷酸与对照组比较，VSMC的c-myc的mRNA杂交信号明显地减弱;(5)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组的VSMC数目和细胞S期百分率均小于AVP组和对照组，并均有非常显著性差异(P<0.01);(6)反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组 VSMC的c-myc癌基因mRNA杂交信号强度明显地高于对照组，而低于AVP组;(7)反义c-myc寡核苷酸和AVP共同作用组的单个VSMC蛋白质含量高于对照组(P<0.01);与AVP组比较无显著性差异(P>0.05)。
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结论:AVP促VSMC增殖作用与c-myc癌基因超常表达有关；反义c-myc寡核苷酸特异性抑制VSMC的c-myc癌基因表达，并拮抗AVP的促VSMC增殖作用。但反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC蛋白质合成作用，说明VSMC的蛋白质合成不依赖于c-myc癌基因的表达。此提示反义c-myc 寡核苷酸不能完全逆转高血压引起的血管重构，说明反义c-myc寡核苷酸在防治高血压病的临床应用中具有局限性。
关键词:反义c-myc; 精氨酸加压素; 血管平滑肌细胞
要点：精氨酸加压素(AVP)会使培养的血管平滑肌细胞数量增加，细胞进入S期的数量增加，细胞c-myc癌基因的mRNA表达增加。由DNA自动合成仪合成的反义c-myc核酸片段5 μmol/L加入AVP 1×10-7mmol/L的培养中，表现细胞数量减少，S期细胞数量减少，细胞c-myc癌基因的mRNA表达减少，但不能拮抗AVP的促VDMC一般蛋白质合成，存在一定的局限性。
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中图分类号：R331;Q781;Q7 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0360-03
The Despression of Antisense c-myc Oligodeoxynucleotides on AVP Inducing Proliferation of Rat Vascular Smooth Muscle Cells
ZHAO Lianyou，LU Shaoping，LI Xue，QIAO Huaiyu，YANG Xuedong
(The Cardiology Department,Tangdu Hospital,the Fouth Military Medical University,Xi'an)
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Methods:By means of the cell counting method,protein content measurement,cell cycle analysis and mRNA dot blot hybridzation techniques,cultured VSMCs derived from the aorta of Sprague-Dawley (SD) rat were used to dynamically observe the effect of AVP on VSMCs proliferation and interference effect of antisense c-myc oligodeoxynucleotides.
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Results:(1) the number of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.05); (2) the percentage of S stage of VSMCs induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control (P<0.01); (3) protein content of single VSMC induced by AVP was significantly increased in comparision with that of the control at 48h (P<0.01); (4) compared with the control,AVP could enhance the level of c-myc mRNA expression,but antisence c-myc could decrease the level of c-myc mRNA expression; (5) the cell number and the percentage of S stage VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP together decreased more remarkably than those of the control and AVP group (P<0.01); (6) the level of c-myc mRNA expression of VSMCs incubated with antisense c-myc and AVP was higher than that of the control,but lower than that of AVP group;(7) protein content of single VSMC incubated with antisense c-myc and AVP together was remarkly higher than that of the control (P<0.01),but was not different from that of AVP group (P>0.05).
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Conclusion:The effect of AVP-induced VSMCs proliferation and hypertrophy was related to c-myc overexpression,antisense c-myc oligonucleotides specially inhibited c-myc expression and AVP-induced VSMCs proliferation. But antisense c-myc could not inhibit the effect of AVP-induced VSMCs protein synthesis. It suggests that VSMCs protein synthesis was independent of the c-myc oncogene expression and that antisense c-myc could not completely reverse the vascular remodeling of EH. The clinical value of antisense c-myc in preventing and treating EH is limited.
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Key Words:antisense c-myc; vasopressin; vascular smooth muscle cell
业已证实，血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖在高血压发病中具有重要意义。精氨酸加压素(AVP)作为一种心血管调节肽,广泛存在于循环和组织中,VSMC中也含有AVP的多肽及其mRNA[1]。文献报道，AVP与高血压发病有关[2];VSMC的增殖与癌基因的异常表达亦有关,其中c-myc在VSMC的增殖中起重要作用[3,4]。本实验在研究 AVP促VSMC增殖的基础上,进一步探讨反义c-myc寡核苷酸(c-myc asON)对AVP诱导VSMC增殖作用的干预效应。
MATERIALS AND METHODS
1 动物及试剂:SD大鼠,体重150～200 g,8～12周龄,由本校实验动物研究中心提供。c-myc的反义核酸片段(5'-AACGTTGAGGGGCAT-3')由DNA自动合成仪(ABI381A型)合成。Lipofectin(LR)为GIBOCOBRL产品。新生牛血清(NBS)由浙江三力公司提供。DMEM培养基为GIBCO产品。
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2 方法
2.1 细胞培养:无菌操作取SD大鼠胸主动脉段,按ROSS法培养VSMC。实验用3～5代传代细胞。
2.2 分组:实验分对照组、AVP组、反义c-myc寡核苷酸组、AVP+反义c-myc 寡核苷酸组。AVP和反义c-myc寡核苷酸的终浓度分别为1×10-7mmol/L和5 μmol/L。
2.3 细胞周期分析:将培养的VSMC消化成单个细胞,用含20%NBS的DMEM培养液调整活细胞数为1×105个/ml,分别加入到50 ml培养瓶中,每瓶加2 ml。置37℃、5%CO2培养箱孵育24 h,换成不含NBS的DMEM培养液,加入不同试剂,继续培养并分别在24 h和48 h 后终止反应,按流式细胞仪(Eilte profile Ⅱ,Coulter公司)说明书进行VSMC 细胞周期分析。
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2.4 细胞蛋白质含量测定:调整活细胞数为2×105个/ml,加入到 24孔培养板上,每孔加1 ml。按上述方法分别在24 h和48 h时收集细胞,用血球计数板计数,用考马斯亮兰法测定细胞总蛋白含量,计算单个VSMC的蛋白质含量。
2.5 RNA打点杂交:培养的VSMC按实验分组加入刺激物后,在 24 h时收获细胞,细胞总数在2×107左右,经PBS洗涤离心后,提取总RNA,进行RNA质和量测定,经点膜、预杂交，杂交后,洗膜,进行放射自显影。
3 统计学处理:实验数据以均数±标准差(
±s)表示,两实验组均数比较应用团体t检验;多组间比较应用F检验。P<0.05为相差显著,P<0.01为相差非常显著。, 百拇医药
RESULTS
1 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC数目增殖的影响:从附图1可知:(1)在作用24 h时,AVP组VSMC数为(38.50±0.85)×104,与对照组(38.30±3.40)×104比较无统计学意义(P>0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为(35.25±0.96)×104,明显地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(2)在作用48 h时,AVP组VSMC数为(55.0±3.56)×104,高于对照组(51.50±4.43)×104,两组比较有统计学意义(P<0.05)。反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC数为( 46.50±1.29)×104,显著地低于对照组和AVP组(P<0.01)；(3)在作用48h时,对照组、AVP组和反义c-myc寡核苷酸+AVP组VSMC 数显著地高于24 h时相应各组(P<0.01)。
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Fig 1 Effect of antisense c-myc on AVP induced VSMC proliferation▲ P<0.01,vs control group and AVP group;△ P<0.05,vs control group;* P<0.01,vs 24h group.
2 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC蛋白质合成的影响:见表1。
Tab 1 Effect of antisense c-myc on AVP-Induced per-VSMC protein synthesis(
±s)Group
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VSMC protein content(pg/cell)
24 h
48 h
Ⅰ(control)
439.08±37.26
620.77±28.77△
Ⅱ(AVP)
467.61±7.01
760.67±11.55*△
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
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753.97±13.74*△
*:P<0.01,vsⅠgroup; △:P<0.01,vs 24h group,respectively.
从表1可知:(1)加入不同试剂作用24h时,Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组间单个VSMC蛋白质含量无显著性差异(P>0.05);(2)加入不同试剂作用48 h时,Ⅱ组和Ⅲ组单个VSMC蛋白质含量显著地高于Ⅰ组(P<0.01)。Ⅱ组单个VSMC蛋白质含量高于Ⅲ组，但无显著性差异(P>0.05);(3)加入不同试剂48 h时,各组单个VSMC蛋白质含量显著高于24h时相应各组(P<0.01)。
3 反义c-myc寡核苷酸对VSMC细胞周期变化的影响:见表2。
Tab 2 Cell cycle of the VSMC(
±s), http://www.100md.com
Groups
Cell cycle of the VSMC (%)
G0/G1
S phase
G2M
Ⅰ(control)
34.97±4.13
58.60±1.40
6.40±2.82
Ⅱ(AVP)
18.90±0.56△
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73.40±2.11△
7.70±2.02
Ⅲ(c-myc asON+AVP)
49.47±2.57*
47.23±0.81*
6.70±2.12
△:P<0.01,vsⅠgroup;* P<0.01,vs Ⅰgroup and Ⅱ group.
由表2可知:(1)在作用48h时,Ⅱ组的VSMC的S期百分率明显地高于Ⅰ组,而其G0/G1期百分率明显低于Ⅰ组,且两组比较均有显著性差异(P<0.01)。Ⅱ组的G2M期百分率高于Ⅰ组和Ⅲ组,但无统计学意义(P>0.05);(2)在作用48 h时,Ⅲ组的VSMC的G0/G1期百分率均明显高于Ⅰ组和Ⅱ组,而其S期百分率明显地低于Ⅰ组和Ⅱ组,两组比较均有非常显著性差异(P<0.01)。
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4 反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC的c-myc癌基因表达的影响:见Fig 2。
Fig 2 不同因素对VSMC的c-myc癌基因表达的影响
A:control; B:AVP; C:c-myc asON+AVP; D:c-myc asON
从照片1可以看出:(1)AVP组VSMC的mRNA杂交信号强度明显高于对照组；(2)反义c-myc寡核苷酸组VSMC的mRNA杂交信号强度明显低于对照组和AVP组；(3)反义c-myc寡核苷酸+AVP组的VSMC的mRNA杂交信号强度明显地低于AVP组。
DISCUSSION
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1 AVP诱导VSMC增殖肥大的作用
高血压的发病机制较为复杂,迄今为止还不十分清楚。晚近研究表明，许多血管活性物质参与了高血压的发生和发展过程。AVP 是一个具有缩血管作用的活性物质,但由于循环AVP的缩血管作用可以被窦弓反射所缓解,故其在高血压发病中的作用一直未被重视。近年来研究表明，SHR、SHRsp、DOCA盐高血压大鼠血浆中AVP水平均较实验鼠明显升高。高血压病患者血浆AVP浓度亦比正常人明显升高,且AVP浓度与病情有关[2]。故有人指出，循环血容量中AVP 浓度的升高可能是造成高血压的重要原因之一。Simon和Barry[1]又在局部VSMC中发现存在AVP的多肽及其mRNA。本研究结果也显示:AVP可促培养的VSMC 细胞数增加,使VSMC的S期百分率(即DNA合成)和单个细胞蛋白质含量增加,且AVP促VSMC 增加、S期百分率和蛋白质合成增加作用与其作用时间有关。说明AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。提示AVP不仅可以调节VSMC的生长 ,促进蛋白质的表达,而且可能还是VSMC分化期间的重要调节因子。因此,AVP在高血压发病中的作用不可忽视。
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目前认为,高血压与心血管的结构改变有关。Mulvany等人[5] 用三维切片方法发现SHR在血压升高前在肠系膜动脉中就已经存在VSMC增殖。Amann等[6]人用体视学方法发现,在高血压大鼠的心肌重构过程中,心肌内小动脉中存在VSMC的增殖和肥大,VSMC的增殖肥大不仅提高了对高血压的反应性,而且有助于血压的进一步升高。因此,高血压的细胞学本质是VSMC的增殖肥大。故抑制VSMC的增殖肥大在高血压病治疗中有重要意义。
2 反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC增殖肥大的生物效应
高血压是以VSMC增殖肥大为主要病理改变的疾病。现已证实，AVP具有促VSMC增殖和肥大作用。本研究结果还证实，AVP促培养的VSMC的c-myc 癌基因的杂交信号明显增强,说明AVP可使c-myc癌基因超常表达,提示AVP致VSMC 增殖肥大作用与c-myc癌基因的超常表达有关。亦说明c-myc癌基因与高血压的发病密切相关。这提示c-myc 原癌基因在高血压和其它血管增殖性疾病中可作为理想的靶分子。
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本研究以与人c-myc核苷酸前五个密码子互补的碱基为顺序,合成反义c-myc 寡核苷酸,作硫代型修饰,研究反义c-myc寡核苷酸对AVP促VSMC增殖肥大作用的影响。本实验结果表明:反义c-myc寡核苷酸组c-myc的mRNA杂交信号强度明显低于对照组,说明反义c-myc寡核苷酸可特异地抑制c-myc癌基因的表达。这与Bennett等人[7] 的研究结果相似。在此基础上,本研究进一步显示反义c-myc寡核苷酸与AVP 共同作用组的VSMC的S期百分率、细胞数目明显低于AVP组。说明反义c-myc 寡核苷酸可拮抗AVP的促VSMC增殖作用;当反义c-myc寡核苷酸使VSMC的S期百分率减少时,其G0/G1期百分率均明显增加,这说明反义c-myc寡核苷酸可抑制VSMC进入S期,但可能不阻止VSMC从G0到G1期的转化。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸通过抑制c-myc癌基因表达,阻止VSMC从G0/G1期向S期的转化,抑制AVP促VSMC的增殖作用。VSMC的增殖中包含c-myc的作用,c-myc癌基因及其表达产物在AVP促VSMC增殖中是必不可少的。
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本研究结果还显示:反义c-myc寡核苷酸与AVP共同作用组单个VSMC 的蛋白质含量与AVP组比较无明显差异。表明反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP的促VSMC一般 蛋白质合成作用,这进一步说明AVP促VSMC的蛋白质合成作用可能不依赖c-myc癌基因。 这可能是反义c-myc寡核苷酸抑制VSMC进入S期,使VSMC的DNA合成减少,VSMC 增殖受到抑制。但作为一个活细胞,VSMC要完成它的生理功能,必须进行蛋白质合成,它的DNA转录成mRNA的过程不受c-myc癌基因抑制,AVP可加强DNA到mRNA的转录过程,而不增加蛋白质的降解速度,因此单个VSMC的蛋白质含量增加。反义c-myc 寡核酸可能通过抑制c-myc癌基因表达来拮抗AVP的促VSMC增殖作用,但它不能拮抗AVP的促VSMC一般蛋白质合成作用。这进一步提示反义c-myc寡核苷酸不能拮抗AVP促VSMC肥大作用。故认为,反义c-myc寡核苷酸在防治高血压引起血管增殖肥厚的临床应用中具有局限性。
本文得到陕西省自然科学基金资助
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作者单位：第四军医大学唐都医院心血管内科，西安 710038
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