商陆皂苷甲对大鼠Heymann肾炎的治疗作用及对细胞因子的影响

http://www.100md.com 2003年8月25日 《药学学报》 1999年第1期

     作者：鞠佃文 郑钦岳¹ 曹雪涛 梅小斌 易杨华¹

    单位：(第二军医大学免疫学教研室；¹药学院， 上海 200433)

    关键词：商陆皂苷甲； Heymann肾炎； 白细胞介素1； 肿瘤坏死因子； 白细胞介素6

    药学学报990103.htm 摘要 目的： 商陆皂苷甲(EsA)对大鼠Heymann肾炎(passive Heymann nephritis，PHN)的治疗作用及机理。方法： 大鼠sc Fx1A抗原的抗体制成自身免疫性肾小球肾炎，EsA 5,10和20 mg^.kg^-1.d^-1 ip，连续14 d。结果： EsA可以显著减少肾炎大鼠尿蛋白的产生，电镜和免疫荧光检查发现EsA治疗后肾炎大鼠病理情况明显好转。EsA治疗对血清中炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1(IL-1)和白细胞介素6(IL-6)的产生具有显著的抑制作用。结论： EsA对大鼠Heymann肾炎具有显著治疗作用，抑制细胞因子产生可能参与EsA抗炎机制。

    THERAPEUTIC EFFECTS OF ESCULENTOSIDE A ON PASSIVE HEYMANN

    NEPHRITIS IN RATS AND ITS INHIBITION ON CYTOKINE PRODUCTION

    Ju Dianwen(Ju DW), Zheng Qinyue(Zheng QY)¹, Cao Xuetao(Cao XT),Mei Xiaobin(Mei XB) and Yi Yanghua(Yi YH)¹

    (Department of Immunology, ¹School of Pharmacy,Second Military Medical University, Shanghai 200433)

    ABSTRACT AIM: To investigate the therapeutic effects of esculentoside A, a kind of saponin isolated from the root of the Chinese herb Phytolaca esculenta, on passive Heymann nephritis (PHN) in rats. METHODS: PHN was prepared by injecting Fx1A antibody in rats, and esculentoside A 5, 10 and 20 mg^.kg^-1 were administered intraperitonealy once a day for 14 consecutive days for the treatment of PHN rats. RESULTS: Esculentoside A 5, 10 and 20 mg^.kg^-1 decreased urine protein production significantly. Pathological analysis revealed that deposits of IgG along the capillary wall of the glomerulus, glomerulus base membrane thickness and electron-dense deposits in PHN rats after treatment with esculentoside A were less than those in control rats. Decreased levels of TNF, IL-1 and IL-6 were observed in the sera of PHN rats following esculentoside A administration. TNF, IL-1 and IL-6 are important cytokines involved in the pathogenesis of inflammatory lesions. CONCLUSION: Esculentoside A possessed potent anti-inflammatory effects on PHN. Inhibition of inflammatory cytokine production may partially explain the anti-inflammatory effects of esculentoside A.

    KEY WORDS esculentoside A; passive Heymann nephritis; tumor necrosis factor; interleukin 1; interleukin 6

    商陆皂苷甲(esculentoside A, EsA)是从中国商陆(Phytolacca esculenta van Houtte)的块根中提取的一种三萜皂苷化合物^[1]，我们在以往实验中发现，EsA有很强的抗炎作用，对急性渗出性炎症，肉芽肿增生的慢性炎症及其他一些炎症模型都有明显抑制作用^[2]。本试验观察了EsA对大鼠Heymann肾炎(PHN)的治疗作用, 并初步探讨了其作用机理。

    材料和方法

    药品与试剂 EsA纯度大于98%，用磷酸缓冲液(PBS)溶解。福氏完全佐剂(CFA)，RPMI-1640培养基，Con A, 白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子(TNF), 放线菌素D购自Sigma公司。³H-TdR购自上海原子核研究所，比活841 TBq^.mol^-1。

    动物 新西兰兔，(2.5±0.3) kg，♂；Spague-Dawley大鼠，(300±20) g,♂，由中英合资上海SIPPR-BK实验动物有限公司提供。

    大鼠Heymann肾炎模型的制备 ♂大鼠，麻醉后仰卧位固定，取腹部正中切口，用4℃含肝素磷酸缓冲液(PBS)灌注肾脏，取下肾脏，低温下分离肾实质，过150目不锈钢筛网，收集滤液，4℃离心(400×g，9 min)，弃沉淀，上清液再离心3次，至上清液无沉淀，上清液超速离心(70 000×g，45 min)弃上清

    液，吹打沉淀，反复洗涤3次，最后沉淀物即为近曲小管刷状缘抗原Fx1A, 冷冻干燥，保存在-30℃。

    ♂新西兰兔，用等量CFA乳化Fx1A抗原，皮下多点注射，每周2次，共6次，放血制成血清，测效价为1∶64，按1 ml^.100 g^-1剂量从尾静脉注射给雄性大鼠，一周后出现蛋白尿，14 d后大鼠分为5组，3组分别给EsA 5,10和20 mg^.kg^-1，一组给地塞米松(DXM) 1 mg^.kg^-1，一组给生理盐水作为对照组，治疗14 d后处死，取血清及肾标本^[3]。

    尿蛋白观察 用磺基水杨酸比浊法，收集大鼠24 h尿液，测定500 nm处A值，按标准曲线Y=-0.0035+0.3078X， γ=0.9965, 换算成尿蛋白含量(mg^.L^-1)，以治疗后与治疗前相比较尿蛋白减少表示。

    免疫荧光检查(IF) 用荧光素标记的羊抗兔IgG,兔抗鼠IgG在冰冻切片(厚4 μm)上直接做IF检查，观察兔IgG、大鼠IgG在肾小球内的沉淀和分布情况。

    电镜检查 肾组织标本切成1 mm³组织块，先后经0.25%多聚甲苯-0.2%戊二醛混合液和1%锇酸固定，经70%醋酸钠乙醇溶液及环氧丙烷处理，包埋定位切片，染色后用JEM100SX透射电镜观察。

    血清TNF的生物测定 采用L929作为靶细胞的结晶紫染色法测定TNF。将传代培养的L929细胞按2×10⁴/孔接种到96孔培养板上，培养24 h后加入含有10%FCS的RPMI-1640培养基稀释的TNF样品和放线菌素D(1 μg^.ml^-1), NaF 2 mmol^.L^-1，继续培养18 h后弃去上清液，将培养板浸入结晶紫染液中染色20 min，洗去未被细胞掺入的染料，室温干燥，每孔加入0.1 ml结晶紫提取液，振荡后用酶联仪于595 nm处测定各孔吸光度值A，将A与log 2样本稀释倍数作线性回归，并由此计算出A值为对照孔(只加放线菌素D和NaF)A值一半时样本的稀释倍数(50%杀伤时的稀释倍数)定为样本的TNF单位数^[4]。

    血清IL-1的诱生与检测 IL-1的测定采用小鼠胸腺细胞增殖法。以样本1∶32稀释度时刺激2.5 μg^.ml^-1 ConA诱导的小鼠胸腺细胞增殖时³H-TdR的掺入值表示IL-1的生物活性^[5]。

    血清IL-6的生物测定 IL-6的测定采用IL-6依赖性的细胞株B9。细胞用含有10%FCS，重组IL-6的RPMI-1640培养基传代培养，2～3 d传代1次。传代后d 2离心(1 000 r^.min^-1, 10 min)收集细胞，用RPMI-1640洗涤3次，调整细胞浓度至10^4.ml^-1，按每孔0.1 ml加至96孔板上，同时加入标准IL-6或待测样本上清液，于37℃，5% CO₂, 饱和温度条件下培养60 h，每孔加入³H-TdR 1.85×10³ Bq，继续孵育12 h后用多差别细胞收集仪将细胞收集在纤维滤纸上，烘干，加入闪烁液并在液闪计数仪上测定³H-TdR的掺入值。以cpm值大小表示IL-6的活性高低^[6]。

    实验结果 以±s表示，显著性测定用t检验。

    实验结果

    1 EsA对尿蛋白变化

    图1结果显示，对照组PHN大鼠治疗后尿蛋白的含量与治疗前相比较增加了35.8 mg^.L^-1.d^-1，EsA 5,10和20 mg^.kg^-1 ip，qd，连续14 d可呈剂量依赖性地明显降低尿蛋白的含量(P<0.01)，DXM 1 mg^.kg^-1也能明显降低尿蛋白的产生(P<0.01)。

    Fig 1 Effects of esculentoside A (EsA) 5，10，20 mg^.kg^-1 ip on the reduction of urine protein production in passive Heymann nephritis(PHN) rats. n=10, ±s. ^*P<0.05, ^**P<0.01 compared with control group. DXM: Dexamethasene.

    2 免疫荧光与电镜分析

    免疫荧光镜检结果显示，PHN大鼠IgG沿肾小球毛细血管袢呈弥漫，颗粒状沉淀，荧光较强(+++)，EsA 10 mg^.kg^-1 qd，连续治疗两周后，荧光明显降低(+)。电子显微镜结果表明，PHN大鼠可见肾小球基底膜上及皮下电子致密物沉积，肾小球基底膜不规则增厚(图2A)， EsA 10 mg^.kg^-1治疗组大鼠病理改变有明显减轻(图2B)。

    Fig 2 Thickness of glomerular basement membrane and electron-dense deposits in passive Heymann nephritis(PHN) rat (A) and in PHN rats after esculentoside A (EsA) 10 mg^.kg^-1 ip (B). EM×20 000.

    3 细胞因子的变化

    PHN肾炎大鼠治疗结束时放血，测血清中IL-1，TNF，IL-6的含量。表1结果表明。EsA 5,10,20 mg^.kg^-1可以呈剂量依赖性地明显降低大鼠血清TNF,IL-1和IL-6的水平。DXM也可以显著降低大鼠血清细胞因子的水平。

    Tab 1 Effects of esculentoside A (EsA) ip on production of IL-1, IL-6 and TNF in rat sera Group

    /mg^.kg^-1

    TNF activity

    /U^.ml^-1

    IL-1 activity

    /cpm

    IL-6 activity

    /cpm

    PHN

    59.1±6.5

    3536±389

    5686±682

    EsA (5)

    23.7±5.8^**

    2168±302^**

    3587±589^**

    (10)

    20.4±3.4^**

    2008±301^**

    2961±365^**

    (20)

    19.6±2.0^**

    1867±210^**

    2380±394^**

    DXM (1)

    21.8±4.7^**

    1826±219^**

    3029±407^**

    EsA and dexamethasone (DXM) were administered ip once a day for 14 conscutive days and serum cytokines were assayed after the rats were killed at the end of the experiment. IL-1 and IL-6 were expressed as cpm at 1∶32 dilution while TNF as U^.ml^-1. n=10 rats, ±s. ^**P<0.01 vs PHN group.讨论

    EsA是中国商陆根中含量比较高的一种三萜类皂苷，为探讨其可能的抗炎机制，我们曾研究了EsA对免疫功能的影响，结果发现，对体外Con A, LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，Con A诱导的IL-2和CSF释放以及LPS诱导的IL-6生成，EsA都没有抑制作用，提示EsA对细胞免疫没有抑制作用，对于巨噬细胞，EsA不仅可以抑制吞噬作用，还能抑制小鼠腹腔巨噬细胞放TNF，IL-1，IL-6等。体外实验的结果提示EsA可能通过抑制单核巨噬细胞功能而起抗炎作用。体内实验表明对大剂量LPS诱生血清中大量的IL-1，IL-6，TNF生成，EsA提前给药都有显著抑制作用^[7～9]。

    Heymann肾炎(PHN)是一种被动性自身免疫性肾小球肾炎。Fx1A抗原是近曲小管刷状缘的一种大分子量的高密度脂蛋白。PHN发展迅速，重现性好，症状，临床病理学改变与人的膜性肾炎很相似。PHN的发病机制目前认为是肾小球上皮下免疫复合物原位沉积导致膜改变并激活补体，形成补体膜攻击化合物，引发炎症反应。EsA治疗2周，能显著减少尿蛋白含量，但对甘油三脂和胆固醇改变不明显(数据未列)。此外还能改善免疫复合物沉积，并能抑制细胞因子TNF，IL-1或IL-6的产生量，这些因子在PHN中是重要症介质^[10]。EsA体内、体外都能抑制细胞因子的产生, 可能是其抗炎机制之一。

    参考文献

    1 易杨华，王著禄. 商陆有效成分的研究，I. 三萜皂甙的分离与鉴定. 中草药, 1984,15∶55

    2 郑钦岳，麦凯，潘详福. 商陆皂甙甲的抗炎作用. 中国药理学与毒理学杂志, 1992,6∶221

    3 Heymann W, Hackel DB, Harwood J, et al. Production of nephrotic syndrome in rats by Freund′s adjuvants and rat kidney suspensions. Proc Soc Exp Biol Med, 1959,100∶660

    4 Ju DW, Zheng QY, Wang HB, et al. Effect of platelet-activating factor antagonist WEB 2086 on the production of TNF from murine peritoneal macrophages. Acta Pharm Sin, 1993,28∶721

    5 Ju DW, Zheng QY, Wang HB, et al. Effect of triazolodiazepine on mouse lymphocyte and peritoneal macrophages in vitro. Acta Pharmacol Sin, 1994,15∶65

    6 Engelberts I, von Asmuth EJU, van der Linden CJ, et al. The interrelation between TNF, IL-6 and PAF secretion induced by LPS in an in vivo and in vitro murine model. Lymphokine Cytokine Res, 1991,10∶127

    7 Fang J, Zheng QY. Inhibitory effects of esculentoside A on platelet activating factor released from calcimycin induced rat peritoneal macrophages. Acta Pharm Sin, 1991,26∶721

    8 Ju DW, Zheng QY, Wang HB, et al. Inhibitory effects of esculentoside A on mouse macrophages and antibody production. Acta Pharm Sin, 1994,29∶252

    9 Ju DW, Zheng QY, Cao X, et al. Esculentoside A inhibits tumor necrosis factor, interleukin-1 and interleukin-6 production induced by lipopolysaccharide in mice. Pharmacology, 1998,56∶187

    10 Braquet P. PAF/cytokine auto-generated feed back networks in microvascular immune injury: consequences in shock, ischemia and graft rejection. J Lipid Mediat, 1989,1∶75

    基金项目： 国家自然科学基金资助课题(39470184)

    收稿日期: 1997-03-09(鞠佃文 郑钦岳1 曹雪涛 梅小斌 易杨华1)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/25/55/946.htm