钝顶螺旋藻多糖对急性白血病病人NK细胞的作用
作者：曾波航 王光明 曾亚仑
单位：曾波航 王光明(广州医学院第二附属医院，广州 510260)；曾亚仑(广州市白云山中药厂)
关键词：急性白血病，NK细胞，螺旋藻多糖
中国海洋药物000613 摘 要 目的 探讨螺旋藻多糖(SPP)对白血病患者免疫功 能的作用，观察了SPP对正常人及急性白血病患者外周血NK细胞的影响。结 果 SPP可 提高不同病期白血病患者NK细胞活性，但不影响正常人NK细胞活性，毒性试验表明SP P对白血病细胞无毒性作用。结论 SPP作为生物反应调节剂用于 白血病治疗可提高NK细胞活性，值得进一步研究、开发、应用。
STUDY ON EFFECT OF SPIRULINA PLATEN SIS POLYSACCH-
ARIDE ON NK CELLS FROM ACUTE LEUKEMIA PATIENT IN VITRO
, http://www.100md.com
Zeng Bohang，Wang Guangming，Zeng Yalun
(Second Affiliated Hospital Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
ABSTRACT AIM:The Effects of Spi ru lina Platensis Polysaccharide (SPP)on peripheral NK cell from healthy persons an d acute leukemia patients were studied.METHODS:The activities of NK cell on target cell-K562 was measured with MTT metho d.RESULTS:The results showed that SPP could argume nt the NK cell activity from varies peroid cases wit h acute leukemia.SPP had no activity on NK cell from normal person.Cytotoxicity did not present when the peripheral blood mononuclear cell were co-incubated with SPP.CONCLUSION :These results suggested that SPP could be exploited and utilized as an approac h of biological responsive modifier therapy in the treatment of acute leukemia.
, 百拇医药
KEY WORDS Acute leukemia,NK cell,Spirulina Platensis P olysaccharide
螺旋藻有提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数，增加外周血液中T淋巴细 胞的百分数和血清溶血素的含量[1、2]临床上广泛用于提高机体免疫力，治疗肿 瘤等疾病，但其具体作用机制尚不完全明了，螺旋藻对机体起重要免疫监控作用的自然杀伤(NK)细胞作用也未见报道。本文用钝顶螺旋藻(Spirulina platensis )提取物螺旋藻多糖(SPP)观察其对正常人和白血病病人外周血NK细胞 活性 作用，现报告结果如下。
1 材料与方法
1.1 实验对象
31例急性白血病病人为我院经临床和血液学确诊的住院病人，男17例，女14例，年龄 1 5～75岁，中位年龄41岁，按病期可分为初发复发期急性白血病23例，完全缓解期急性白血病8例，所有病人在检查前3周未用免疫抑制剂和免疫增强药物。对照组25例为 我院门诊健康体检者，男15例，女10例，年龄18～72岁，中位年龄42岁。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
1.2.1 效应细胞
取肝素抗凝血常规分离外周血单个核细胞(PBMC)用RPMI1640液(Gi bco 产品内含 15%来活小牛血清，L-谷氨酰胺0.3g.L-1，Hepes 20mM .L-1,2-ME5×10-5M.L-1)洗涤3次后计数PBMC 配成2×109.L-1，实验组加入不同浓度SPP，对照组加1640液 5%CO2，37℃孵育24h收集细胞，用1 640洗涤3次重新悬浮于培养液中，配成2×109.L-1(台盼兰计数活细 胞>95%)为效应细胞。
1.2.2 NK细胞检测
, 百拇医药
用NK细胞敏感的人红白血病细胞株(K562)细胞作为NK细胞的靶细胞，在9 6孔培养板中每孔加入1×108.L-1对数生长期K562细胞0.1 mL，效应细胞0.1mL，效靶比例为20∶1，每组3个复孔，振荡混匀后5%CO2 37℃孵育24h，终止培养前4h，每孔加入MTT(5g.L-1)10μL混 匀 ，4h后离心200r.min-1×10min弃上清，加二甲亚砜每孔150μL，振荡 10min后用酶联检测仪570nm波长测A值，取3个复孔数为样品A值，按下述公式以杀伤率%表示NK细胞活性。
2 结果
2.1 正常人和急性白血病病人NK细胞活性
, http://www.100md.com
25例正常人外周血NK细胞活性为42.95±7.88%。23例初发、复发急性白血病病人外 周血NK细胞活性(20.30±6.72%)明显低于正常人NK细胞活性 (P<0.01)。8例完全缓解期急性白血病病人NK细胞活 性为30.64±8.91%，高于初发复发期(P<0.01 )，说明急性白血病病人在初发期NK细胞活性降低，缓解后升高，复发后又降低，提示检 测急性白血病病人外周血NK细胞活性可了解病情变化。
2.2 SPP对正常人NK细胞活性作用
2.2.1 不同浓度SPP对靶细胞和效应细胞杀伤作用，如图1所示SPP浓度<0. 050μm.L-1时无直接杀伤K562和效应细胞作用，故本实验S PP浓度选10mg.L-1。
, http://www.100md.com
图1 SPP对PBMC和K562细胞细胞毒作用
2.2.2 SPP作用时间与NK细胞活性关系
10mg.L-1 SPP加入NK 效应细胞孵育不同时间对NK细胞活性影响见图2 ，说明效应细胞加SPP作用12h以上始有效果，24h达较高水平，故本实验选孵育时间 为24h。
图2 SPP孵育时间与NK活性关系
2.2.3 SPP对正常人NK细胞活性影响
正常人外周血单个核细胞加入SPP 10mg.L-1后NK细胞活性为46.70 ±10.56 %与正常人NK细胞活性相比较差异无显著性(P>0.05) ，说明该浓度SPP对正常人NK细胞活性无明显影响。
, 百拇医药
2.3 SPP对白血病病人NK细胞活性作用
SPP使31例白血病病人外周血NK细胞活性从26.41±10.17%提高到38. 33±9.45%(P<0.01)，但仍低于正常人NK细胞 活性(P<0.01)，不同病期急性白血病病人外周血单个核 细胞加入SPP后NK细胞活性均有明显提高(P<0.01) 。初发、复发期病人NK细胞活性加SPP后虽有提高但仍低于正常人(P< 0 .01)，而缓解期病人NK细胞活性加SPP后与正常人相比较则差异无显 著性(P>0.05)，见附表。
附表 SPP对白血病病人NK细胞活性
例数
未加SPP
加SPP
P值
, 百拇医药
初发复发期
缓解期
[ WTBX P 值
23
8
20.30±6.72
30.64±8.91
<0. 01
31.73±8.67
40.81±5.35
<0.01
, 百拇医药
<0.001
注：P<0.01，P>0.05 vs 正常人3 讨论
NK细胞是机体最重要抗肿瘤免疫细胞之一，NK细胞活性与肿瘤发生、发展有一定关系， 研究表明，白血病等肿瘤病人NK细胞活性降低，NK 细胞活性与病期有一定关系[ 3、4]。本文证实初发、复发急性白血病病人外周血NK细胞活性明显降低，而处于完 全缓解期NK细胞活性则高于初发、复发病人，提示NK细胞活性与急性白血病病情变化有 关。
生物治疗是继手术、放疗、化疗后又一治疗肿瘤手段，对血液肿瘤生物治疗疗效尤为可佳， 许多中药多糖如猪苓多糖、香菇多糖在体外均能提高免疫细胞活性[5]，用于临床 治疗肿瘤。螺旋藻多糖也有提高机体免疫功能作用[6、7]，已逐步用于肿瘤辅助 治疗。我们发现SPP 在体外(10mg.L-1)时对正常人NK细胞活性无影响 ，但能不同 程度提高初发、复发期急性白血病病人外周血NK 细胞活性(但仍低于正常人)，对处于 缓解期急性白血病病人，SPP能使其NK细胞活性恢复正常。提示SPP提高肿瘤病人N K细胞活性作用与机体带瘤状态有关，当肿瘤负荷小(缓解期)时其作用明显，证实生物治 疗(包括SPP等药)对肿瘤负荷低患者疗效优于肿瘤负荷大的病人(初发、复发时)。
, 百拇医药
我们发现较高浓度(10～50mg.L-1)的SPP对白血病细胞株K562 细胞无直 接杀伤作用，故其提高NK细胞活性作用并非通过杀伤靶细胞来完成，而是增强NK效应细 胞作用，我们还发现10～50mg.L-1SPP对外周血细胞也无细胞毒作用，证 实其安全可 靠。我们的结果提示由于SPP可提高白血病病人NK细胞活性，故SPP可作为急性白血 病特别是处于缓解期病人的辅助治疗。
参考文献
1，刘力生.螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作 用及其机理的研究.海洋科学，1991，9(5)：33～38
2，刘力生.螺旋藻多糖对机体免疫功能的提高及其机理研究.海洋科学，1991，1 1(6)：44～48
3，Ono K.Clinicl significance of natural killing activity in patients with adv anced lymphoma.J Clin Immunol,1998,18(2):132～141
, http://www.100md.com
4，Katrinakis G,KvriakouD.Papadaki H，et al.Defective natural killer cell activ ity in B-cell chronic lymphocyte leukemia is associated with impaired release of natural lciller cytotoxic factors but not of tumour necrosis factor.Acta Heamatol,1996,96(1)：16～23.
5，李金峰.猪苓多糖、香菇多糖和分枝杆菌多糖对淋巴因子活性杀伤细胞活性增强作用 研究.中国中西医结合杂志，1996，16(4)：224.
6，王俏光.钝顶螺旋藻的抗癌作用及对免疫功能的影响.癌症，1996，15(6)： 423～425
7，曾波航.钝顶螺旋藻多糖对白血病患者外周血LAK细胞活性的影响.中国海洋药物 ，2000，19(2)：39～41
(收稿日期2000-05-15), 百拇医药
单位：曾波航 王光明(广州医学院第二附属医院，广州 510260)；曾亚仑(广州市白云山中药厂)
关键词：急性白血病，NK细胞，螺旋藻多糖
中国海洋药物000613 摘 要 目的 探讨螺旋藻多糖(SPP)对白血病患者免疫功 能的作用，观察了SPP对正常人及急性白血病患者外周血NK细胞的影响。结 果 SPP可 提高不同病期白血病患者NK细胞活性，但不影响正常人NK细胞活性，毒性试验表明SP P对白血病细胞无毒性作用。结论 SPP作为生物反应调节剂用于 白血病治疗可提高NK细胞活性，值得进一步研究、开发、应用。
STUDY ON EFFECT OF SPIRULINA PLATEN SIS POLYSACCH-
ARIDE ON NK CELLS FROM ACUTE LEUKEMIA PATIENT IN VITRO
, http://www.100md.com
Zeng Bohang，Wang Guangming，Zeng Yalun
(Second Affiliated Hospital Guangzhou Medical College,Guangzhou 510260)
ABSTRACT AIM:The Effects of Spi ru lina Platensis Polysaccharide (SPP)on peripheral NK cell from healthy persons an d acute leukemia patients were studied.METHODS:The activities of NK cell on target cell-K562 was measured with MTT metho d.RESULTS:The results showed that SPP could argume nt the NK cell activity from varies peroid cases wit h acute leukemia.SPP had no activity on NK cell from normal person.Cytotoxicity did not present when the peripheral blood mononuclear cell were co-incubated with SPP.CONCLUSION :These results suggested that SPP could be exploited and utilized as an approac h of biological responsive modifier therapy in the treatment of acute leukemia.
, 百拇医药
KEY WORDS Acute leukemia,NK cell,Spirulina Platensis P olysaccharide
螺旋藻有提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数，增加外周血液中T淋巴细 胞的百分数和血清溶血素的含量[1、2]临床上广泛用于提高机体免疫力，治疗肿 瘤等疾病，但其具体作用机制尚不完全明了，螺旋藻对机体起重要免疫监控作用的自然杀伤(NK)细胞作用也未见报道。本文用钝顶螺旋藻(Spirulina platensis )提取物螺旋藻多糖(SPP)观察其对正常人和白血病病人外周血NK细胞 活性 作用，现报告结果如下。
1 材料与方法
1.1 实验对象
31例急性白血病病人为我院经临床和血液学确诊的住院病人，男17例，女14例，年龄 1 5～75岁，中位年龄41岁，按病期可分为初发复发期急性白血病23例，完全缓解期急性白血病8例，所有病人在检查前3周未用免疫抑制剂和免疫增强药物。对照组25例为 我院门诊健康体检者，男15例，女10例，年龄18～72岁，中位年龄42岁。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法
1.2.1 效应细胞
取肝素抗凝血常规分离外周血单个核细胞(PBMC)用RPMI1640液(Gi bco 产品内含 15%来活小牛血清，L-谷氨酰胺0.3g.L-1，Hepes 20mM .L-1,2-ME5×10-5M.L-1)洗涤3次后计数PBMC 配成2×109.L-1，实验组加入不同浓度SPP，对照组加1640液 5%CO2，37℃孵育24h收集细胞，用1 640洗涤3次重新悬浮于培养液中，配成2×109.L-1(台盼兰计数活细 胞>95%)为效应细胞。
1.2.2 NK细胞检测
, 百拇医药
用NK细胞敏感的人红白血病细胞株(K562)细胞作为NK细胞的靶细胞，在9 6孔培养板中每孔加入1×108.L-1对数生长期K562细胞0.1 mL，效应细胞0.1mL，效靶比例为20∶1，每组3个复孔，振荡混匀后5%CO2 37℃孵育24h，终止培养前4h，每孔加入MTT(5g.L-1)10μL混 匀 ，4h后离心200r.min-1×10min弃上清，加二甲亚砜每孔150μL，振荡 10min后用酶联检测仪570nm波长测A值，取3个复孔数为样品A值，按下述公式以杀伤率%表示NK细胞活性。
2 结果
2.1 正常人和急性白血病病人NK细胞活性
, http://www.100md.com
25例正常人外周血NK细胞活性为42.95±7.88%。23例初发、复发急性白血病病人外 周血NK细胞活性(20.30±6.72%)明显低于正常人NK细胞活性 (P<0.01)。8例完全缓解期急性白血病病人NK细胞活 性为30.64±8.91%，高于初发复发期(P<0.01 )，说明急性白血病病人在初发期NK细胞活性降低，缓解后升高，复发后又降低，提示检 测急性白血病病人外周血NK细胞活性可了解病情变化。
2.2 SPP对正常人NK细胞活性作用
2.2.1 不同浓度SPP对靶细胞和效应细胞杀伤作用，如图1所示SPP浓度<0. 050μm.L-1时无直接杀伤K562和效应细胞作用，故本实验S PP浓度选10mg.L-1。
, http://www.100md.com
图1 SPP对PBMC和K562细胞细胞毒作用
2.2.2 SPP作用时间与NK细胞活性关系
10mg.L-1 SPP加入NK 效应细胞孵育不同时间对NK细胞活性影响见图2 ，说明效应细胞加SPP作用12h以上始有效果，24h达较高水平，故本实验选孵育时间 为24h。
图2 SPP孵育时间与NK活性关系
2.2.3 SPP对正常人NK细胞活性影响
正常人外周血单个核细胞加入SPP 10mg.L-1后NK细胞活性为46.70 ±10.56 %与正常人NK细胞活性相比较差异无显著性(P>0.05) ，说明该浓度SPP对正常人NK细胞活性无明显影响。
, 百拇医药
2.3 SPP对白血病病人NK细胞活性作用
SPP使31例白血病病人外周血NK细胞活性从26.41±10.17%提高到38. 33±9.45%(P<0.01)，但仍低于正常人NK细胞 活性(P<0.01)，不同病期急性白血病病人外周血单个核 细胞加入SPP后NK细胞活性均有明显提高(P<0.01) 。初发、复发期病人NK细胞活性加SPP后虽有提高但仍低于正常人(P< 0 .01)，而缓解期病人NK细胞活性加SPP后与正常人相比较则差异无显 著性(P>0.05)，见附表。
附表 SPP对白血病病人NK细胞活性
例数
未加SPP
加SPP
P值
, 百拇医药
初发复发期
缓解期
[ WTBX P 值
23
8
20.30±6.72
30.64±8.91
<0. 01
31.73±8.67
40.81±5.35
<0.01
, 百拇医药
<0.001
注：P<0.01，P>0.05 vs 正常人3 讨论
NK细胞是机体最重要抗肿瘤免疫细胞之一，NK细胞活性与肿瘤发生、发展有一定关系， 研究表明，白血病等肿瘤病人NK细胞活性降低，NK 细胞活性与病期有一定关系[ 3、4]。本文证实初发、复发急性白血病病人外周血NK细胞活性明显降低，而处于完 全缓解期NK细胞活性则高于初发、复发病人，提示NK细胞活性与急性白血病病情变化有 关。
生物治疗是继手术、放疗、化疗后又一治疗肿瘤手段，对血液肿瘤生物治疗疗效尤为可佳， 许多中药多糖如猪苓多糖、香菇多糖在体外均能提高免疫细胞活性[5]，用于临床 治疗肿瘤。螺旋藻多糖也有提高机体免疫功能作用[6、7]，已逐步用于肿瘤辅助 治疗。我们发现SPP 在体外(10mg.L-1)时对正常人NK细胞活性无影响 ，但能不同 程度提高初发、复发期急性白血病病人外周血NK 细胞活性(但仍低于正常人)，对处于 缓解期急性白血病病人，SPP能使其NK细胞活性恢复正常。提示SPP提高肿瘤病人N K细胞活性作用与机体带瘤状态有关，当肿瘤负荷小(缓解期)时其作用明显，证实生物治 疗(包括SPP等药)对肿瘤负荷低患者疗效优于肿瘤负荷大的病人(初发、复发时)。
, 百拇医药
我们发现较高浓度(10～50mg.L-1)的SPP对白血病细胞株K562 细胞无直 接杀伤作用，故其提高NK细胞活性作用并非通过杀伤靶细胞来完成，而是增强NK效应细 胞作用，我们还发现10～50mg.L-1SPP对外周血细胞也无细胞毒作用，证 实其安全可 靠。我们的结果提示由于SPP可提高白血病病人NK细胞活性，故SPP可作为急性白血 病特别是处于缓解期病人的辅助治疗。
参考文献
1，刘力生.螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作 用及其机理的研究.海洋科学，1991，9(5)：33～38
2，刘力生.螺旋藻多糖对机体免疫功能的提高及其机理研究.海洋科学，1991，1 1(6)：44～48
3，Ono K.Clinicl significance of natural killing activity in patients with adv anced lymphoma.J Clin Immunol,1998,18(2):132～141
, http://www.100md.com
4，Katrinakis G,KvriakouD.Papadaki H，et al.Defective natural killer cell activ ity in B-cell chronic lymphocyte leukemia is associated with impaired release of natural lciller cytotoxic factors but not of tumour necrosis factor.Acta Heamatol,1996,96(1)：16～23.
5，李金峰.猪苓多糖、香菇多糖和分枝杆菌多糖对淋巴因子活性杀伤细胞活性增强作用 研究.中国中西医结合杂志，1996，16(4)：224.
6，王俏光.钝顶螺旋藻的抗癌作用及对免疫功能的影响.癌症，1996，15(6)： 423～425
7，曾波航.钝顶螺旋藻多糖对白血病患者外周血LAK细胞活性的影响.中国海洋药物 ，2000，19(2)：39～41
(收稿日期2000-05-15), 百拇医药