恶性肿瘤多药耐药基因表达的初步研究
作者：陆东东
单位：226200 江苏省启东肝癌研究所
关键词：肿瘤，恶性；耐药性，多药；基因表达
肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗难以取得预期效果的重要因素之一 肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗难以取得预期效果的重要因素之一。为了在治疗前检测肿瘤的耐药性，选择行之有效的化疗方案，我们对未接触化疗的常见恶性肿瘤中原发性多药耐药基因(mdr-1)的表达规律进行了研究。
1 材料与方法
1.1 临床资料 来自本所外科手术切除的标本共302例，男156例，女146例，年龄21～80岁，平均52.1岁。均经病理组织学证实为恶性肿瘤，其中肝细胞癌92例，贲门腺癌70例，胃腺癌、大肠腺癌各32例，乳腺癌30例，甲状腺癌20例，支气管肺癌18例，宫颈癌8例。
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1.2 方法
1.2.1 主要试剂与仪器 细胞裂解液、Taq酶、RNA逆转录酶(CRT)。mdr-1基因引物序列：5′-ACCCATCA-TTGCAATAGCAG-3′，5′-TGTTCAAACTTCTGCT-CCTG-3′(购自北京京海生物工程公司)；内标β2微球蛋白引物序列：5′-ATGGCTCGCTCGGTGA-CCCTAC-3′，5′-TCATGATGCTTGATCACATGTCTCG-3′。Bio-RADCyclerTM(日本产基因扩增仪)、LG15-W离心机(北京医用离心机厂)，SA-U94-Ⅱ紫外透射仪(上海中亚生物研究所)。
1.2.2 步骤 按参考文献[1]，并加以修改。①总RNA提取：切取2～3mg新鲜癌组织，匀浆后置样品管，加入100μl裂解液，充分振荡，使沉淀完全溶解；加20μl氯仿充分混匀，12000r/min离心5分钟，弃去上清液，室温晾干约20分钟，即可得到标本的总RNA。②RNA→cDNA反转录：经处理的样品中加入5μl水，然后加入10μlRT液、1μlAMV酶、2滴石蜡油，离心数秒，42℃水浴30分钟。③PCR扩增：取0.5ml离心管，加入20μlPCRmix、5μl反转录产物、1μlTaq酶，混匀，加20μl石蜡油覆盖，离心；上PCR仪扩增，循环参数94℃50秒，61℃50秒，共35个循环。④电泳鉴定：在含EB的Agarose(浓度2.0%)上取10μlPCR产物，加2μl上样，缓冲液混匀后点样；恒压5v/cm，电泳时间为溴酚蓝染料走至1/2～1/3胶长处。⑤结果记录及判断：阳性结果为两条带，分别为300和170,300bp为内标，170bp为mdr-1基因。拍照后将底片置密度扫描仪下分析，以两条带的积分光密度比值反映mdr-1基因的相对表达，mdr-1/内标<0.1为阴性，>0.4为高表达，0.1～0.4为中度表达。
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2 结果
302例患者受检结果见表1。
表1 302例受检癌组织中mdr-1基因的表达 % 病种
例数
高度表达
H
中度表达
M
低度表达/阴性
L(N)
H+M
肝癌
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92
10.9
26.1
63.0
37.0
贲门癌
70
17.1
11.9
71.0
29.0
胃癌
32
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25.0
12.5
72.5
27.5
大肠癌
32
18.8
12.5
68.7
31.3
肺癌
18
22.2
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33.3
45.0
55.5
乳腺癌
30
6.6
6.6
86.8
13.2
甲状腺癌
20
20.0
20.0
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60.0
40.0
宫颈癌
8
0
0
100.0
0
合计
302
15.2
18.6
66.2
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33.8
3 讨论
①目前认为，mdr-1基因是存在于人基因组中的正常片段，但其是否表达，或表达的高低，则随组织细胞、环境诱导因素不同而有所不同。对其表达的反映与检测常在蛋白与mRNA两个水平。我们采用mRNA检测中的RT-PCR法，在逆转录酶作用下，利用已转录的mdr-1之mRNA为模板，合成mdr-1的cDNA后，以PCR体外扩增法为检测手段，与检测基因表达的其他方法相比较，具有省时、省事、高效、敏感、特异的优点，在临床上有广阔的应用前景。②近年对MDR细胞产生的机制、识别方法和逆转等方面的研究已有报道，研究较多且结果比较肯定的是mdr-1基因及其产物Pgp(P-170，又称P糖蛋白)系统。多数学者认为，Pgp系一种ATP依赖的泵分子，能够将药物由细胞中排出，从而使化疗失败，这已在白血病、乳腺癌、黑色素瘤等许多研究中得以证实。然而，以往的研究多只是对某种脑瘤的研究。本文对临床常见的几种恶性肿瘤作了mdr-1基因表达规律的同步研究。结果发现，受检的几种恶性肿瘤中，除宫颈癌mdr-1基因表达均为阴性外，其余肿瘤都有不同程度的表达。mdr-1基因在乳腺癌中的表达(13.2%)较低，而其他肿瘤组织中的mdr-1基因表达阳性数均在1/3以上，这些肿瘤受检时均未行化疗。因而，此时mdr-1基因的表达应视作是先天性的表达，说明mdr-1基因Pgp在相当部分的实体恶性肿瘤中贯穿始终，应引起高度重视。因此，治疗恶性肿瘤除应考虑临床相关指标如病变组织类型、组织分化程度、TNM分期外，还应从基因分子水平区别肿瘤亚群，个别对待，不应盲目化疗。 参考文献
1 ChanHSL.Diagnotis and Reversal of MDR in Pecliatric Cancer.Eur J Cancer,1996,32A∶1051
(1998-10-18收稿 1998-10-30修回), http://www.100md.com
单位：226200 江苏省启东肝癌研究所
关键词：肿瘤，恶性；耐药性，多药；基因表达
肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗难以取得预期效果的重要因素之一 肿瘤细胞产生耐药性是肿瘤化疗难以取得预期效果的重要因素之一。为了在治疗前检测肿瘤的耐药性，选择行之有效的化疗方案，我们对未接触化疗的常见恶性肿瘤中原发性多药耐药基因(mdr-1)的表达规律进行了研究。
1 材料与方法
1.1 临床资料 来自本所外科手术切除的标本共302例，男156例，女146例，年龄21～80岁，平均52.1岁。均经病理组织学证实为恶性肿瘤，其中肝细胞癌92例，贲门腺癌70例，胃腺癌、大肠腺癌各32例，乳腺癌30例，甲状腺癌20例，支气管肺癌18例，宫颈癌8例。
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1.2 方法
1.2.1 主要试剂与仪器 细胞裂解液、Taq酶、RNA逆转录酶(CRT)。mdr-1基因引物序列：5′-ACCCATCA-TTGCAATAGCAG-3′，5′-TGTTCAAACTTCTGCT-CCTG-3′(购自北京京海生物工程公司)；内标β2微球蛋白引物序列：5′-ATGGCTCGCTCGGTGA-CCCTAC-3′，5′-TCATGATGCTTGATCACATGTCTCG-3′。Bio-RADCyclerTM(日本产基因扩增仪)、LG15-W离心机(北京医用离心机厂)，SA-U94-Ⅱ紫外透射仪(上海中亚生物研究所)。
1.2.2 步骤 按参考文献[1]，并加以修改。①总RNA提取：切取2～3mg新鲜癌组织，匀浆后置样品管，加入100μl裂解液，充分振荡，使沉淀完全溶解；加20μl氯仿充分混匀，12000r/min离心5分钟，弃去上清液，室温晾干约20分钟，即可得到标本的总RNA。②RNA→cDNA反转录：经处理的样品中加入5μl水，然后加入10μlRT液、1μlAMV酶、2滴石蜡油，离心数秒，42℃水浴30分钟。③PCR扩增：取0.5ml离心管，加入20μlPCRmix、5μl反转录产物、1μlTaq酶，混匀，加20μl石蜡油覆盖，离心；上PCR仪扩增，循环参数94℃50秒，61℃50秒，共35个循环。④电泳鉴定：在含EB的Agarose(浓度2.0%)上取10μlPCR产物，加2μl上样，缓冲液混匀后点样；恒压5v/cm，电泳时间为溴酚蓝染料走至1/2～1/3胶长处。⑤结果记录及判断：阳性结果为两条带，分别为300和170,300bp为内标，170bp为mdr-1基因。拍照后将底片置密度扫描仪下分析，以两条带的积分光密度比值反映mdr-1基因的相对表达，mdr-1/内标<0.1为阴性，>0.4为高表达，0.1～0.4为中度表达。
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2 结果
302例患者受检结果见表1。
表1 302例受检癌组织中mdr-1基因的表达 % 病种
例数
高度表达
H
中度表达
M
低度表达/阴性
L(N)
H+M
肝癌
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92
10.9
26.1
63.0
37.0
贲门癌
70
17.1
11.9
71.0
29.0
胃癌
32
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25.0
12.5
72.5
27.5
大肠癌
32
18.8
12.5
68.7
31.3
肺癌
18
22.2
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33.3
45.0
55.5
乳腺癌
30
6.6
6.6
86.8
13.2
甲状腺癌
20
20.0
20.0
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60.0
40.0
宫颈癌
8
0
0
100.0
0
合计
302
15.2
18.6
66.2
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33.8
3 讨论
①目前认为，mdr-1基因是存在于人基因组中的正常片段，但其是否表达，或表达的高低，则随组织细胞、环境诱导因素不同而有所不同。对其表达的反映与检测常在蛋白与mRNA两个水平。我们采用mRNA检测中的RT-PCR法，在逆转录酶作用下，利用已转录的mdr-1之mRNA为模板，合成mdr-1的cDNA后，以PCR体外扩增法为检测手段，与检测基因表达的其他方法相比较，具有省时、省事、高效、敏感、特异的优点，在临床上有广阔的应用前景。②近年对MDR细胞产生的机制、识别方法和逆转等方面的研究已有报道，研究较多且结果比较肯定的是mdr-1基因及其产物Pgp(P-170，又称P糖蛋白)系统。多数学者认为，Pgp系一种ATP依赖的泵分子，能够将药物由细胞中排出，从而使化疗失败，这已在白血病、乳腺癌、黑色素瘤等许多研究中得以证实。然而，以往的研究多只是对某种脑瘤的研究。本文对临床常见的几种恶性肿瘤作了mdr-1基因表达规律的同步研究。结果发现，受检的几种恶性肿瘤中，除宫颈癌mdr-1基因表达均为阴性外，其余肿瘤都有不同程度的表达。mdr-1基因在乳腺癌中的表达(13.2%)较低，而其他肿瘤组织中的mdr-1基因表达阳性数均在1/3以上，这些肿瘤受检时均未行化疗。因而，此时mdr-1基因的表达应视作是先天性的表达，说明mdr-1基因Pgp在相当部分的实体恶性肿瘤中贯穿始终，应引起高度重视。因此，治疗恶性肿瘤除应考虑临床相关指标如病变组织类型、组织分化程度、TNM分期外，还应从基因分子水平区别肿瘤亚群，个别对待，不应盲目化疗。 参考文献
1 ChanHSL.Diagnotis and Reversal of MDR in Pecliatric Cancer.Eur J Cancer,1996,32A∶1051
(1998-10-18收稿 1998-10-30修回), http://www.100md.com