巴曲抗栓酶对沙土鼠脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量的影响
作者：陈群 曾因明 王士雷 许鹏程 范建伟
单位：徐州医学院 附属医院 麻醉科、江苏省麻醉学重点实验室，江苏 徐州 221002
关键词：巴曲抗栓酶；脑缺血；多巴胺；沙鼠亚科；再灌注
中国新药与临床杂志000304 [摘要] 目的：研究巴曲抗栓酶[batroxobin(DF-521)]对沙土鼠脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺(dopamine,DA)和海马ATP含量变化的影响。方法：阻断沙土鼠双侧颈总动脉制备前脑缺血再灌注模型，沙土鼠40只分成5组，假手术组、脑缺血组、对照组、巴曲抗栓酶Ⅰ组(8 BU.kg-1)和巴曲抗栓酶Ⅱ组(16 BU.kg-1)，每组8只。沙土鼠于脑缺血10 min或再灌注60 min时处死，分别测定各组海马ATP，ADP，AMP含量和纹状体多巴胺的含量。结果：脑缺血组海马ATP含量和纹状体DA含量均明显低于假手术组。对照组(0.9%氯化钠注射液)再灌注60 min时纹状体DA与海马ATP含量明显高于脑缺血组，但明显低于巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组。结论：巴曲抗栓酶可促进脑缺血再灌注期间海马ATP含量的恢复和减少纹状体多巴胺的释放。
, 百拇医药
[中图分类号]R973.2；R963
[文献标识码]A
[文章编号]1007-7669(2000)03-0169-04
Effect of batroxobin(DF-521) on content of dopamine in
striatum during cerebral ischemia/reperfusion in gerbils
CHEN Qun，ZENG Yin-Ming，WANG Shi-Lei，XU Peng-Cheng，FAN Jian-Wei
(Department of anesthesiology, affiliated hospital of Xuzhou Medical College, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou JIANGSU 221002, China)
, 百拇医药
[ABSTRACT] AIM: To study the effect of batroxobin(DF-521) on content of dopamine(DA) in striatum and content of ATP,ADP,AMP in hippocampus during cerebral ischemia/reperfusion in gerbils. METHODS: The model of forebrain ischemia/reperfusion was prepared by occluding the bilateral common carotid arteries of gerbils. Forty gerbils were divided into five groups, i.e. sham-operated group, control group, cerebral ischemic group, batroxobin Ⅰ group (8 BU.kg-1), batroxobin Ⅱ group(16BU.kg-1), and each group had 8 animals. Gerbils were killed at the end of cerebral ischemia 10 min or reperfusion 60 min respectively. The content of DA in striatum and content of ATP, ADP, AMP in hippocampus were determined individually. RESULTS: The content of ATP in hippocampus and content of DA in striatum in cerebral ischemic group were much lower than that in sham-operated group. The content of ATP in hippocampus and content of DA in striatum in control group(0.9% sodium chloride injection) at the end of 60 min reperfusion were much higher than that in cerebral ischemic group, but significantly lower than that in batroxobin Ⅰ， Ⅱ group. CONCLUSION: Batroxobin (DF-521) can quicken the recovery of ATP content in hippocampus and the DA releasing in striatum during cerebral ischemia/reperfusion in gerbils.
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[KEY WORDS] batroxobin(DF-521); cerebral ischemia; dopamine; gerbillinae; reperfusion
短暂脑缺血即可造成纹状体多巴胺(dopamine,DA)大量释放和纹状体的缺血性损伤，而如果在脑缺血前耗竭纹状体内的多巴胺则可减轻脑缺血再灌注损伤，这提示脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化与脑缺血再灌注损伤的严重程度密切相关[1，2]。巴曲抗栓酶[batroxobin(DF-512)]为新型溶栓药，已有报道其能减轻脑缺血后脑水肿的程度，减少氧自由基的产生等[3]，临床已广泛用于治疗缺血性脑血管疾病[4]，但巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化的影响，作者目前还未见有文献报道。因为在正常情况下纹状体多巴胺的重吸收需消耗ATP，而脑缺血常导致脑细胞能量代谢的紊乱从而有可能影响纹状体DA的含量，因此本实验同时研究巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺和海马ATP含量变化的影响，以探讨两者之间的关系。
, 百拇医药
材料和方法
药品 巴曲抗栓酶，日本东菱药品工业株式会社产品，进口许可证号X930498。DA，ATP，ADP，AMP的标准品由Sigma公司购买，其余试剂均为国产分析纯。
动物模型和分组 沙土鼠40只，体重50～60 g，由本院实验动物中心提供，合格动物证号苏动(质)95021。随机将动物分为5组，假手术组、脑缺血组、对照组(0.9%氯化钠注射液)、巴曲抗栓酶Ⅰ(8BU.kg-1)组和巴曲抗栓酶Ⅱ(16 BU.kg-1)组，每组8只。沙土鼠用3%戊巴比妥钠溶液(40 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，仔细分离沙土鼠双侧颈总动脉，应用无创动脉夹阻断颈总动脉血流造成脑缺血10 min，然后松开动脉夹恢复脑血流再灌注60 min。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不予阻断。监测EEG判断沙土鼠是否造成脑缺血，监测电极位于前囟后，中线旁2 mm，参考电极置于中线。为避免脑温变化对实验结果的影响，所有沙土鼠均置于流动空气浴箱中，监测鼓膜温度反映脑温并控制动物脑温于37 ℃±s0.2 ℃。巴曲抗栓酶于再灌注开始的同时由腹腔给予，假手术组和对照组给予等量0.9%氯化钠注射液作对照。动物在脑缺血10 min或再灌注60 min断头，在0.9%氯化钠注射液冰面上分取海马和纹状体，液氮冷冻，-75 ℃冰箱保存，分批测定海马ATP，ADP，AMP含量和纹状体DA的含量。
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ATP，ADP，AMP含量的测定 海马组织称重，加0.4 mmol.L-1的冷高氯酸溶液成10%匀浆，9000×g冷冻离心15 min。取上清液0.4 mL加入3 mol.L-1的碳酸钾溶液0.04 mL调pH至中性，4 ℃下4000×g离心5 min，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：色谱柱ODS-C18。流动相为0.1 mol.L-1磷酸盐缓冲液，流速1 mL.min-1。紫外检测波长254 nm。
DA含量的测定 纹状体称重后以1∶10(W/V)加入0.1 mol.L-1的高氯酸，在冰浴下用超声波细胞粉碎器制成匀浆，15000×g冷冻离心，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：采用外标法测定纹状体DA含量。色谱柱ODS-C18，前面加预柱。电化学检测器(日本L-ECD-6A)，电压+0.75 mv。流动相为0.1 mol.L-1柠檬酸，0.1 mol.L-1乙酸钠，每升含EDTA 5 mg，辛烷磺酸钠230 mg(pH 3.5)，流速1 mL.min-1[5]。
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结果
EEG的变化 所有沙土鼠的EEG均在阻断双侧颈总动脉1 min内成等电位，再灌注后逐渐恢复。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时EEG各脑电波比率(α，β，δ，θ)与缺血前相比已无显著差别，但对照组再灌注60 min时EEG的慢波(δ)比率仍明显高于缺血前。
沙土鼠海马ATP，ADP，AMP含量的测定 脑缺血组缺血10 min，海马ATP含量与假手术组比明显减少，差别有非常显著意义(P<0.01)。对照组再灌注60 min时ATP含量上升为假手术组的64%，差别有非常显著意义(P<0.01)。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时ATP含量分别为假手术组的82%和89%，均高于对照组，差别有显著或非常显著意义(P<0.05或P<0.01)，但巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组之间差别无显著意义(P>0.05)见表1。
表1 各组沙土鼠海马ATP，ADP，AMP含量的
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测定(
±s,n=8)(mmol.L-1) 组别
ATP
ADP
AMP
ATP+ADP+AMP
假手术
0.94±0.19
0.7±0.3
1.1±0.3
2.8±0.8
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脑缺血
0.19±0.11c
0.43±0.08
1.08±0.17
1.7±0.4
对照
0.60±0.09f
0.39±0.07
0.85±0.16
1.8±0.3
巴曲抗栓酶Ⅰ
0.77±0.10h
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0.48±0.15
1.06±0.26
2.3±0.5
巴曲抗栓酶Ⅱ
0.84±0.17ij
0.60±0.12
1.13±0.23
2.6±0.5
脑缺血组与假手术组比较t检验：cP<0.01；对照组与脑缺血组比较t检验：fP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与对照组比较t检验：hP<0.05；巴曲抗栓酶Ⅱ组与对照组比较t检验：iP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与巴曲抗栓酶Ⅱ组比较t检验：jP>0.05。 沙土鼠纹状体DA含量的测定 脑缺血组缺血10 min，沙土鼠纹状体DA的含量降低为假手术组的30%，两者差别有非常显著意义(P<0.01)。对照组再灌注60 min时DA仅为假手术组的52%，而巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时DA却为假手术组的77%和80%，差别有非常显著意义或显著意义(P<0.01或P<0.05)，但2个剂量组之间差别无显著意义(P>0.05)见表2。
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表2 各组沙土鼠纹状体DA含量的测定(±s,n=8) 组别
DA/μg.kg-1
假手术
6638±719
脑缺血
1961±414c
对 照
3460±947f
巴曲抗栓酶Ⅰ
5088±1062h
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巴曲抗栓酶Ⅱ
5291±1140ij
脑缺血组与假手术组比较t检验：cP<0.01；对照组与脑缺血组比较t检验：fP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与对照组比较t检验：hP<0.05；巴曲抗栓酶Ⅱ组与对照组比较t检验：iP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与巴曲抗栓酶Ⅱ组比较t检验：jP>0.05。 短暂脑缺血即可造成纹状体多巴胺(dopamine,DA)大量释放和纹状体的缺血性损伤，而如果在脑缺血前耗竭纹状体内的多巴胺则可减轻脑缺血再灌注损伤，这提示脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化与脑缺血再灌注损伤的严重程度密切相关[1，2]。巴曲抗栓酶[batroxobin(DF-512)]为新型溶栓药，已有报道其能减轻脑缺血后脑水肿的程度，减少氧自由基的产生等[3]，临床已广泛用于治疗缺血性脑血管疾病[4]，但巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化的影响，作者目前还未见有文献报道。因为在正常情况下纹状体多巴胺的重吸收需消耗ATP，而脑缺血常导致脑细胞能量代谢的紊乱从而有可能影响纹状体DA的含量，因此本实验同时研究巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺和海马ATP含量变化的影响，以探讨两者之间的关系。
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材料和方法
药品 巴曲抗栓酶，日本东菱药品工业株式会社产品，进口许可证号X930498。DA，ATP，ADP，AMP的标准品由Sigma公司购买，其余试剂均为国产分析纯。
动物模型和分组 沙土鼠40只，体重50～60 g，由本院实验动物中心提供，合格动物证号苏动(质)95021。随机将动物分为5组，假手术组、脑缺血组、对照组(0.9%氯化钠注射液)、巴曲抗栓酶Ⅰ(8BU*kg-1)组和巴曲抗栓酶Ⅱ(16 BU*kg-1)组，每组8只。沙土鼠用3%戊巴比妥钠溶液(40 mg*kg-1)腹腔注射麻醉，仔细分离沙土鼠双侧颈总动脉，应用无创动脉夹阻断颈总动脉血流造成脑缺血10 min，然后松开动脉夹恢复脑血流再灌注60 min。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不予阻断。监测EEG判断沙土鼠是否造成脑缺血，监测电极位于前囟后，中线旁2 mm，参考电极置于中线。为避免脑温变化对实验结果的影响，所有沙土鼠均置于流动空气浴箱中，监测鼓膜温度反映脑温并控制动物脑温于37 ℃±s0.2 ℃。巴曲抗栓酶于再灌注开始的同时由腹腔给予，假手术组和对照组给予等量0.9%氯化钠注射液作对照。动物在脑缺血10 min或再灌注60 min断头，在0.9%氯化钠注射液冰面上分取海马和纹状体，液氮冷冻，-75 ℃冰箱保存，分批测定海马ATP，ADP，AMP含量和纹状体DA的含量。
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ATP，ADP，AMP含量的测定 海马组织称重，加0.4 mmol*L-1的冷高氯酸溶液成10%匀浆，9000×g冷冻离心15 min。取上清液0.4 mL加入3 mol*L-1的碳酸钾溶液0.04 mL调pH至中性，4 ℃下4000×g离心5 min，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：色谱柱ODS-C18。流动相为0.1 mol*L-1磷酸盐缓冲液，流速1 mL*min-1。紫外检测波长254 nm。
DA含量的测定 纹状体称重后以1∶10(W/V)加入0.1 mol*L-1的高氯酸，在冰浴下用超声波细胞粉碎器制成匀浆，15000×g冷冻离心，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：采用外标法测定纹状体DA含量。色谱柱ODS-C18，前面加预柱。电化学检测器(日本L-ECD-6A)，电压+0.75 mv。流动相为0.1 mol*L-1柠檬酸，0.1 mol*L-1乙酸钠，每升含EDTA 5 mg，辛烷磺酸钠230 mg(pH 3.5)，流速1 mL*min-1[5]。
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结果
EEG的变化 所有沙土鼠的EEG均在阻断双侧颈总动脉1 min内成等电位，再灌注后逐渐恢复。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时EEG各脑电波比率(α，β，δ，θ)与缺血前相比已无显著差别，但对照组再灌注60 min时EEG的慢波(δ)比率仍明显高于缺血前。
沙土鼠海马ATP，ADP，AMP含量的测定 脑缺血组缺血10 min，海马ATP含量与假手术组比明显减少，差别有非常显著意义(P<0.01)。对照组再灌注60 min时ATP含量上升为假手术组的64%，差别有非常显著意义(P<0.01)。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时ATP含量分别为假手术组的82%和89%，均高于对照组，差别有显著或非常显著意义(P<0.05或P<0.01)，但巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组之间差别无显著意义(P>0.05)见表1。
沙土鼠的Willis动脉环发育不全，阻断双侧颈总动脉可造成前脑缺血，但也有少数沙土鼠存在解剖变异，仅阻断双侧颈总动脉难以造成前脑缺血。沙土鼠的脑电活动与脑血流量密切相关，EEG成等电位常为严重前脑缺血的标志，因此本实验监测沙土鼠的EEG判断脑缺血的完全程度[6]。对双侧颈总动脉阻断后1 min内EEG未成等电位的动物从实验中剔除，以保证本实验动物脑缺血模型的可靠性。
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Ahn[2]等报道，沙土鼠脑缺血5 min导致纹状体内的多巴胺释放大量增加。脑细胞外液增多的多巴胺通过儿茶酚胺的氧化脱氨基作用生成大量的.O2-和H2O2。H2O2和Fe2+反应生物活性非常活泼的OH.，导致细胞膜磷脂、蛋白质和核酸的氧化性损害，最终导致细胞功能障碍和死亡[7]。本实验发现8 BU.kg-1的巴曲抗栓酶可明显减少脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺的释放，并且我们以前的实验已发现巴曲抗栓酶也能明显减少脑缺血再灌注期间OH.的产生[8]，这些结果提示巴曲抗栓酶可能通过减少脑缺血再灌注期间纹状体内多巴胺的释放，从而减少氧自由基产生而减轻脑缺血再灌注损伤。脑细胞外液中多巴胺的水平高低与脑缺血性损伤的严重程度密切相关，本实验通过测定纹状体内多巴胺的含量以推测脑细胞外液中多巴胺水平是一间接方法，若能应用脑内微透析技术直接测定脑细胞外液中多巴胺的水平，则更能反映巴曲抗栓酶影响脑缺血再灌注期间脑细胞外液中多巴胺水平变化的程度。
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细胞能量代谢的恢复是细胞其他生理生化功能恢复的基础，促进脑缺血后脑细胞能量代谢恢复的措施有可能减轻脑缺血再灌注损伤[9]。但短暂前脑缺血后脑细胞的死亡有一过程，海马CA1区的锥体细胞对脑缺血最为敏感，一般在脑缺血后2～4 d才开始，7 d左右才逐渐完善，故称之为延迟性神经元死亡(delayed neuronal death,DND)。本实验发现对照组脑缺血再灌注60 min ATP已恢复至缺血前的64%，但我们病理检查发现7 d后对照动物海马CA1区锥体细胞大部死亡[8]。巴曲抗栓酶组再灌注ATP恢复程度高于对照组，但其海马CA1区死亡的锥体细胞也接近50%，这些结果表明早期脑细胞ATP含量的恢复并不能用于判断脑缺血损伤的严重程度，这与Sutton[9]等的观点一致。这也提示巴曲抗栓酶并不是主要通过改善脑缺血后脑细胞的能量代谢而减轻脑缺血再灌注损伤。
在正常情况下，纹状体释放的多巴胺主要由囊泡膜主动重吸收，这一过程要消耗ATP。本实验发现沙土鼠脑缺血10 min后ATP含量明显降低，同时纹状体内多巴胺的含量也明显减少，提示脑缺血期间纹状体多巴胺含量减少可能主要由于ATP耗竭致多巴胺重吸收减少所致，这与Ahn[2]等的观点一致。但本实验也发现，在再灌注期间对照组和巴曲抗栓酶组ATP恢复的程度均高于纹状体内多巴胺含量恢复的程度，这一结果提示在再灌注期间除ATP含量外还存在其他影响纹状体多巴胺含量的因素。Ahn[2]等认为，脑缺血后兴奋性氨基酸释放导致细胞内Ca2+超载，从而引起一系列的脂质过氧化反应，导致贮存多巴胺的囊泡膜损害，使多巴胺释放增加是再灌注期间纹状体多巴胺含量减少的主要原因。基于此，我们推测巴曲抗栓酶可能通过抑制沙土鼠脑缺血再灌注期间Ca2+超载而减少再灌注期间纹状体内多巴胺的释放。
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[基金项目]江苏省卫生厅资助课题(Z9717)
[参考文献]
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[2] Ahn SS, Blaha CD, Alkire MT, et al. Biphasic striatal dopamine release during transient ischemia and reperfusion in gerbils[J]. Stroke, 1991,22:674-679.
, http://www.100md.com
[3] 匡培根(Kuang PG),陶 沂(Tao Y)，田亚平(Tian YP).脑再灌注损伤及东菱克栓酶的保护作用[J].中国新药杂志(Chin New Drugs J), 1995,4:47-49.
[4] 吴萍嘉(Wu PJ),赵 瑛(Zhao Y),余慧贞(Yu HZ),翁中芳(Weng ZF),姚景莉(Yao JL),王晋杨(Wang JY).巴曲酶治疗缺血性脑血管疾病[J].新药与临床(New Drugs Clin Rem),1996,15:26-28.
[5] Takagi N, Tsuru H, Yamamura M, Takeo S. Changes in striatal dopamine metabolism after microsphere embolism in rats[J]. Stroke,1995,26:1101-1106.
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[8] 陈 群(Chen Q),曾因明(Zeng YM)，王士雷(Wang SL),许鹏程(Xu PC),范建伟(Fan JW).巴曲酶对脑缺血后沙土鼠海马锥体细胞延迟性坏死的影响[J].中国药理学通报(Chin Pharmacol Bull),1998,14:522-524.
[9] Sutton LN, Clark BJ, Norwood CR, Woodford EJ, Welsh FA. Global cerebral ischemia in piglets under conditions of mild and deep hypothermia[J]. Stroke, 1991,22:1567-1573.
[收稿日期]1998-11-23 [接受日期]1999-05-10, 百拇医药
单位：徐州医学院 附属医院 麻醉科、江苏省麻醉学重点实验室，江苏 徐州 221002
关键词：巴曲抗栓酶；脑缺血；多巴胺；沙鼠亚科；再灌注
中国新药与临床杂志000304 [摘要] 目的：研究巴曲抗栓酶[batroxobin(DF-521)]对沙土鼠脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺(dopamine,DA)和海马ATP含量变化的影响。方法：阻断沙土鼠双侧颈总动脉制备前脑缺血再灌注模型，沙土鼠40只分成5组，假手术组、脑缺血组、对照组、巴曲抗栓酶Ⅰ组(8 BU.kg-1)和巴曲抗栓酶Ⅱ组(16 BU.kg-1)，每组8只。沙土鼠于脑缺血10 min或再灌注60 min时处死，分别测定各组海马ATP，ADP，AMP含量和纹状体多巴胺的含量。结果：脑缺血组海马ATP含量和纹状体DA含量均明显低于假手术组。对照组(0.9%氯化钠注射液)再灌注60 min时纹状体DA与海马ATP含量明显高于脑缺血组，但明显低于巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组。结论：巴曲抗栓酶可促进脑缺血再灌注期间海马ATP含量的恢复和减少纹状体多巴胺的释放。
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[中图分类号]R973.2；R963
[文献标识码]A
[文章编号]1007-7669(2000)03-0169-04
Effect of batroxobin(DF-521) on content of dopamine in
striatum during cerebral ischemia/reperfusion in gerbils
CHEN Qun，ZENG Yin-Ming，WANG Shi-Lei，XU Peng-Cheng，FAN Jian-Wei
(Department of anesthesiology, affiliated hospital of Xuzhou Medical College, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou JIANGSU 221002, China)
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[ABSTRACT] AIM: To study the effect of batroxobin(DF-521) on content of dopamine(DA) in striatum and content of ATP,ADP,AMP in hippocampus during cerebral ischemia/reperfusion in gerbils. METHODS: The model of forebrain ischemia/reperfusion was prepared by occluding the bilateral common carotid arteries of gerbils. Forty gerbils were divided into five groups, i.e. sham-operated group, control group, cerebral ischemic group, batroxobin Ⅰ group (8 BU.kg-1), batroxobin Ⅱ group(16BU.kg-1), and each group had 8 animals. Gerbils were killed at the end of cerebral ischemia 10 min or reperfusion 60 min respectively. The content of DA in striatum and content of ATP, ADP, AMP in hippocampus were determined individually. RESULTS: The content of ATP in hippocampus and content of DA in striatum in cerebral ischemic group were much lower than that in sham-operated group. The content of ATP in hippocampus and content of DA in striatum in control group(0.9% sodium chloride injection) at the end of 60 min reperfusion were much higher than that in cerebral ischemic group, but significantly lower than that in batroxobin Ⅰ， Ⅱ group. CONCLUSION: Batroxobin (DF-521) can quicken the recovery of ATP content in hippocampus and the DA releasing in striatum during cerebral ischemia/reperfusion in gerbils.
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[KEY WORDS] batroxobin(DF-521); cerebral ischemia; dopamine; gerbillinae; reperfusion
短暂脑缺血即可造成纹状体多巴胺(dopamine,DA)大量释放和纹状体的缺血性损伤，而如果在脑缺血前耗竭纹状体内的多巴胺则可减轻脑缺血再灌注损伤，这提示脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化与脑缺血再灌注损伤的严重程度密切相关[1，2]。巴曲抗栓酶[batroxobin(DF-512)]为新型溶栓药，已有报道其能减轻脑缺血后脑水肿的程度，减少氧自由基的产生等[3]，临床已广泛用于治疗缺血性脑血管疾病[4]，但巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化的影响，作者目前还未见有文献报道。因为在正常情况下纹状体多巴胺的重吸收需消耗ATP，而脑缺血常导致脑细胞能量代谢的紊乱从而有可能影响纹状体DA的含量，因此本实验同时研究巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺和海马ATP含量变化的影响，以探讨两者之间的关系。
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材料和方法
药品 巴曲抗栓酶，日本东菱药品工业株式会社产品，进口许可证号X930498。DA，ATP，ADP，AMP的标准品由Sigma公司购买，其余试剂均为国产分析纯。
动物模型和分组 沙土鼠40只，体重50～60 g，由本院实验动物中心提供，合格动物证号苏动(质)95021。随机将动物分为5组，假手术组、脑缺血组、对照组(0.9%氯化钠注射液)、巴曲抗栓酶Ⅰ(8BU.kg-1)组和巴曲抗栓酶Ⅱ(16 BU.kg-1)组，每组8只。沙土鼠用3%戊巴比妥钠溶液(40 mg.kg-1)腹腔注射麻醉，仔细分离沙土鼠双侧颈总动脉，应用无创动脉夹阻断颈总动脉血流造成脑缺血10 min，然后松开动脉夹恢复脑血流再灌注60 min。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不予阻断。监测EEG判断沙土鼠是否造成脑缺血，监测电极位于前囟后，中线旁2 mm，参考电极置于中线。为避免脑温变化对实验结果的影响，所有沙土鼠均置于流动空气浴箱中，监测鼓膜温度反映脑温并控制动物脑温于37 ℃±s0.2 ℃。巴曲抗栓酶于再灌注开始的同时由腹腔给予，假手术组和对照组给予等量0.9%氯化钠注射液作对照。动物在脑缺血10 min或再灌注60 min断头，在0.9%氯化钠注射液冰面上分取海马和纹状体，液氮冷冻，-75 ℃冰箱保存，分批测定海马ATP，ADP，AMP含量和纹状体DA的含量。
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ATP，ADP，AMP含量的测定 海马组织称重，加0.4 mmol.L-1的冷高氯酸溶液成10%匀浆，9000×g冷冻离心15 min。取上清液0.4 mL加入3 mol.L-1的碳酸钾溶液0.04 mL调pH至中性，4 ℃下4000×g离心5 min，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：色谱柱ODS-C18。流动相为0.1 mol.L-1磷酸盐缓冲液，流速1 mL.min-1。紫外检测波长254 nm。
DA含量的测定 纹状体称重后以1∶10(W/V)加入0.1 mol.L-1的高氯酸，在冰浴下用超声波细胞粉碎器制成匀浆，15000×g冷冻离心，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：采用外标法测定纹状体DA含量。色谱柱ODS-C18，前面加预柱。电化学检测器(日本L-ECD-6A)，电压+0.75 mv。流动相为0.1 mol.L-1柠檬酸，0.1 mol.L-1乙酸钠，每升含EDTA 5 mg，辛烷磺酸钠230 mg(pH 3.5)，流速1 mL.min-1[5]。
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结果
EEG的变化 所有沙土鼠的EEG均在阻断双侧颈总动脉1 min内成等电位，再灌注后逐渐恢复。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时EEG各脑电波比率(α，β，δ，θ)与缺血前相比已无显著差别，但对照组再灌注60 min时EEG的慢波(δ)比率仍明显高于缺血前。
沙土鼠海马ATP，ADP，AMP含量的测定 脑缺血组缺血10 min，海马ATP含量与假手术组比明显减少，差别有非常显著意义(P<0.01)。对照组再灌注60 min时ATP含量上升为假手术组的64%，差别有非常显著意义(P<0.01)。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时ATP含量分别为假手术组的82%和89%，均高于对照组，差别有显著或非常显著意义(P<0.05或P<0.01)，但巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组之间差别无显著意义(P>0.05)见表1。
表1 各组沙土鼠海马ATP，ADP，AMP含量的
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测定(
±s,n=8)(mmol.L-1) 组别ATP
ADP
AMP
ATP+ADP+AMP
假手术
0.94±0.19
0.7±0.3
1.1±0.3
2.8±0.8
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脑缺血
0.19±0.11c
0.43±0.08
1.08±0.17
1.7±0.4
对照
0.60±0.09f
0.39±0.07
0.85±0.16
1.8±0.3
巴曲抗栓酶Ⅰ
0.77±0.10h
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0.48±0.15
1.06±0.26
2.3±0.5
巴曲抗栓酶Ⅱ
0.84±0.17ij
0.60±0.12
1.13±0.23
2.6±0.5
脑缺血组与假手术组比较t检验：cP<0.01；对照组与脑缺血组比较t检验：fP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与对照组比较t检验：hP<0.05；巴曲抗栓酶Ⅱ组与对照组比较t检验：iP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与巴曲抗栓酶Ⅱ组比较t检验：jP>0.05。 沙土鼠纹状体DA含量的测定 脑缺血组缺血10 min，沙土鼠纹状体DA的含量降低为假手术组的30%，两者差别有非常显著意义(P<0.01)。对照组再灌注60 min时DA仅为假手术组的52%，而巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时DA却为假手术组的77%和80%，差别有非常显著意义或显著意义(P<0.01或P<0.05)，但2个剂量组之间差别无显著意义(P>0.05)见表2。
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表2 各组沙土鼠纹状体DA含量的测定(
±s,n=8) 组别DA/μg.kg-1
假手术
6638±719
脑缺血
1961±414c
对 照
3460±947f
巴曲抗栓酶Ⅰ
5088±1062h
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巴曲抗栓酶Ⅱ
5291±1140ij
脑缺血组与假手术组比较t检验：cP<0.01；对照组与脑缺血组比较t检验：fP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与对照组比较t检验：hP<0.05；巴曲抗栓酶Ⅱ组与对照组比较t检验：iP<0.01；巴曲抗栓酶Ⅰ组与巴曲抗栓酶Ⅱ组比较t检验：jP>0.05。 短暂脑缺血即可造成纹状体多巴胺(dopamine,DA)大量释放和纹状体的缺血性损伤，而如果在脑缺血前耗竭纹状体内的多巴胺则可减轻脑缺血再灌注损伤，这提示脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化与脑缺血再灌注损伤的严重程度密切相关[1，2]。巴曲抗栓酶[batroxobin(DF-512)]为新型溶栓药，已有报道其能减轻脑缺血后脑水肿的程度，减少氧自由基的产生等[3]，临床已广泛用于治疗缺血性脑血管疾病[4]，但巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺含量变化的影响，作者目前还未见有文献报道。因为在正常情况下纹状体多巴胺的重吸收需消耗ATP，而脑缺血常导致脑细胞能量代谢的紊乱从而有可能影响纹状体DA的含量，因此本实验同时研究巴曲抗栓酶对脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺和海马ATP含量变化的影响，以探讨两者之间的关系。
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材料和方法
药品 巴曲抗栓酶，日本东菱药品工业株式会社产品，进口许可证号X930498。DA，ATP，ADP，AMP的标准品由Sigma公司购买，其余试剂均为国产分析纯。
动物模型和分组 沙土鼠40只，体重50～60 g，由本院实验动物中心提供，合格动物证号苏动(质)95021。随机将动物分为5组，假手术组、脑缺血组、对照组(0.9%氯化钠注射液)、巴曲抗栓酶Ⅰ(8BU*kg-1)组和巴曲抗栓酶Ⅱ(16 BU*kg-1)组，每组8只。沙土鼠用3%戊巴比妥钠溶液(40 mg*kg-1)腹腔注射麻醉，仔细分离沙土鼠双侧颈总动脉，应用无创动脉夹阻断颈总动脉血流造成脑缺血10 min，然后松开动脉夹恢复脑血流再灌注60 min。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不予阻断。监测EEG判断沙土鼠是否造成脑缺血，监测电极位于前囟后，中线旁2 mm，参考电极置于中线。为避免脑温变化对实验结果的影响，所有沙土鼠均置于流动空气浴箱中，监测鼓膜温度反映脑温并控制动物脑温于37 ℃±s0.2 ℃。巴曲抗栓酶于再灌注开始的同时由腹腔给予，假手术组和对照组给予等量0.9%氯化钠注射液作对照。动物在脑缺血10 min或再灌注60 min断头，在0.9%氯化钠注射液冰面上分取海马和纹状体，液氮冷冻，-75 ℃冰箱保存，分批测定海马ATP，ADP，AMP含量和纹状体DA的含量。
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ATP，ADP，AMP含量的测定 海马组织称重，加0.4 mmol*L-1的冷高氯酸溶液成10%匀浆，9000×g冷冻离心15 min。取上清液0.4 mL加入3 mol*L-1的碳酸钾溶液0.04 mL调pH至中性，4 ℃下4000×g离心5 min，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：色谱柱ODS-C18。流动相为0.1 mol*L-1磷酸盐缓冲液，流速1 mL*min-1。紫外检测波长254 nm。
DA含量的测定 纹状体称重后以1∶10(W/V)加入0.1 mol*L-1的高氯酸，在冰浴下用超声波细胞粉碎器制成匀浆，15000×g冷冻离心，取上清液10 μL进样。高效液相(SY5000型，美国)条件：采用外标法测定纹状体DA含量。色谱柱ODS-C18，前面加预柱。电化学检测器(日本L-ECD-6A)，电压+0.75 mv。流动相为0.1 mol*L-1柠檬酸，0.1 mol*L-1乙酸钠，每升含EDTA 5 mg，辛烷磺酸钠230 mg(pH 3.5)，流速1 mL*min-1[5]。
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结果
EEG的变化 所有沙土鼠的EEG均在阻断双侧颈总动脉1 min内成等电位，再灌注后逐渐恢复。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时EEG各脑电波比率(α，β，δ，θ)与缺血前相比已无显著差别，但对照组再灌注60 min时EEG的慢波(δ)比率仍明显高于缺血前。
沙土鼠海马ATP，ADP，AMP含量的测定 脑缺血组缺血10 min，海马ATP含量与假手术组比明显减少，差别有非常显著意义(P<0.01)。对照组再灌注60 min时ATP含量上升为假手术组的64%，差别有非常显著意义(P<0.01)。巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组再灌注60 min时ATP含量分别为假手术组的82%和89%，均高于对照组，差别有显著或非常显著意义(P<0.05或P<0.01)，但巴曲抗栓酶Ⅰ，Ⅱ组之间差别无显著意义(P>0.05)见表1。
沙土鼠的Willis动脉环发育不全，阻断双侧颈总动脉可造成前脑缺血，但也有少数沙土鼠存在解剖变异，仅阻断双侧颈总动脉难以造成前脑缺血。沙土鼠的脑电活动与脑血流量密切相关，EEG成等电位常为严重前脑缺血的标志，因此本实验监测沙土鼠的EEG判断脑缺血的完全程度[6]。对双侧颈总动脉阻断后1 min内EEG未成等电位的动物从实验中剔除，以保证本实验动物脑缺血模型的可靠性。
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Ahn[2]等报道，沙土鼠脑缺血5 min导致纹状体内的多巴胺释放大量增加。脑细胞外液增多的多巴胺通过儿茶酚胺的氧化脱氨基作用生成大量的.O2-和H2O2。H2O2和Fe2+反应生物活性非常活泼的OH.，导致细胞膜磷脂、蛋白质和核酸的氧化性损害，最终导致细胞功能障碍和死亡[7]。本实验发现8 BU.kg-1的巴曲抗栓酶可明显减少脑缺血再灌注期间纹状体多巴胺的释放，并且我们以前的实验已发现巴曲抗栓酶也能明显减少脑缺血再灌注期间OH.的产生[8]，这些结果提示巴曲抗栓酶可能通过减少脑缺血再灌注期间纹状体内多巴胺的释放，从而减少氧自由基产生而减轻脑缺血再灌注损伤。脑细胞外液中多巴胺的水平高低与脑缺血性损伤的严重程度密切相关，本实验通过测定纹状体内多巴胺的含量以推测脑细胞外液中多巴胺水平是一间接方法，若能应用脑内微透析技术直接测定脑细胞外液中多巴胺的水平，则更能反映巴曲抗栓酶影响脑缺血再灌注期间脑细胞外液中多巴胺水平变化的程度。
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细胞能量代谢的恢复是细胞其他生理生化功能恢复的基础，促进脑缺血后脑细胞能量代谢恢复的措施有可能减轻脑缺血再灌注损伤[9]。但短暂前脑缺血后脑细胞的死亡有一过程，海马CA1区的锥体细胞对脑缺血最为敏感，一般在脑缺血后2～4 d才开始，7 d左右才逐渐完善，故称之为延迟性神经元死亡(delayed neuronal death,DND)。本实验发现对照组脑缺血再灌注60 min ATP已恢复至缺血前的64%，但我们病理检查发现7 d后对照动物海马CA1区锥体细胞大部死亡[8]。巴曲抗栓酶组再灌注ATP恢复程度高于对照组，但其海马CA1区死亡的锥体细胞也接近50%，这些结果表明早期脑细胞ATP含量的恢复并不能用于判断脑缺血损伤的严重程度，这与Sutton[9]等的观点一致。这也提示巴曲抗栓酶并不是主要通过改善脑缺血后脑细胞的能量代谢而减轻脑缺血再灌注损伤。
在正常情况下，纹状体释放的多巴胺主要由囊泡膜主动重吸收，这一过程要消耗ATP。本实验发现沙土鼠脑缺血10 min后ATP含量明显降低，同时纹状体内多巴胺的含量也明显减少，提示脑缺血期间纹状体多巴胺含量减少可能主要由于ATP耗竭致多巴胺重吸收减少所致，这与Ahn[2]等的观点一致。但本实验也发现，在再灌注期间对照组和巴曲抗栓酶组ATP恢复的程度均高于纹状体内多巴胺含量恢复的程度，这一结果提示在再灌注期间除ATP含量外还存在其他影响纹状体多巴胺含量的因素。Ahn[2]等认为，脑缺血后兴奋性氨基酸释放导致细胞内Ca2+超载，从而引起一系列的脂质过氧化反应，导致贮存多巴胺的囊泡膜损害，使多巴胺释放增加是再灌注期间纹状体多巴胺含量减少的主要原因。基于此，我们推测巴曲抗栓酶可能通过抑制沙土鼠脑缺血再灌注期间Ca2+超载而减少再灌注期间纹状体内多巴胺的释放。
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[基金项目]江苏省卫生厅资助课题(Z9717)
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[收稿日期]1998-11-23 [接受日期]1999-05-10, 百拇医药