微生物检定法测定硫酸西索米星及硫奈替米星时剂量浓度的确定

http://www.100md.com 《海峡药学》 1999年第2期

     作者：王 敏 马赛骏

    单位：福建省药品检验所

    关键词：硫酸西索米星；硫酸奈替米星；微生物检定法；短小芽孢杆菌；剂量反应关系；剂量浓度

    摘要 本文报导了用短小芽孢杆菌摘要 本文报导了用短小芽孢杆菌[CMCC(B)63202]为检定菌测定硫酸西索米星和硫酸奈替米星生物效价时的剂量反应关系、剂量反应直线回归方程、相关系数和斜率可信限。方法结果表明：当硫酸西索米星和硫酸奈替米星的剂量浓度分别为1.98～18.45 u/ml、1.72～20.00 u/ml时有良好的线性关系。用二剂法测定两者的效价时，分别选用5 u/ml和10 u/ml及10 u/ml和20 u/ml为较佳。

    硫酸西索米星及硫酸奈替米星均系氨基糖苷类抗生素。硫酸西索米星其化学结构与庆大霉素C_1a相似，所不同的是4′，5′位碳-碳之间有一双键，硫酸奈替米星即为硫酸西索米星N¹位上氢被一乙基取代。西索米星的体内抗菌活性大大强于庆大霉素。奈替米星比西索米星更高效低毒，为理想的新型氨基糖苷类抗生素。美国药典和日本抗生物质医药品基准(日抗基)均已收载。作为新增品种已被推荐上中国药典2000年版。

    对此2个品种的含量测定方法，美国药典和日抗基现行版均定为微生物检定法，采用检定菌为表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌。鉴于上述菌种来源和保存均较困难，作者选用了易得易保存的短小芽孢杆菌作为检定菌，实验证明：抑菌圈边缘清晰，高低剂量拉开，在一定对数剂量浓度间线性关系良好，可推荐替代使用。

    1 实验试剂和仪器

    Ⅰ号(pH7.8～8.0)干燥培养基(中国药品生物制品检定所)；磷酸氢二钾(分析纯)；磷酸二氢钾(分析纯)；短小芽孢杆菌Bacillus pumilus[CMCC(B)63202]

    按[1]方法制备短小芽孢杆菌悬液；ZY-300A抑菌圈测定仪(北京先驱威峰公司)；硫酸西索米星、硫酸奈替米星工作标准品(福兴医药有限公司提供)。

    2 实验方法

    2.1 精密称取硫酸西索米星标准品约40.0mg，加pH7.8缓冲液^[1]制成3.57 u/ml为中心浓度，同时制成18.45 u/ml为高浓度，依次稀释得14.76、11.81、9.45、7.56、6.05、4.84、3.87、3.10、2.48和1.98 u/ml ll个浓度，相邻两个浓度比为0.8。

    2.2 按^[1]方法制备双碟33个。

    2.3 每个碟子置6个不锈钢小杯，相间滴加中心浓度和各梯度溶液，每一浓度滴3个碟子。37℃培养18 h，依次测量抑菌圈面积。

    2.4 另精密称取奈替米星标准品约40.0mg，加pH7.8缓冲液制成6 u/ml为中心浓度，同时制成20.0 u/ml为高浓度，依次稀释得16.0、12.8、10.24、8.19、6.55、5.24、4.19、3.36、2.68、2.14、1.72 u/ml 12个浓度，相邻两个浓度比为0.8，以下操作同“2.2”～“2.3”项方法。

    3 实验结果 (见表1.2)。

    表1 硫酸西索米星剂量对数与抑菌圈面积

    梯度浓度C

    logC(x)

    中心浓度平均抑菌圈面积与

    各剂量平均抑菌圈面积之差(y)

    1.98

    0.2967

    -5.55

    2.48

    0.3944

    -1.05

    3.10

    0.4914

    -0.50

    3.87

    0.5877

    -0.01

    4.84

    0.6848

    +0.55

    6.05

    0.7818

    +1.07

    7.56

    0.8785

    +1.56

    9.45

    0.9754

    +2.14

    11.81

    1.0722

    +2.71

    14.76

    1.1691

    +3.14

    18.45

    1.2660

    +3.75

    直线回归方程 y＝5.454X-3.383，r＝0.9998。斜率的可信限率为0.1%^[2](P＝0.95)。结果表明：当浓度在1.98～18.45u/ml时有良好的线性关系。

    表2 硫酸奈替米星剂量对数与抑菌圈面积

    梯度浓度C

    logC(x)

    中心浓度平均抑菌面积与各

    剂量平均抑菌圈面积之差(Y)

    1.72

    0.2355

    -2.95

    2.14

    0.3304

    -2.58

    2.68

    0.4281

    -1.86

    3.36

    0.5263

    -1.43

    4.19

    0.6222

    -0.97

    5.24

    0.7193

    -0.18

    6.55

    0.8162

    +0.17

    8.19

    0.9133

    +0.67

    10.24

    1.0103

    +1.24

    12.80

    1.1072

    +1.68

    16.00

    1.2041

    +2.22

    20.00

    1.3010

    +2.71

    直线回归方程y＝5.37x-4.23，r＝0.9991。斜率的可信限率为0.2%^[2](P＝0.95)。结果表明：当剂量浓度为1.72～20.00 u/ml时有良好的线性关系。4 讨论

    4.1 只需配制一个最高浓度，用以下方法即可得到一系列所需梯度浓度溶液：精密吸取10 ml于一干燥50 ml容量瓶中，将上一级高浓度溶液加至刻度，摇匀即为下一级浓度。两者剂量比为0.8(即40/50)如法依次得到所需的浓度系列，此方法简便准确，各浓度点易在一条直线上。

    4.2 当剂量高于15 u/ml时，西索米星的抑菌圈开始有双圈，以示剂量过大。因此在1.98～18.45 u/ml线性范围内选用5 u/ml和10 u/ml作二剂量测定为佳。

    4.3 当剂量低于10 u/ml时，奈替米星的抑菌圈偏小，因此在1.72～20.00 u/ml的线性范围内选用10 u/ml和20 u/ml作二剂量法测定为佳。

    4.4 西索米星和奈替米星基本上为单一组份药物。因此不同组份对不同菌种敏感性的影响可不予考虑。

    参考文献

    1.中华人民共和国药典：1995年版；二部，附录70～74

    2.周海钧等：生物检定统计方法，人民卫生出版社，北京，1988；第一版，81

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