HPLC法测定蘑菇粉等中水溶性维生素的含量
作者：黄红霞
单位：福建省食品质量监督检验站
关键词：HPLC；食品；水溶性维生素
海峡药学990420 摘要 本文探讨了应用HPLC法对食物中的水溶性维生素测定的一种方法。样品采用稀盐酸提取，经μ Bondapak C18柱分离，流动相为甲醇-水体系中加入0.1 mol/L NaAc，0.02%三乙胺用HAC调pH为4.18，254 nm处紫外测定。梯度洗脱，样品中7种水溶性维生素完全分离并定量测定。回收率为91.6～104.2%，相对标准偏差小于3.90%，线性相关系数在0.9950以上。
The Determination of the Water-Soluble Vitamins in
Food by High Performance Liquid Chromatography
, 百拇医药
Huang Hongxia
(Fujian station of Food Inspection，Fuzhou)
Abstract The water-soluble vitamines(Vit.C，Vit.B1、Vit.B2，Vit.B6，Vit.B12，nicotinic acid and nicotinamide)in food samples were separated on a μ-Bondapak C18 column with a mobile phase containing methanolwater(with 0.1 mol/L NaAc-HAc，0.02% triethylamine，pH 4.18)and UV-254 nm detcction.The recovery was 91.6%～104.2%，RSD was less than 3.90%，and correlation coefficient was nore than 0.9950。
, 百拇医药
Key words HPLC Food Vitamin
维生素是维持人体细胞正常功能所必需的物质，其中有一些维生素人体内不能合成，只能从食物或营养素补充剂中摄取、目前市场上各种强化维生素的食物不断出现，需要建立快速准确的检测方法。传统的维生素B1、B2的测定较多采用荧光分析法[1，2]。高效液相色谱分析，尤其是离子色谱法测定各种水溶性维生素近来报道较多[3，4，5]。由于离子对试剂价格昂贵，成本高，不易推广应用。本文采用稀盐酸对食物中水溶性维生素进行提取，在甲醇-水体系中加入盐类[6]对7种维生素进行分离和测定，方法简便，快速，重视性好。现报告于下。
1 实验部分
1.1 试剂 甲醇、醋酸钠、盐酸、三乙胺均为分析纯试剂。维生素标准液。维生素C，B1，B2，B6，B12，菸酸，菸酰胺均为生化试剂(纯度>97%)。用蒸馏水分别溶解以上维生素标准品，使其浓度大约为1 ml相当于1 mg作为储备液(维生素C分析前配制)。使用前分别吸取维生素C，B6，B2 0.2 ml；维生素B1，菸酸、菸酰胺0.05 ml；维生素B12 0.05 ml于10 ml容量瓶，用水定容制成混合标样。
, 百拇医药
1.2 仪器与测试条件 Waters液相色谱仪，M440紫外检测器，M730数据处理机。色谱条件 色谱柱：μ Bondapak C18 3.9×300 mm；流动相：A：甲醇，B：水(0.1 mol/L NaAc-HAc，0.02%三乙胺，pH4.18)。梯度洗脱(见表1)。流速：1 ml/min；检测波长：254 nm；灵敏度：0.05 AUFS。
表1 梯度洗脱 洗脱时间(min)
0～10
10～25
甲醇比例(%)
18
28
1.3 实验步骤 精密称取2～5 g样品，加入50 ml 0.1 mol/L HCl于70℃水浴中提取30 min。冷却后，用NaAc测pH值为4.18左右。定容至100 ml，过滤，滤液经0.45 μ滤膜过滤后备作进样，进样量为20 μl。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 按2.3条件分别分离混合外标标液(见图1)和食品中水溶性维生素(见图2)。在该条件下样品及标样均能得到较好的分离。
图1 混合标液色谱分离图
1.Vit.C，2.菸酸，3.Vit B1，4.Vit B6，5.菸酰胺，6.Vit.B12，7.Vit B2
图2 蘑菇粉样品色谱分离图
图中1，2，3～7同图1
, http://www.100md.com
2.2 回收率试验 在蘑菇粉样品中加入被测组分，进行回收试验，结果(见表2)，平均回收率为91.6～104.2%。
2.3 重复性试验 取样品(部分被测组分模拟加入)在2.3条件下，重复进行6次试验，结果(见表3)，相对标准偏差小于3.90%。表2 回 收 率 试 验 结 果 名 称
原有量
(mg)
添加量
(mg)
测定量
(mg)
回收率
%
, http://www.100md.com
维生素C
1.468
1.668
3.013
92.6
菸 酸
0.229
0.226
0.447
96.5
维生素B1
1.846
2.172
, 百拇医药
4.021
100.1
维生素B6
0.140
0.120
0.265
104.2
菸酰胺
0.632
0.618
1.198
91.6
, 百拇医药 维生素B2
0.0999
0.200
0.284
92.0
表3 重现性试验结果(n＝6) 名 称
X-(mg/100 g)
标准偏差
(mg/100 g)
相对标准偏差
(%)
维生素C
, http://www.100md.com
40.89
0.961
2.35
菸酸
62.13
1.73
2.78
*维生素B1
50.95
1.99
3.90
*维生素B6
, http://www.100md.com
28.34
0.794
2.80
菸酰胺
55.10
0.628
1.14
*s维生素B12
14.45
0.499
3.45
维生素B2
, http://www.100md.com
78.82
2.48
3.15
2.4 线性关系 分别取5～25 μl混合标液进样，以峰面积为纵座标，以进样体积(μl)为横座标，求得线性回归方程和线性相关系数(见表4)。
表4 线性关系 名 称
线性回归方程
相关系数(r)
维生素C
y＝0.2500x-0.8886
0.9992
菸酸
, 百拇医药
y＝0.1442x+0.09130
0.9994
维生素B1
y＝0.1499x+0.4930
0.9988
维生素B6
y＝0.3214x-0.02429
0.9983
菸酰胺
y＝0.05745x＝0.05028
0.9998
, 百拇医药
维生素B12
y＝0.05719x+0.004410
0.9950
维生素B2
y＝0.2647x+0.06448
0.9980
2.5 采用本方法对不同样品测定结果(见表5)。表5 不同样品测试结果 样名
维生素
C
(mg/
100 g)
, 百拇医药
菸酸
(mg/
100 g)
维生素
B1
(mg/
100 g)
维生素
B6
(mg/
100 g)
菸酰胺
(mg/
, 百拇医药
100 g)
维生素
B2
(mg/
100 g)
巴西蘑菇粉
91.1
14.2
114.6
8.7
39.2
6.2
正分子核酸粉
, http://www.100md.com
40.9
62.1
/
/
55.1
788
梅奥核酸粉
58.7
84.7
/
/
111.6
/
, http://www.100md.com
灵芝粉
51.8
/
33.7
10.4
71.9
5.2
鲜莲籽汁
0.26
0.02
0.30
/
0.12
, 百拇医药
0.02
较大婴儿奶粉
13.22
/
0.58
/
/
0.26
3 讨 论
3.1 流动相pH不同对保留时间的影响(见图3)，当pH在4.18时7种水溶性维生素能达到明显分离。
图3 水溶性维生素的保留时间与流动相B中的pH的关系
, 百拇医药
图中符号同图1
3.2 流动相中甲醇含量对维生素分离的影响 实验表明，当甲醇比例为10%时，维生素B1、B6重叠，当甲醇比例>10%时，维生素B1先于维生素B6出峰。当甲醇比例<10%时维生素B6先于维生素B1出峰。而对保留时间较长的维生素B2、B12两峰甲醇含量必须增至28%时才出峰。
3.3 流动相中三乙胺的影响 在流动相中添加三乙胺是为了减少碱性维生素的拖尾，不加三乙胺，维生素B1、B6峰严重拖尾。
3.4 维生素提取剂的选择 考虑到7种水溶性维生素中维生素C的稳定性最差，故我们仅作了室温(25℃)下，12 h内维生素C分别在0.1 mol/L盐酸，3%偏磷酸，3%草酸，3%三氯乙酸4种不同提取剂中的稳定性试验。结果表明，0.1 mol/L盐酸、3%偏磷酸较为理想，3%草酸次之，而3%三氯乙酸对维生素C并无稳定作用，只是能较完全地沉淀样品中的蛋白质，而0.1 mol/L盐酸，3%偏磷酸也具有明显沉淀蛋白作用。考虑到偏磷酸的试剂峰影响维生素C测定。故选用0.1 mol/L盐酸作为水溶性维生素的提取剂。
, 百拇医药
参考文献
1 GB/T 12390—99 食物中硫胺素、核黄素的测定法
2 Rashid I.et al：食品中Vit B1,B2的LC测定 J Food Sci 1980；45，744
3 王秀英；高效液相色谱法测定天然海藻中的多种水溶性维生素 色谱 1993；11(6)∶364
4 吴红京等：高效液相色谱法测定糙米粉中的维生素 色谱 1996；14(2)∶140
5 李立平；高效液相色谱法测定强化维生素奶粉中的Vit B1,和B2 色谱 1993；11(1)∶49
6 赵厚尼等；用改进的流动相在C18柱上分离7种水溶性维生素 色谱 1993；11(4)∶249, http://www.100md.com
单位：福建省食品质量监督检验站
关键词：HPLC；食品；水溶性维生素
海峡药学990420 摘要 本文探讨了应用HPLC法对食物中的水溶性维生素测定的一种方法。样品采用稀盐酸提取，经μ Bondapak C18柱分离，流动相为甲醇-水体系中加入0.1 mol/L NaAc，0.02%三乙胺用HAC调pH为4.18，254 nm处紫外测定。梯度洗脱，样品中7种水溶性维生素完全分离并定量测定。回收率为91.6～104.2%，相对标准偏差小于3.90%，线性相关系数在0.9950以上。
The Determination of the Water-Soluble Vitamins in
Food by High Performance Liquid Chromatography
, 百拇医药
Huang Hongxia
(Fujian station of Food Inspection，Fuzhou)
Abstract The water-soluble vitamines(Vit.C，Vit.B1、Vit.B2，Vit.B6，Vit.B12，nicotinic acid and nicotinamide)in food samples were separated on a μ-Bondapak C18 column with a mobile phase containing methanolwater(with 0.1 mol/L NaAc-HAc，0.02% triethylamine，pH 4.18)and UV-254 nm detcction.The recovery was 91.6%～104.2%，RSD was less than 3.90%，and correlation coefficient was nore than 0.9950。
, 百拇医药
Key words HPLC Food Vitamin
维生素是维持人体细胞正常功能所必需的物质，其中有一些维生素人体内不能合成，只能从食物或营养素补充剂中摄取、目前市场上各种强化维生素的食物不断出现，需要建立快速准确的检测方法。传统的维生素B1、B2的测定较多采用荧光分析法[1，2]。高效液相色谱分析，尤其是离子色谱法测定各种水溶性维生素近来报道较多[3，4，5]。由于离子对试剂价格昂贵，成本高，不易推广应用。本文采用稀盐酸对食物中水溶性维生素进行提取，在甲醇-水体系中加入盐类[6]对7种维生素进行分离和测定，方法简便，快速，重视性好。现报告于下。
1 实验部分
1.1 试剂 甲醇、醋酸钠、盐酸、三乙胺均为分析纯试剂。维生素标准液。维生素C，B1，B2，B6，B12，菸酸，菸酰胺均为生化试剂(纯度>97%)。用蒸馏水分别溶解以上维生素标准品，使其浓度大约为1 ml相当于1 mg作为储备液(维生素C分析前配制)。使用前分别吸取维生素C，B6，B2 0.2 ml；维生素B1，菸酸、菸酰胺0.05 ml；维生素B12 0.05 ml于10 ml容量瓶，用水定容制成混合标样。
, 百拇医药
1.2 仪器与测试条件 Waters液相色谱仪，M440紫外检测器，M730数据处理机。色谱条件 色谱柱：μ Bondapak C18 3.9×300 mm；流动相：A：甲醇，B：水(0.1 mol/L NaAc-HAc，0.02%三乙胺，pH4.18)。梯度洗脱(见表1)。流速：1 ml/min；检测波长：254 nm；灵敏度：0.05 AUFS。
表1 梯度洗脱 洗脱时间(min)
0～10
10～25
甲醇比例(%)
18
28
1.3 实验步骤 精密称取2～5 g样品，加入50 ml 0.1 mol/L HCl于70℃水浴中提取30 min。冷却后，用NaAc测pH值为4.18左右。定容至100 ml，过滤，滤液经0.45 μ滤膜过滤后备作进样，进样量为20 μl。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 按2.3条件分别分离混合外标标液(见图1)和食品中水溶性维生素(见图2)。在该条件下样品及标样均能得到较好的分离。
图1 混合标液色谱分离图
1.Vit.C，2.菸酸，3.Vit B1，4.Vit B6，5.菸酰胺，6.Vit.B12，7.Vit B2
图2 蘑菇粉样品色谱分离图
图中1，2，3～7同图1
, http://www.100md.com
2.2 回收率试验 在蘑菇粉样品中加入被测组分，进行回收试验，结果(见表2)，平均回收率为91.6～104.2%。
2.3 重复性试验 取样品(部分被测组分模拟加入)在2.3条件下，重复进行6次试验，结果(见表3)，相对标准偏差小于3.90%。表2 回 收 率 试 验 结 果 名 称
原有量
(mg)
添加量
(mg)
测定量
(mg)
回收率
%
, http://www.100md.com
维生素C
1.468
1.668
3.013
92.6
菸 酸
0.229
0.226
0.447
96.5
维生素B1
1.846
2.172
, 百拇医药
4.021
100.1
维生素B6
0.140
0.120
0.265
104.2
菸酰胺
0.632
0.618
1.198
91.6
, 百拇医药 维生素B2
0.0999
0.200
0.284
92.0
表3 重现性试验结果(n＝6) 名 称
X-(mg/100 g)
标准偏差
(mg/100 g)
相对标准偏差
(%)
维生素C
, http://www.100md.com
40.89
0.961
2.35
菸酸
62.13
1.73
2.78
*维生素B1
50.95
1.99
3.90
*维生素B6
, http://www.100md.com
28.34
0.794
2.80
菸酰胺
55.10
0.628
1.14
*s维生素B12
14.45
0.499
3.45
维生素B2
, http://www.100md.com
78.82
2.48
3.15
2.4 线性关系 分别取5～25 μl混合标液进样，以峰面积为纵座标，以进样体积(μl)为横座标，求得线性回归方程和线性相关系数(见表4)。
表4 线性关系 名 称
线性回归方程
相关系数(r)
维生素C
y＝0.2500x-0.8886
0.9992
菸酸
, 百拇医药
y＝0.1442x+0.09130
0.9994
维生素B1
y＝0.1499x+0.4930
0.9988
维生素B6
y＝0.3214x-0.02429
0.9983
菸酰胺
y＝0.05745x＝0.05028
0.9998
, 百拇医药
维生素B12
y＝0.05719x+0.004410
0.9950
维生素B2
y＝0.2647x+0.06448
0.9980
2.5 采用本方法对不同样品测定结果(见表5)。表5 不同样品测试结果 样名
维生素
C
(mg/
100 g)
, 百拇医药
菸酸
(mg/
100 g)
维生素
B1
(mg/
100 g)
维生素
B6
(mg/
100 g)
菸酰胺
(mg/
, 百拇医药
100 g)
维生素
B2
(mg/
100 g)
巴西蘑菇粉
91.1
14.2
114.6
8.7
39.2
6.2
正分子核酸粉
, http://www.100md.com
40.9
62.1
/
/
55.1
788
梅奥核酸粉
58.7
84.7
/
/
111.6
/
, http://www.100md.com
灵芝粉
51.8
/
33.7
10.4
71.9
5.2
鲜莲籽汁
0.26
0.02
0.30
/
0.12
, 百拇医药
0.02
较大婴儿奶粉
13.22
/
0.58
/
/
0.26
3 讨 论
3.1 流动相pH不同对保留时间的影响(见图3)，当pH在4.18时7种水溶性维生素能达到明显分离。
图3 水溶性维生素的保留时间与流动相B中的pH的关系
, 百拇医药
图中符号同图1
3.2 流动相中甲醇含量对维生素分离的影响 实验表明，当甲醇比例为10%时，维生素B1、B6重叠，当甲醇比例>10%时，维生素B1先于维生素B6出峰。当甲醇比例<10%时维生素B6先于维生素B1出峰。而对保留时间较长的维生素B2、B12两峰甲醇含量必须增至28%时才出峰。
3.3 流动相中三乙胺的影响 在流动相中添加三乙胺是为了减少碱性维生素的拖尾，不加三乙胺，维生素B1、B6峰严重拖尾。
3.4 维生素提取剂的选择 考虑到7种水溶性维生素中维生素C的稳定性最差，故我们仅作了室温(25℃)下，12 h内维生素C分别在0.1 mol/L盐酸，3%偏磷酸，3%草酸，3%三氯乙酸4种不同提取剂中的稳定性试验。结果表明，0.1 mol/L盐酸、3%偏磷酸较为理想，3%草酸次之，而3%三氯乙酸对维生素C并无稳定作用，只是能较完全地沉淀样品中的蛋白质，而0.1 mol/L盐酸，3%偏磷酸也具有明显沉淀蛋白作用。考虑到偏磷酸的试剂峰影响维生素C测定。故选用0.1 mol/L盐酸作为水溶性维生素的提取剂。
, 百拇医药
参考文献
1 GB/T 12390—99 食物中硫胺素、核黄素的测定法
2 Rashid I.et al：食品中Vit B1,B2的LC测定 J Food Sci 1980；45，744
3 王秀英；高效液相色谱法测定天然海藻中的多种水溶性维生素 色谱 1993；11(6)∶364
4 吴红京等：高效液相色谱法测定糙米粉中的维生素 色谱 1996；14(2)∶140
5 李立平；高效液相色谱法测定强化维生素奶粉中的Vit B1,和B2 色谱 1993；11(1)∶49
6 赵厚尼等；用改进的流动相在C18柱上分离7种水溶性维生素 色谱 1993；11(4)∶249, http://www.100md.com