电泳法测定ATP含量及影响因素的讨论
作者：刘翠英
单位：刘翠英(宁德地区药品检验所 352100)
关键词：
三磷酸腺苷二钠 三磷酸腺苷二钠(ATP)为腺嘌呤核苷-5′-三磷酸酯二钠盐，由发酵法制得。由于ATP在生产中易带入ADP等杂质，在贮存中易分解成ADP等。ATP、ADP、AMP在紫外均有吸收，必须用纸层析或纸电泳先行分离洗脱后，再用紫外法测其吸收度，计算含量。若分离不好，实验因素控制不当，则影响其含量的测定。
ATP的含量测定，卫生部标准及地方标准的测定方法均采用纸电泳法分离，紫外分光法测定其吸收度，计算含量。但具体测定过程各地方标准测定条件有所不同，或与药典规定存在差异。虽有规定测定方法以最新版药典为依据，但如ATP片仍按各地方标准检验，还未上卫生部标准，在检验过程存在无所适从的情况，可能由于电泳法测定ATP含量过程影响因素较多之故。因此，基于共同探讨解决这个问题，通过日常工作中的经验积累总结，对ATP的含量测定过程作初步的总结。
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1 实验部分
1.1 试液、缓冲液 0.01 mol/L盐酸液、1 mol/L甲酸液、枸橼酸盐缓冲液(pH 3.0)。
1.2 仪器和用具 紫外分光光度计、电吹风、水平式电泳仪、直流电源、色谱滤纸、容量瓶(10 ml)、具塞试管(20×100 mm)、刻度吸管、移液管(5 ml)、微量注射器、3号垂熔玻璃漏斗、紫外光灯(254 nm)。
1.3 仪器装置 参照《中国药典》1995年二部附录
1.4 操作法 1.4.1 试液、缓冲液 0.01 mol.L-1盐酸液 量取盐酸0.9 ml，加水至1000 ml混匀。1 mol.L-1甲酸液 取甲酸[98%(w/w 75.5 ml]，加水稀释至2000 ml。枸橼酸盐缓冲液(pH 3.0) 取枸橼酸(C6H8O7.H2O)39.04 g与枸橼酸钠(C6H5N3O7.2H2O)4.12 g(均精确至0.01 g)加水4000 ml，使溶解，用酸度计调pH值至3.0。1.4.2 色谱纸 取色谱滤纸置1 mol/L甲酸溶液中浸泡过液，次日取出用水漂洗至洗液pH值不低于4，置60℃烘箱烘干，备用，长度及大小根据电泳室的大小裁剪。1.4.3 点样 有湿法点样和干法点样。湿法点样：是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH 3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液：每点10 μl，共3点，并留2个空白位置；干法点样：是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器，将滤纸喷湿，点样处最后喷湿(本法适用于稀的供试品溶液)。1.4.4 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没铂电极，接通电泳仪，稳压电源档，调整电压梯度为18～20 v/cm，电泳1 h 45 min，取出立即吹干，置紫外灯(254 nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置，跑在滤纸最前面的紫色斑点是ATP。1.4.5 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.01 mol/L盐酸溶液5 ml，摇匀，放置1 h，用3号垂熔玻璃漏斗，滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。
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结果判断，2份样品的相对误差应不大于3%。
2 注意事项
2.1 点样位置在阴极
2.2 在不带电点样情况下，样品应在2～3 min内点完，立即开启电源进行电泳，否则造成斑点扩散，使测得的含量偏低。
2.3 用0.01 mol.L-1盐酸洗脱时，室温不宜过低，若室温低于15℃，可置25～30℃水浴中进行洗脱。
2.4 洗脱时，应不断振摇使洗脱完全，放置时间也不宜过长，否则，影响含量测定的稳定性。
2.5 微量注射器宜校正后使用。
3 讨论
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由于操作过程影响因素较多，以下几点是作者在工作中的几点感受与大家共同探讨。
3.1 枸橼酸盐缓冲液离子强度和pH值的影响，M/20缓冲液(pH4.8)的分离效果(ADP泳动距离/ATP的泳动距离为0.89)和分离速度(电压梯度20 V/cm时为3.7 cm/h)，不及M/20缓冲液(pH3)，后者分离效果为0.69，分离速度为6.5 cm/h。M/50缓冲液(pH 3)与M/20缓冲液(pH3)比较，前者斑点扩散。
3.2 层析滤纸经甲酸处理后，可除去纸中金属离子，使ATP、ADP、AMP的斑点集中，分离完全，且使滤纸的空白吸收值减小，有利于提高结果的精度。
3.3 采用湿法点样与干法点样，认为湿法带电点样，其斑点大小与分离效果均优于干法点样，测定结果平行性好。
3.4 电泳开始时，应立即在色谱纸上补充缓冲液，可避免因色谱纸上缓冲液过少，而影响斑点分离。
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3.5 测定波长和吸收系数，按核酸类物质测定，习惯在260 nm的波长处测定吸收度，而不是在吸收峰处，可能会因分光光度计波长误差引起测定结果的差异，卫生部标准(1989年)采用的吸收峰处(257±1 nm)测定，可克服这一不足。
3.6 电压梯度，直接根据色谱纸的实际电泳长度按(18～20 v/cm)计算总电压，较好控制。
3.7 电泳时间，不宜过长，按卫生部标准规定为1 h 45 min，有的地方标准，ATP片电泳时间2.5 h，时间过长影响整个试验操作安排，而且电泳过程因电能转化，不断散热，可能也会影响结果，建议采取散热措施。
3.8 各地方标准统一情况，有的地方标准，仍与卫生部标准，不能统一，电泳时，如缓冲液pH为(4.8)，测定波长为260 nm，E1%1 cm＝259，电泳时间为2.5 h，使得最后计算结果存在差异(与卫生部标准方法比较)。
参考文献
[1]中国药典：二部，1995；附录28
[2]中国药品检验标准操作规范/卫生部药政局：中国药品生物制品检定所编，北京，中国医药科技出版社，1996；6：352
[3]中华人民共和国卫生部药品标准：抗生素生化药品注释，中华人民共和国卫生部药典委员会编，1990；69, 百拇医药
单位：刘翠英(宁德地区药品检验所 352100)
关键词：
三磷酸腺苷二钠 三磷酸腺苷二钠(ATP)为腺嘌呤核苷-5′-三磷酸酯二钠盐，由发酵法制得。由于ATP在生产中易带入ADP等杂质，在贮存中易分解成ADP等。ATP、ADP、AMP在紫外均有吸收，必须用纸层析或纸电泳先行分离洗脱后，再用紫外法测其吸收度，计算含量。若分离不好，实验因素控制不当，则影响其含量的测定。
ATP的含量测定，卫生部标准及地方标准的测定方法均采用纸电泳法分离，紫外分光法测定其吸收度，计算含量。但具体测定过程各地方标准测定条件有所不同，或与药典规定存在差异。虽有规定测定方法以最新版药典为依据，但如ATP片仍按各地方标准检验，还未上卫生部标准，在检验过程存在无所适从的情况，可能由于电泳法测定ATP含量过程影响因素较多之故。因此，基于共同探讨解决这个问题，通过日常工作中的经验积累总结，对ATP的含量测定过程作初步的总结。
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1 实验部分
1.1 试液、缓冲液 0.01 mol/L盐酸液、1 mol/L甲酸液、枸橼酸盐缓冲液(pH 3.0)。
1.2 仪器和用具 紫外分光光度计、电吹风、水平式电泳仪、直流电源、色谱滤纸、容量瓶(10 ml)、具塞试管(20×100 mm)、刻度吸管、移液管(5 ml)、微量注射器、3号垂熔玻璃漏斗、紫外光灯(254 nm)。
1.3 仪器装置 参照《中国药典》1995年二部附录
1.4 操作法 1.4.1 试液、缓冲液 0.01 mol.L-1盐酸液 量取盐酸0.9 ml，加水至1000 ml混匀。1 mol.L-1甲酸液 取甲酸[98%(w/w 75.5 ml]，加水稀释至2000 ml。枸橼酸盐缓冲液(pH 3.0) 取枸橼酸(C6H8O7.H2O)39.04 g与枸橼酸钠(C6H5N3O7.2H2O)4.12 g(均精确至0.01 g)加水4000 ml，使溶解，用酸度计调pH值至3.0。1.4.2 色谱纸 取色谱滤纸置1 mol/L甲酸溶液中浸泡过液，次日取出用水漂洗至洗液pH值不低于4，置60℃烘箱烘干，备用，长度及大小根据电泳室的大小裁剪。1.4.3 点样 有湿法点样和干法点样。湿法点样：是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液(pH 3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加供试品溶液：每点10 μl，共3点，并留2个空白位置；干法点样：是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次，直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器，将滤纸喷湿，点样处最后喷湿(本法适用于稀的供试品溶液)。1.4.4 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液，浸没铂电极，接通电泳仪，稳压电源档，调整电压梯度为18～20 v/cm，电泳1 h 45 min，取出立即吹干，置紫外灯(254 nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置，跑在滤纸最前面的紫色斑点是ATP。1.4.5 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置相近的空白滤纸，剪成细条，分别置试管中，各精密加入0.01 mol/L盐酸溶液5 ml，摇匀，放置1 h，用3号垂熔玻璃漏斗，滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各药项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。
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结果判断，2份样品的相对误差应不大于3%。
2 注意事项
2.1 点样位置在阴极
2.2 在不带电点样情况下，样品应在2～3 min内点完，立即开启电源进行电泳，否则造成斑点扩散，使测得的含量偏低。
2.3 用0.01 mol.L-1盐酸洗脱时，室温不宜过低，若室温低于15℃，可置25～30℃水浴中进行洗脱。
2.4 洗脱时，应不断振摇使洗脱完全，放置时间也不宜过长，否则，影响含量测定的稳定性。
2.5 微量注射器宜校正后使用。
3 讨论
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由于操作过程影响因素较多，以下几点是作者在工作中的几点感受与大家共同探讨。
3.1 枸橼酸盐缓冲液离子强度和pH值的影响，M/20缓冲液(pH4.8)的分离效果(ADP泳动距离/ATP的泳动距离为0.89)和分离速度(电压梯度20 V/cm时为3.7 cm/h)，不及M/20缓冲液(pH3)，后者分离效果为0.69，分离速度为6.5 cm/h。M/50缓冲液(pH 3)与M/20缓冲液(pH3)比较，前者斑点扩散。
3.2 层析滤纸经甲酸处理后，可除去纸中金属离子，使ATP、ADP、AMP的斑点集中，分离完全，且使滤纸的空白吸收值减小，有利于提高结果的精度。
3.3 采用湿法点样与干法点样，认为湿法带电点样，其斑点大小与分离效果均优于干法点样，测定结果平行性好。
3.4 电泳开始时，应立即在色谱纸上补充缓冲液，可避免因色谱纸上缓冲液过少，而影响斑点分离。
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3.5 测定波长和吸收系数，按核酸类物质测定，习惯在260 nm的波长处测定吸收度，而不是在吸收峰处，可能会因分光光度计波长误差引起测定结果的差异，卫生部标准(1989年)采用的吸收峰处(257±1 nm)测定，可克服这一不足。
3.6 电压梯度，直接根据色谱纸的实际电泳长度按(18～20 v/cm)计算总电压，较好控制。
3.7 电泳时间，不宜过长，按卫生部标准规定为1 h 45 min，有的地方标准，ATP片电泳时间2.5 h，时间过长影响整个试验操作安排，而且电泳过程因电能转化，不断散热，可能也会影响结果，建议采取散热措施。
3.8 各地方标准统一情况，有的地方标准，仍与卫生部标准，不能统一，电泳时，如缓冲液pH为(4.8)，测定波长为260 nm，E1%1 cm＝259，电泳时间为2.5 h，使得最后计算结果存在差异(与卫生部标准方法比较)。
参考文献
[1]中国药典：二部，1995；附录28
[2]中国药品检验标准操作规范/卫生部药政局：中国药品生物制品检定所编，北京，中国医药科技出版社，1996；6：352
[3]中华人民共和国卫生部药品标准：抗生素生化药品注释，中华人民共和国卫生部药典委员会编，1990；69, 百拇医药