盐酸赖氨酸注射液细菌内毒素检查法的建立
作者：韦奇志 游伯翔 黄月梅 周智
单位：韦奇志(广西药品检验所 南宁 530021)游伯翔(广西药品检验所 南宁 530021)；黄月梅(广西药品检验所 南宁 530021)；周智(广西药品检验所 南宁 530021)
关键词：盐酸赖氨酸注射液；细菌内毒素；干扰试验
海峡药学000175 摘要 参照《中国药典》1995年版二部“盐酸赖氨酸”项下热原检查剂量，确定盐酸赖氨酸注射液的细菌内毒素限值为6.0 EU.ml-1。经干扰试验确证样品的最大无抑制浓度为50 mg.ml-1，对3批样品的热原检查与细菌内毒素检查对比试验，示发现有漏检现象。
细菌内毒素检查法以其灵敏、快捷、经济、可标准化而被世界多国药典收载。中国药典1995年版[1]正式将此法收载，我们按药典方法对盐酸赖氨酸注射液进行了干扰试验，通过稀释的方法排除盐酸赖氨酸对细菌内毒素试验的干扰，建立了该品种的细菌内毒素检查方法，为代替家兔热原检查法提供依据。
, 百拇医药
1 材料
1.1 盐酸赖氨酸注射液(LAS) 规格3 g∶10 ml，批号970101，970102，970103，广西南宁市邕江制药厂。
1.2 细菌内毒素工作标准品(CSE) 规格12 EU.支-1，批号9701，中国药品生物制品检定所。
1.3 鲎试剂(TAL)：批号960606，标示灵敏度(λ)0.06 EU.ml-1，规格0.1 ml.支-1；批号970904，λ值0.5 EU.支-1，规格0.1 ml.支-1；均为湛江安度斯生物有限公司提供。
1.4 细菌内毒素检查用水(WBET) 规格5 ml.支-1，批号970314，湛江安度斯生物有限公司。
, 百拇医药
1.5 试验所用的注射器、针头、移液管、试管、烧杯等器具经250℃干烤1 h破坏细菌内毒素；除热原吸头、空安瓿由湛江安度斯生物有限公司提供。
1.6 热原用兔 新西兰大白兔，本所动物室提供，合格证号一桂医动字第11003号。
2 方法与结果
2.1 热原试验 参照《中国药典》1995年版二部“盐酸赖氨酸”热原检查项下的规定，用氯化钠注射液将样品稀释为22.5 mg.ml-1的溶液，按家兔体重每kg静脉注射10 ml给药，结果3批样品均符合规定。
2.2 TAL灵敏度复核 按《中国药典》1995年版二部规定的方法复核试验用TAL灵敏度，结果均符合规定(见表1)。
表1 鲎试剂灵敏度复核结果 TAL批号
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内毒素浓度(EU.ml-1)
阴性管
1.0
0.5
0.25
0.125
0.06
0.03
0.015
970904
----
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960606
-
-
-
-
2.3 LAS内毒素限值(L)的确定、安全系数(f)及干扰试验中稀释倍数(D)范围的计算
按公式L＝K.M-1计算[2]LAS的L值，K为临床无任何不良反应的细菌内毒素阈剂量，静脉注射的药品规定为5 EU.kg-1，M为LAS热原检查时家兔的给药剂量(0.225g.kg-1即相当LAS原液，0.75ml.kg-1)，经计算L值为6.67 EU.ml-1。从安全性及操作的方便性考虑，样品的L值定为6.0 EU.ml-1，此L值的安全系数f按公式f＝K.(L.M)-1计算[3]，M为人用的最大剂量(0.115 ml.kg-1)，K值、L值不变，则f＝7.2，通常f值取3～10可保证用药安全，故取6.0 EU.ml-1为其L值是安全的。常用TAL的λ值在0.03～1.0 EU.ml-1，按D＝L.λ-1计算[3]，样品的稀释倍数D＝6倍～200倍。
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2.4 干扰试验预试验 用WBET将LAS作系列稀释(LAS系列)；同时，每一稀释度下均制备含有2λ浓度细菌内毒素的盐酸赖氨酸溶液(ELAS系列)。用λ值为0.06 EU.ml-1的鲎试剂分别与两个系列的溶液进行反应，并作阳性对照(PC)和阴性对照(NC)，每一稀释度作2管，结果(见表2)。表2 LAS的干扰试验预试验结果 批号
LAS稀释倍数
NC
PC
1
6
12
24
48
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96
192
970101
ELAS
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+
LAS
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-
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970102
ELAS
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LAS
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-
-
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-
970103
ELAS
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LAS
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-
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-
-
-
-
从表2可见，所用的3批LAS在各个稀释度下均无可测出的细菌内毒素，说明可用于干扰试验[4]。预试结果表明，LAS对鲎试剂与细菌内毒素的反应有抑制作用，但稀释6倍以上时，其抑制作用有可能被排除。
2.5 干扰试验 参照《中国药典》1995年版二部的干扰试验方法进行试验。
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从预试验得知，LAS在稀释6倍以上时有可能排除干扰。以WBET及LAS的6倍稀释液(用WBET稀释而得，下同)分别将细菌内毒素工作标准品配成浓度为0.125 EU.ml-1、0.06 EU.ml-1、0.03 EU.ml-1及0.015 EU.ml-1的溶液(分别为WBET系列、LAS系列)，并设各系列本身的NC对照管。用同一批鲎试剂(λ为0.06 EU.ml-1)测定并比较同一批细菌内毒素工作标准品在两个系列溶液中的效价(Es及Et)，按公式：Et(或Es)＝1g-1(ΣX/4)进行计算，其中X为LAS系列或WBET系列各反应终点细菌内毒素浓度的对数值。结果表明，Es及Et均在0.5λ～2.0λ范围内，且Es/Et值均在0.5～2.0范围，说明LAS稀释6倍后，消除了其对鲎试剂与细菌内毒素反应的抑制作用。因此，确证LAS的最大无抑制浓度为其6倍稀释液(50mg.ml-1)(见表3)。表3 干扰试验结果 批号
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内毒素浓度(EU.ml-1)
NC
效价
0.125
0.06
0.03
0.015
WBET
-
-
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Es∶0.125
970101
LAS
-
-
-
-
Et∶0.125
970102
LAS
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-
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Et∶0.125
970103
LAS
-
-
-
-
Et∶0.125
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2.6 LAS的细菌内毒素检查 按《中国药典》1995年版二部细菌内毒素检查法进行检查，样品的稀释倍数按D＝L.λ-1计算，L值取6.0 EU.ml-1，用λ值为0.5 EU.ml-1的TAL进行检查，则样品应稀释12倍(25 mg.ml-1)。结果，3批样品均呈阴性反应。
3 小结 综上结果，广西南宁邕江制药厂提供的3批盐酸赖氨酸注射液参照《中国药典》1995年版二部“盐酸赖氨酸”项下检查热原，结果均符合规定。按现行版中国药典规定的盐酸赖氨酸热原检查给药量计算，确定样品的内毒素限值为6.0 EU.ml-1。3批样品对鲎试剂与细菌内毒素的反应均有抑制作用，但样品稀释6倍后即可消除此抑制作用，从而确证样品的最大无抑制浓度为50 mg.ml-1。3批样品的细菌内毒素检查与热原检查比较，未发现有漏检现象。表明盐酸赖氨酸注射液可用细菌内毒素检查法代替家兔法进行热原检查。 参考文献
[1]卫生部药典委员会.细菌内毒素检查法.中国药典1995年版二部.北京，化学工业出版社，广州：广东科技出版社，1995；附录76
[2]夏振民：药品细菌内毒素检查的限值药物分析杂志 1995；15(3)∶54
[3]黄清泉等：药品细菌内毒素检查的实验设计 中国药学杂志 1997；32(2)∶72
[4]Bacterial endotoxins test，USP-NF XⅢ.1995；1696, 百拇医药
单位：韦奇志(广西药品检验所 南宁 530021)游伯翔(广西药品检验所 南宁 530021)；黄月梅(广西药品检验所 南宁 530021)；周智(广西药品检验所 南宁 530021)
关键词：盐酸赖氨酸注射液；细菌内毒素；干扰试验
海峡药学000175 摘要 参照《中国药典》1995年版二部“盐酸赖氨酸”项下热原检查剂量，确定盐酸赖氨酸注射液的细菌内毒素限值为6.0 EU.ml-1。经干扰试验确证样品的最大无抑制浓度为50 mg.ml-1，对3批样品的热原检查与细菌内毒素检查对比试验，示发现有漏检现象。
细菌内毒素检查法以其灵敏、快捷、经济、可标准化而被世界多国药典收载。中国药典1995年版[1]正式将此法收载，我们按药典方法对盐酸赖氨酸注射液进行了干扰试验，通过稀释的方法排除盐酸赖氨酸对细菌内毒素试验的干扰，建立了该品种的细菌内毒素检查方法，为代替家兔热原检查法提供依据。
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1 材料
1.1 盐酸赖氨酸注射液(LAS) 规格3 g∶10 ml，批号970101，970102，970103，广西南宁市邕江制药厂。
1.2 细菌内毒素工作标准品(CSE) 规格12 EU.支-1，批号9701，中国药品生物制品检定所。
1.3 鲎试剂(TAL)：批号960606，标示灵敏度(λ)0.06 EU.ml-1，规格0.1 ml.支-1；批号970904，λ值0.5 EU.支-1，规格0.1 ml.支-1；均为湛江安度斯生物有限公司提供。
1.4 细菌内毒素检查用水(WBET) 规格5 ml.支-1，批号970314，湛江安度斯生物有限公司。
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1.5 试验所用的注射器、针头、移液管、试管、烧杯等器具经250℃干烤1 h破坏细菌内毒素；除热原吸头、空安瓿由湛江安度斯生物有限公司提供。
1.6 热原用兔 新西兰大白兔，本所动物室提供，合格证号一桂医动字第11003号。
2 方法与结果
2.1 热原试验 参照《中国药典》1995年版二部“盐酸赖氨酸”热原检查项下的规定，用氯化钠注射液将样品稀释为22.5 mg.ml-1的溶液，按家兔体重每kg静脉注射10 ml给药，结果3批样品均符合规定。
2.2 TAL灵敏度复核 按《中国药典》1995年版二部规定的方法复核试验用TAL灵敏度，结果均符合规定(见表1)。
表1 鲎试剂灵敏度复核结果 TAL批号
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内毒素浓度(EU.ml-1)
阴性管
1.0
0.5
0.25
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2.3 LAS内毒素限值(L)的确定、安全系数(f)及干扰试验中稀释倍数(D)范围的计算
按公式L＝K.M-1计算[2]LAS的L值，K为临床无任何不良反应的细菌内毒素阈剂量，静脉注射的药品规定为5 EU.kg-1，M为LAS热原检查时家兔的给药剂量(0.225g.kg-1即相当LAS原液，0.75ml.kg-1)，经计算L值为6.67 EU.ml-1。从安全性及操作的方便性考虑，样品的L值定为6.0 EU.ml-1，此L值的安全系数f按公式f＝K.(L.M)-1计算[3]，M为人用的最大剂量(0.115 ml.kg-1)，K值、L值不变，则f＝7.2，通常f值取3～10可保证用药安全，故取6.0 EU.ml-1为其L值是安全的。常用TAL的λ值在0.03～1.0 EU.ml-1，按D＝L.λ-1计算[3]，样品的稀释倍数D＝6倍～200倍。
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2.4 干扰试验预试验 用WBET将LAS作系列稀释(LAS系列)；同时，每一稀释度下均制备含有2λ浓度细菌内毒素的盐酸赖氨酸溶液(ELAS系列)。用λ值为0.06 EU.ml-1的鲎试剂分别与两个系列的溶液进行反应，并作阳性对照(PC)和阴性对照(NC)，每一稀释度作2管，结果(见表2)。表2 LAS的干扰试验预试验结果 批号
LAS稀释倍数
NC
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从表2可见，所用的3批LAS在各个稀释度下均无可测出的细菌内毒素，说明可用于干扰试验[4]。预试结果表明，LAS对鲎试剂与细菌内毒素的反应有抑制作用，但稀释6倍以上时，其抑制作用有可能被排除。
2.5 干扰试验 参照《中国药典》1995年版二部的干扰试验方法进行试验。
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从预试验得知，LAS在稀释6倍以上时有可能排除干扰。以WBET及LAS的6倍稀释液(用WBET稀释而得，下同)分别将细菌内毒素工作标准品配成浓度为0.125 EU.ml-1、0.06 EU.ml-1、0.03 EU.ml-1及0.015 EU.ml-1的溶液(分别为WBET系列、LAS系列)，并设各系列本身的NC对照管。用同一批鲎试剂(λ为0.06 EU.ml-1)测定并比较同一批细菌内毒素工作标准品在两个系列溶液中的效价(Es及Et)，按公式：Et(或Es)＝1g-1(ΣX/4)进行计算，其中X为LAS系列或WBET系列各反应终点细菌内毒素浓度的对数值。结果表明，Es及Et均在0.5λ～2.0λ范围内，且Es/Et值均在0.5～2.0范围，说明LAS稀释6倍后，消除了其对鲎试剂与细菌内毒素反应的抑制作用。因此，确证LAS的最大无抑制浓度为其6倍稀释液(50mg.ml-1)(见表3)。表3 干扰试验结果 批号
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内毒素浓度(EU.ml-1)
NC
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0.125
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2.6 LAS的细菌内毒素检查 按《中国药典》1995年版二部细菌内毒素检查法进行检查，样品的稀释倍数按D＝L.λ-1计算，L值取6.0 EU.ml-1，用λ值为0.5 EU.ml-1的TAL进行检查，则样品应稀释12倍(25 mg.ml-1)。结果，3批样品均呈阴性反应。
3 小结 综上结果，广西南宁邕江制药厂提供的3批盐酸赖氨酸注射液参照《中国药典》1995年版二部“盐酸赖氨酸”项下检查热原，结果均符合规定。按现行版中国药典规定的盐酸赖氨酸热原检查给药量计算，确定样品的内毒素限值为6.0 EU.ml-1。3批样品对鲎试剂与细菌内毒素的反应均有抑制作用，但样品稀释6倍后即可消除此抑制作用，从而确证样品的最大无抑制浓度为50 mg.ml-1。3批样品的细菌内毒素检查与热原检查比较，未发现有漏检现象。表明盐酸赖氨酸注射液可用细菌内毒素检查法代替家兔法进行热原检查。 参考文献
[1]卫生部药典委员会.细菌内毒素检查法.中国药典1995年版二部.北京，化学工业出版社，广州：广东科技出版社，1995；附录76
[2]夏振民：药品细菌内毒素检查的限值药物分析杂志 1995；15(3)∶54
[3]黄清泉等：药品细菌内毒素检查的实验设计 中国药学杂志 1997；32(2)∶72
[4]Bacterial endotoxins test，USP-NF XⅢ.1995；1696, 百拇医药