静止悬浮液血球计数及分类仪的测量系统
作者：杨新慧 杨晔 张镇西 蒋大宗
单位：西安交通大学生物医学工程研究所 西安 710049
关键词：血细胞计数及分类；激光散射；数据采集
北京生物医学工程000207 摘 要 分析了血细胞计数分类技术，提出了静止悬浮液激光散射法血细胞计数分类的新方法，依据这种新方法设计了静止悬浮液激光散射法血球计数分类仪测量系统，着重介绍了系统的设计思想以及光路和数据采集系统。利用该系统对血液样品进行了测量并获得了较好的实验结果。
A Measuring System of an Instrument for Blood Cell Counting and Classification Using Stationary Suspension Fluid
Yang Xinhui, Yang Ye, Zhang Zhenxi, Jiang Dazong
, 百拇医药
(Institute of Biomedical Engineering,Xi'an Jiaotong University, 710049)
Abstract
In the paper is analysed the technolgical development of automatic blood cell counter,and is put for a new method to coun and classify blood cells using stationary suspension fluid and laser scattering.The measuring system of blood cells counting and classification is designed based on this method.The design idea of the light route and data acquisition system is provided in the paper as a key point,and satisfactory experimental results obtained are provided as well.
, 百拇医药
Key words:Blood cell counting and classification, Laser scattering,Data acquisition
0 引言
血细胞计数及分类技术是医学诊断最常用的基本方法，血细胞的自动计数和分类对减轻医生的劳动强度及诊断准确度都具有十分重要的意义。根据其原理结构，大致可分为：光学型、电阻抗型、光散射型三大类。光学型是利用细胞和稀释液对光的吸收强度的不同，来进行计数。由于此类型分析仪极易受外界环境干扰以及测试的不敏感而已被淘汰；电阻抗型是利用细胞通过微孔时电阻变化产生电流脉冲而计数。光散射型是指激光散射法血细胞计数分类仪，此类血细胞计数分类仪是利用细胞通过激光测定点时根据激光束射到被检物体后，被检物体内含量的不同其光散射不同的原理而计数，其中测出的红细胞内血红蛋白的差异如低色素、高色素等指标是用电阻法无法获得的，但此类型计数仪价格相当昂贵。
, 百拇医药
目前，国内大多数中小型医院由于经费限制仍然采用人工计数的最原始方法，即利用细胞计数板在显微镜下用人工的方法进行计数、分类、染色、辩形等。这种方法的工作量大，易使操作者疲劳而影响计数的准确。另外，电阻抗型和光散射型血球计数分类仪均采用流式结构，导致结构复杂而且测量速度受到一定限制。针对以上问题，我们在大量的实验基础上提出了静止悬浮快速血细胞计数分类测定的新方法。这种方法利用Mie散射理论通过测量静止悬浮的血细胞的散射光强，来一次得出细胞群的分布来。大量的实验结果表明，这种方法是行之有效的。
1 系统原理
利用均匀球模型[1]，可以说明细胞边缘的衍射和细胞表面的反射和折射，这种三维模型除了描述细胞的大小外，还可以反映细胞的平均折射率。在一定的边界条件下依据Mie理论[2]可对在平面单色光照射下的均匀球体求得严格数学解，适于任何直径和折射率大小的颗粒。依据Mie散射理论，在不相关单散射情况下，对细胞数目频率尺寸分布为f(D)的弥散细胞群体系，其散射光强是各单个细胞散射光强的线形迭加，即：
(1)
, 百拇医药
又因为细胞体积频率尺寸分布W(D)与f(D)存在以下关系：
将其代入(1)式得：
(2)
上式是一个第一类Fredholm积分方程，
是它的核函数。所求的细胞分布W(D)即为该方程的解函数。
假定细胞尺寸在[Dmin,Dmax]范围内，此外，径向散射光强也是在一定范围[θmin,θmax]内测量的。它取决于CCD光电探测阵列的径向测量范围[rmin,rmax]。其中θmin=rmin/f，θmax=rmax/f。式(2)中积分式可转换为求和形式：
(3)
, 百拇医药
式中Wj为直径为Dj的细胞所占的体积，M为细胞尺寸带的数目。L=(rmax-rmin)/Δr为光电探测器上探测单元的数目，Δr为光电探测器上各取样单元间的距离。上述表达式中，I0为一常数。由于对散射光强的实测值和计算值均采用归一化处理，且所求的尺寸分布用百分率表示，因此可令I0=1。这样式(3)可简单写作矩阵形式，即：
I=TW
式中I=(I1,I2,…,IL)T为光强分布列向量，W=(W1,W2,…,WM)T为尺寸分布列向量，而
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矩阵中T的各元素为
(4)
式(4)的物理意义为，直径为Dj的细胞所产生散射光落在CCD光电探测器距光轴ri处的单元上的光强。式(3)即为Mie散射理论计算细胞散射光强在CCD光电探测器上分布的计算公式。因此，只要光强分布系数矩阵T一旦求出，利用CCD光电探测器测出被测细胞产生的散射光的径向光强分布I，通过对线性方程组I=TW的合理求解就可求得细胞群的尺寸分布W。由这个原理就可进行各种血细胞的分类计数。
2 光路的设计
为了准确获得血细胞的径向散射光强分布，以便能从血细胞的散射光场信息中得出细胞的尺寸分布，需对整个系统精心设计以满足实验系统对光路严格的要求。测量装置如图1所示。
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图1 静止悬浮式激光散射法血球分类计数技术实验测量装置示意图
本实验装置光源采用波长0.6328nm的He-Ne激光器，输出功率为262mW。由扩束镜、针孔滤波器和准直镜构成的扩束—准直装置。样品池由石英玻璃制成，厚度应保证在实验中满足单散射条件。
对于血细胞，前向散射光强，尤其是中心光斑光强最强，沿中心向外光强减弱，并呈现明暗相间的条纹，因此CCD光电探测器接收的散射光强分布是不均匀的，测量中需对CCD光电探测阵列先进行光学对中(即使CCD光电探测阵列的像敏单元中心线与系统光轴在傅立叶变换物镜的后焦点处垂直相交。由于在CCD的动态范围内不能完整接收散射光强分布，而且光敏阵列的有效长度一定，从而不能同时实现对红细胞、白细胞和血小板的测量。为了解决上述问题，经过分析计算，我们采用了双孔对中板和CCD光电探测阵列组成的双探测器结构，即在CCD光电探测阵列上贴置一对中针孔板，在对中针孔板上开两个小孔，小孔中心分别距CCD第一有效像元1.456mm和9.456mm，分别对应测量红细胞、白细胞和血小板时的光学对中。在小孔后分别放置一硅光电池来接收散射光强分布的中心光强，当硅光电池接收到的光强最大时，则认为聚焦光斑在孔的中心，光学对中已完成。对中针孔板的两小孔的直径为400μm。小孔中心与CCD光电探测器阵列像敏元中心线对齐，误差在±10μm，如图2所示。
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图2 CCD+对中针孔板
的双探测器组件示意图
3 数据采集系统
该数据采集系统由探测头和数据采集卡两部分组成，结构框图如图3所示。鉴于CCD的光敏阵列具有恒定的几何尺寸和间隔及高的空间分辨率，适合于精确测量血细胞的径向散射光强，所以选用1024像元的线阵CCD与对中针孔板组成的双探测器来完成径向散射光场的扫描和光学对中。
图3 硬件的原理框图
3.1 探测头的设计
探测头由CCD及其驱动电路，对中放大电路，视频放大电路和高速ADC组成。本系统选用了东芝公司的1024像元线阵CCD-TCD132D。系统选用的ADC为AD7821，是美国AD公司的8位高速A/D转换器。AD7821有两种工作方式：WR-RD方式和RD方式，对应的转换时间分别为660ns和700ns，数据采集频率可高达1MHz。在RD方式下转换的启动和数据输出只需一个外部时序操作READ即可完成。为便于与CCD数据率同步，本系统使用的采样频率为750KHz。
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3.2 窗口控制电路
窗口控制电路是CCD视频信号采样极为关键的时序控制电路，由它发出的控制信号来证证ADC只对CCD有效像元的输出视频信号转换，同时控制数据缓存器将A/D转换的输出存入缓存器。这样，CCD、ADC和数据缓存器在时序上才能保持同步。
TCD132D的输出信号之前及之后，设置了66个被屏蔽的光电二极管，用来检测暗电流[3]。因此，我们设置计数器跳过前面63个检测点，只采样中间1024个有效像素，这就是点窗口。同样，还需要设置每次采样多少帧，及帧窗口。窗口控制电路还控制缓存器的地址发生器，启动和关闭以及写满缓存器后向主机发出中断申请信号。
据此要求，设计采用一片可编程定时/计数器8254和一组组合逻辑电路来实现采样窗口控制功能：8254的计数器0用于对要跳过的点计数，计数器1用于对有效像素的计数，计数器2用于对采样的帧进行计数。最后对每个计数器的计数完成信号进行逻辑组合，形成采样控制信号。8254的三个计数器工作方式均设定为方式1(可编程单稳态)，其逻辑时序图和窗口控制电路的电原理图如图4所示。其中ADEN是AD转换允许信号，由译码控制电路产生，SH是CCD移位时钟信号，RAMCLK是点计数信号，OUTO是8254计数器O的计数输出，OUT1是8254计数器1的计数输出，OUT2是8254计数器2的计数输出，SAMPLING作为向主机申请中断的中断申请信号[4]。
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图4 窗口控制时序图
3.3 数据缓存器电路
数据缓存器电路由数据缓存RAM和自动地址计数器组成。本系统选用美国IDT公司的2K×8高速双端口静态RAM-IDT7132，其数据存取仅55ns。双端口RAM是一种特殊类型的RAM。它具有两个独立的端口，各自均有一套相应的数据总线、地址总线和控制总线，允许两个端口独立、异步地对存储器中任何存储单元进行存取操作。
4 结果与讨论
用北京化工冶金研究所生产的血细胞标准微粒对本系统进行了标定，然后对血液样品进行实验测量。血液样品随机地取自在西安交通大不医院检验科验血的人，男女均等，为新鲜的指尖血。年龄在22～75岁之间。各种稀释液均采用本校医院目前所用稀释液，即红细胞胞稀释液：0.9%的氯化钠液体(生理盐水)。白细胞稀释液：3%的冰乙酸。为了便于比对，分别给出通过人工计数方法得到结果和利用本文所设计的测量系统得到的结果。
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下面是一例被试者(女性，年龄74岁)通过人工计数方法得到结果：
红细胞数：114万/mm3
淋巴细胞：27%
中性粒细胞：72%
单核细胞：1.0%。
利用本测量装置对红细胞、白细胞的测量结果如图5、图6。此被试者的红细胞平均直径为8.24大于正常值(提示被试者可能患有恶性贫血)。根据被试者尺寸分布的测量结果，得出其白细胞分类计数的结果为：淋巴细胞为25.4%，中性粒细胞为61.7%，中等大小细胞为12.8%。
图5 被试者2＃红细胞测量结果
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图6 被试者2＃白细胞测量结果
研究结果表明，本文的测量装置的准确性和重复性都较好，测量结果与细胞计数板法结果吻合较好。因此利用静止悬浮式激光散射法血球分类计数技术，可以测量血细胞的尺寸分布，并可对白细胞进行了三分类，还可测量单位体积中血细胞的数目，从而完成对血细胞的自动分类计数。
由以上讨论可知，静止悬浮式激光散射法血球分类计数技术具有较好前景。若经过进一步的工程开发(如选用半导体激光器作为光源)可以成为一台廉价实用的临床检验仪器。
基金项目：国家科学基金重点资助项目(批准文号 39630110)
作者简介：杨新慧(1972—)，男，西安交通大学生物医学工程研究所博士研究生。
参考文献
, http://www.100md.com
[1] Mullancy P F,et al.The small angle light scattering of biological cells.Biophys J,1970,10:764～768
[2] H C Van de Hulst.Light scattering by small particle.Wiley Press,New York,1981.
[3] 王庆有.CCD应用技术.第一版.天津：天津大学出版社，1993，P74～P75
[4] 张旭东.IBM微型机实用接口技术.第一版.北京：科学技术文献出版社，1993，P81～P96
(1999-03-29收稿), 百拇医药
单位：西安交通大学生物医学工程研究所 西安 710049
关键词：血细胞计数及分类；激光散射；数据采集
北京生物医学工程000207 摘 要 分析了血细胞计数分类技术，提出了静止悬浮液激光散射法血细胞计数分类的新方法，依据这种新方法设计了静止悬浮液激光散射法血球计数分类仪测量系统，着重介绍了系统的设计思想以及光路和数据采集系统。利用该系统对血液样品进行了测量并获得了较好的实验结果。
A Measuring System of an Instrument for Blood Cell Counting and Classification Using Stationary Suspension Fluid
Yang Xinhui, Yang Ye, Zhang Zhenxi, Jiang Dazong
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(Institute of Biomedical Engineering,Xi'an Jiaotong University, 710049)
Abstract
In the paper is analysed the technolgical development of automatic blood cell counter,and is put for a new method to coun and classify blood cells using stationary suspension fluid and laser scattering.The measuring system of blood cells counting and classification is designed based on this method.The design idea of the light route and data acquisition system is provided in the paper as a key point,and satisfactory experimental results obtained are provided as well.
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Key words:Blood cell counting and classification, Laser scattering,Data acquisition
0 引言
血细胞计数及分类技术是医学诊断最常用的基本方法，血细胞的自动计数和分类对减轻医生的劳动强度及诊断准确度都具有十分重要的意义。根据其原理结构，大致可分为：光学型、电阻抗型、光散射型三大类。光学型是利用细胞和稀释液对光的吸收强度的不同，来进行计数。由于此类型分析仪极易受外界环境干扰以及测试的不敏感而已被淘汰；电阻抗型是利用细胞通过微孔时电阻变化产生电流脉冲而计数。光散射型是指激光散射法血细胞计数分类仪，此类血细胞计数分类仪是利用细胞通过激光测定点时根据激光束射到被检物体后，被检物体内含量的不同其光散射不同的原理而计数，其中测出的红细胞内血红蛋白的差异如低色素、高色素等指标是用电阻法无法获得的，但此类型计数仪价格相当昂贵。
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目前，国内大多数中小型医院由于经费限制仍然采用人工计数的最原始方法，即利用细胞计数板在显微镜下用人工的方法进行计数、分类、染色、辩形等。这种方法的工作量大，易使操作者疲劳而影响计数的准确。另外，电阻抗型和光散射型血球计数分类仪均采用流式结构，导致结构复杂而且测量速度受到一定限制。针对以上问题，我们在大量的实验基础上提出了静止悬浮快速血细胞计数分类测定的新方法。这种方法利用Mie散射理论通过测量静止悬浮的血细胞的散射光强，来一次得出细胞群的分布来。大量的实验结果表明，这种方法是行之有效的。
1 系统原理
利用均匀球模型[1]，可以说明细胞边缘的衍射和细胞表面的反射和折射，这种三维模型除了描述细胞的大小外，还可以反映细胞的平均折射率。在一定的边界条件下依据Mie理论[2]可对在平面单色光照射下的均匀球体求得严格数学解，适于任何直径和折射率大小的颗粒。依据Mie散射理论，在不相关单散射情况下，对细胞数目频率尺寸分布为f(D)的弥散细胞群体系，其散射光强是各单个细胞散射光强的线形迭加，即：
(1), 百拇医药
又因为细胞体积频率尺寸分布W(D)与f(D)存在以下关系：
将其代入(1)式得：
(2)上式是一个第一类Fredholm积分方程，
是它的核函数。所求的细胞分布W(D)即为该方程的解函数。假定细胞尺寸在[Dmin,Dmax]范围内，此外，径向散射光强也是在一定范围[θmin,θmax]内测量的。它取决于CCD光电探测阵列的径向测量范围[rmin,rmax]。其中θmin=rmin/f，θmax=rmax/f。式(2)中积分式可转换为求和形式：
(3), 百拇医药
式中Wj为直径为Dj的细胞所占的体积，M为细胞尺寸带的数目。L=(rmax-rmin)/Δr为光电探测器上探测单元的数目，Δr为光电探测器上各取样单元间的距离。上述表达式中，I0为一常数。由于对散射光强的实测值和计算值均采用归一化处理，且所求的尺寸分布用百分率表示，因此可令I0=1。这样式(3)可简单写作矩阵形式，即：
I=TW
式中I=(I1,I2,…,IL)T为光强分布列向量，W=(W1,W2,…,WM)T为尺寸分布列向量，而
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矩阵中T的各元素为
(4)式(4)的物理意义为，直径为Dj的细胞所产生散射光落在CCD光电探测器距光轴ri处的单元上的光强。式(3)即为Mie散射理论计算细胞散射光强在CCD光电探测器上分布的计算公式。因此，只要光强分布系数矩阵T一旦求出，利用CCD光电探测器测出被测细胞产生的散射光的径向光强分布I，通过对线性方程组I=TW的合理求解就可求得细胞群的尺寸分布W。由这个原理就可进行各种血细胞的分类计数。
2 光路的设计
为了准确获得血细胞的径向散射光强分布，以便能从血细胞的散射光场信息中得出细胞的尺寸分布，需对整个系统精心设计以满足实验系统对光路严格的要求。测量装置如图1所示。
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图1 静止悬浮式激光散射法血球分类计数技术实验测量装置示意图
本实验装置光源采用波长0.6328nm的He-Ne激光器，输出功率为262mW。由扩束镜、针孔滤波器和准直镜构成的扩束—准直装置。样品池由石英玻璃制成，厚度应保证在实验中满足单散射条件。
对于血细胞，前向散射光强，尤其是中心光斑光强最强，沿中心向外光强减弱，并呈现明暗相间的条纹，因此CCD光电探测器接收的散射光强分布是不均匀的，测量中需对CCD光电探测阵列先进行光学对中(即使CCD光电探测阵列的像敏单元中心线与系统光轴在傅立叶变换物镜的后焦点处垂直相交。由于在CCD的动态范围内不能完整接收散射光强分布，而且光敏阵列的有效长度一定，从而不能同时实现对红细胞、白细胞和血小板的测量。为了解决上述问题，经过分析计算，我们采用了双孔对中板和CCD光电探测阵列组成的双探测器结构，即在CCD光电探测阵列上贴置一对中针孔板，在对中针孔板上开两个小孔，小孔中心分别距CCD第一有效像元1.456mm和9.456mm，分别对应测量红细胞、白细胞和血小板时的光学对中。在小孔后分别放置一硅光电池来接收散射光强分布的中心光强，当硅光电池接收到的光强最大时，则认为聚焦光斑在孔的中心，光学对中已完成。对中针孔板的两小孔的直径为400μm。小孔中心与CCD光电探测器阵列像敏元中心线对齐，误差在±10μm，如图2所示。
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图2 CCD+对中针孔板
的双探测器组件示意图
3 数据采集系统
该数据采集系统由探测头和数据采集卡两部分组成，结构框图如图3所示。鉴于CCD的光敏阵列具有恒定的几何尺寸和间隔及高的空间分辨率，适合于精确测量血细胞的径向散射光强，所以选用1024像元的线阵CCD与对中针孔板组成的双探测器来完成径向散射光场的扫描和光学对中。
图3 硬件的原理框图
3.1 探测头的设计
探测头由CCD及其驱动电路，对中放大电路，视频放大电路和高速ADC组成。本系统选用了东芝公司的1024像元线阵CCD-TCD132D。系统选用的ADC为AD7821，是美国AD公司的8位高速A/D转换器。AD7821有两种工作方式：WR-RD方式和RD方式，对应的转换时间分别为660ns和700ns，数据采集频率可高达1MHz。在RD方式下转换的启动和数据输出只需一个外部时序操作READ即可完成。为便于与CCD数据率同步，本系统使用的采样频率为750KHz。
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3.2 窗口控制电路
窗口控制电路是CCD视频信号采样极为关键的时序控制电路，由它发出的控制信号来证证ADC只对CCD有效像元的输出视频信号转换，同时控制数据缓存器将A/D转换的输出存入缓存器。这样，CCD、ADC和数据缓存器在时序上才能保持同步。
TCD132D的输出信号之前及之后，设置了66个被屏蔽的光电二极管，用来检测暗电流[3]。因此，我们设置计数器跳过前面63个检测点，只采样中间1024个有效像素，这就是点窗口。同样，还需要设置每次采样多少帧，及帧窗口。窗口控制电路还控制缓存器的地址发生器，启动和关闭以及写满缓存器后向主机发出中断申请信号。
据此要求，设计采用一片可编程定时/计数器8254和一组组合逻辑电路来实现采样窗口控制功能：8254的计数器0用于对要跳过的点计数，计数器1用于对有效像素的计数，计数器2用于对采样的帧进行计数。最后对每个计数器的计数完成信号进行逻辑组合，形成采样控制信号。8254的三个计数器工作方式均设定为方式1(可编程单稳态)，其逻辑时序图和窗口控制电路的电原理图如图4所示。其中ADEN是AD转换允许信号，由译码控制电路产生，SH是CCD移位时钟信号，RAMCLK是点计数信号，OUTO是8254计数器O的计数输出，OUT1是8254计数器1的计数输出，OUT2是8254计数器2的计数输出，SAMPLING作为向主机申请中断的中断申请信号[4]。
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图4 窗口控制时序图
3.3 数据缓存器电路
数据缓存器电路由数据缓存RAM和自动地址计数器组成。本系统选用美国IDT公司的2K×8高速双端口静态RAM-IDT7132，其数据存取仅55ns。双端口RAM是一种特殊类型的RAM。它具有两个独立的端口，各自均有一套相应的数据总线、地址总线和控制总线，允许两个端口独立、异步地对存储器中任何存储单元进行存取操作。
4 结果与讨论
用北京化工冶金研究所生产的血细胞标准微粒对本系统进行了标定，然后对血液样品进行实验测量。血液样品随机地取自在西安交通大不医院检验科验血的人，男女均等，为新鲜的指尖血。年龄在22～75岁之间。各种稀释液均采用本校医院目前所用稀释液，即红细胞胞稀释液：0.9%的氯化钠液体(生理盐水)。白细胞稀释液：3%的冰乙酸。为了便于比对，分别给出通过人工计数方法得到结果和利用本文所设计的测量系统得到的结果。
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下面是一例被试者(女性，年龄74岁)通过人工计数方法得到结果：
红细胞数：114万/mm3
淋巴细胞：27%
中性粒细胞：72%
单核细胞：1.0%。
利用本测量装置对红细胞、白细胞的测量结果如图5、图6。此被试者的红细胞平均直径为8.24大于正常值(提示被试者可能患有恶性贫血)。根据被试者尺寸分布的测量结果，得出其白细胞分类计数的结果为：淋巴细胞为25.4%，中性粒细胞为61.7%，中等大小细胞为12.8%。
图5 被试者2＃红细胞测量结果
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图6 被试者2＃白细胞测量结果
研究结果表明，本文的测量装置的准确性和重复性都较好，测量结果与细胞计数板法结果吻合较好。因此利用静止悬浮式激光散射法血球分类计数技术，可以测量血细胞的尺寸分布，并可对白细胞进行了三分类，还可测量单位体积中血细胞的数目，从而完成对血细胞的自动分类计数。
由以上讨论可知，静止悬浮式激光散射法血球分类计数技术具有较好前景。若经过进一步的工程开发(如选用半导体激光器作为光源)可以成为一台廉价实用的临床检验仪器。
基金项目：国家科学基金重点资助项目(批准文号 39630110)
作者简介：杨新慧(1972—)，男，西安交通大学生物医学工程研究所博士研究生。
参考文献
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[1] Mullancy P F,et al.The small angle light scattering of biological cells.Biophys J,1970,10:764～768
[2] H C Van de Hulst.Light scattering by small particle.Wiley Press,New York,1981.
[3] 王庆有.CCD应用技术.第一版.天津：天津大学出版社，1993，P74～P75
[4] 张旭东.IBM微型机实用接口技术.第一版.北京：科学技术文献出版社，1993，P81～P96
(1999-03-29收稿), 百拇医药