端粒酶活性在非小细胞肺癌中表达的初步研究
作者：陈鲁琦 王苏芝 陈鲁豫 王旻 张阳 李建端
单位：陈鲁琦(450003 郑州，河南省胸科医院)；王苏芝(河南省卫生职工医学院)；陈鲁豫(河南省平顶山市第一人民医院)；王旻(河南省卫生防疫站)；张阳，李建端(河南省医科大学基础部)
关键词：
中华医学遗传学杂志990221 端粒酶是当前肿瘤学领域的研究热点，大量的研究表明端粒酶与肿瘤细胞的无限增殖能力密切相关。但对于肺癌的报道较少，我们采用端粒重复片段扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)结合银染技术对中国河南地区散在性非小细胞肺癌(NSCLC)中端粒酶活性表达情况进行了初步的研究[1]，以探讨其在肺癌发生发展中的意义。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本 65份不同肺组织样本取自我院1996年～1997年新鲜手术切除标本，取材后速置液氮中保存。65份肺组织包括30例原发性肺癌肿瘤组织及其癌旁的正常组织，5例非肿瘤手术患者的正常肺组织。所有标本均经病理证实。
1.2 端粒酶活性测定 按Kim等所述方法稍有改动。肺组织用500μl预冷冻洗液冲洗(10mmol/L Tris HCl，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L KCl, 1mmol/L BME)离心1次，200μl预冷裂解液(10mmol/L Tris HCl，1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA，0.5% CHAPS，5mmol/L BME, 10%甘油，0.1mmol/L PMSF)加入，匀浆器匀浆(4℃，450r/min，1分钟)，0℃孵化30分钟，离心吸取上清(组织提取液)，将提取液行蛋白浓度测定后稀释至3μg/μl。采用TRAP法检测端粒酶活性。PCR反应体积50μl，反应体系含组织提取液2μl，5μl 500μmol/L 4×dNTP，10×PCR缓冲液，0.1μg TS引物(5′-AATCCGTCGA-GCAGAGTT-3′)，混匀后预热至90℃，迅速加入0.1μg Cx引物(5′-CCCTTACCC-TTACCCTTACCCTAA-3′)，3U TaqDNA聚合酶，置PCR仪上进行31个循环。加入电泳加样缓冲液1μl，在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。
, 百拇医药
1.3 银染 取下凝胶置于10%乙醇中固定5分钟，双蒸水漂洗2次，1%硝酸固定5分钟，双蒸水漂洗2次，500ml 0.1%硝酸银染液染色10分钟，双蒸水漂洗2次，显色液(0.28mol/L碳酸钠，0.1%甲醛，0.1mg/ml硫代硫酸钠)显色3～6分钟，双蒸水漂洗2次，10%乙酸固定终止反应，双蒸水漂洗2次，照像并记录结果。
1.4 统计学方法 采用χ2检验。
2 结果
2.1 NSCLC组织及其癌旁组织中端粒酶活性表达情况 由表1可见肺癌组织端粒酶活性阳性表达，癌旁正常肺组织端粒酶活性无表达。NSCLC组织及其癌旁组织两组间相比差异有显著性(P<0.05)。同时所测的5例正常肺组织标本端粒酶活性表达阴性。
表1 端粒酶活性在30例NSCLC组织中的表达 组别
, 百拇医药
例数
端粒酶活性(+)
例数
(%)
NSCLC
30
25
83
癌旁组织
30
0
100
合计
, 百拇医药
60
25
2.2 端粒酶活性与临床病理参数关系 根据肺癌组织的分化程度、肿瘤大小、淋巴结有无转移和不同的临床病理分期进行分组，各组端粒酶活性表达情况见表2。表2 端粒酶活性与临床病理参数关系 临床病理参数
例数
端 粒 酶 活 性 (+)
例数
(%)
分化程度
高分化
5
3
, http://www.100md.com
60.0
中分化
15
13
86.7
低分化
10
9
90.0
肿瘤大小
<3cm
13
11
, http://www.100md.com
84.6
≥3cm
17
14
82.4
淋巴结转移
无转移
11
8
72.7
有转移
19
17
, http://www.100md.com
89.5
临床分期
Ⅰ、Ⅱ期
16
12
75.0
Ⅲ、Ⅳ期
14
13
92.9
组织类型
鳞癌
13
, 百拇医药
11
85.6
腺癌
17
14
82.4
3 讨论
端粒酶是一种核糖核蛋白体，主要存在于人体生殖细胞、永生化细胞及肿瘤细胞中，以独特的反转录形式合成染色体末端的端粒。端粒是真核细胞染色体末端的多个重复序列(TTAGGG)和相关蛋白质组成，这一结构在染色体复制及保持染色体稳定中起重要作用。研究表明人类体细胞端粒DNA长度随细胞分裂及年龄增长而逐渐缩短，端粒酶则能重新填补染色体末端已缩短的端粒。早在1990年Harley等[2]就在研究中指出，端粒酶活化是细胞获得不死性的必需途径，而获得不死性是肿瘤恶变的重要一环。以往受方法学的限制，仅能在少数几种恶性肿瘤组织中测得端粒酶活性，直到1994年Kim等率先创立了TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性主要存在于大多数恶性肿瘤组织中，人体正常组织细胞中未见有端粒酶活性。
, 百拇医药
我们分析了30例NSCLC患者的端粒酶活化的表达状态，从结果可以看出，端粒酶活化阳性表达在正常肺组织中并不存在，在肿瘤患者中端粒酶活化阳性表达仅存在于肿瘤组织中，而不存在于正常组织中。因此，我们认为在所研究的病例中，端粒酶活化是一种局部组织的获得性变化。从肿瘤发生的理论上看，其中一种理论认为癌发生是细胞转化的过程，而细胞转化是由于终末分化途径中的一种异常，即正常细胞最终分化为不分裂状态，癌细胞则逃脱此命运而继续增殖[3]。本实验结果，肺肿瘤组织中存在端粒酶活性，占总人数的83%(25/30)。这些具有端粒酶活化的细胞已超过了细胞分裂周期的M1(老化期)和M2(危机期)，在端粒酶的反转录过程中端粒长度可保持稳定，从而具有了稳定的繁殖能力，获得了永生化转化，发展成为具有无限增殖力的肿瘤细胞。
从端粒酶活化的性质上看，端粒酶活化表达仅在增殖细胞中，而非癌细胞中，不具备端粒酶活性。Greider等[4]证明，端粒酶RNA中存在有一段端粒重复片段序列引物位于其43～51位序列的CAACCCCAA，刚好编码端粒DNA重复片段GGGGTT，如果端粒酶RNA在该区域发生突变，合成的端粒序列中亦有相应的变化。由于端粒酶与端粒独特的反转录形式，因此，所测得端粒酶活性的体细胞可认为是具有无限增殖能力的细胞。Hiyama等[5]的研究表明，肿瘤细胞中的濒死性细胞端粒酶活性不表达，在他们所测得标本中若濒死性细胞比率较增殖细胞高时，端粒酶活性不表达，并指出端粒酶活性在某些肿瘤中的低表达或不表达可能是由于那些濒死性细胞存在的结果。我们的研究中存在5例肺癌组织标本端粒酶活性不表达，是否由于标本中濒死性细胞比率较高，因未做进一步的研究尚不能定论。
, http://www.100md.com
在端粒酶活化阳性表达与NSCLC患者的病理参数关系的研究中，发现端粒酶活性阳性表达与肺癌的肿瘤大小、淋巴结转移、病理学临床分期、组织学分级相关，肿瘤大、有淋巴结转移、Ⅲ、Ⅳ病期、低分化者端粒酶活性阳性表达者高。Tahara等[6]和Hiyama等[7]在对胃癌患者的研究发现，端粒酶阳性者其病灶较阴性者大，淋巴结转移率也大于后者，并且其术后预后状况较差。这提示了端粒酶阳性表达者预后较差，因此端粒酶活性的分析对判断肿瘤患者的存活率有重要意义。
肺癌乃至所有肿瘤治疗都不十分令人满意，肿瘤的生物治疗目前研究十分活跃。端粒酶是一个常见的在肿瘤细胞中被激活的基因，已有实验证明，将部分反义端粒酶RNA介入培养的肿瘤细胞株中，能抑制或杀死肿瘤细胞[8]。这些结果显示出了基因治疗肿瘤的潜在价值。虽然我们的实验表明端粒酶活性在中国人非小细胞肺癌组织中广泛存在，但为实现基因分析的早期诊断及治疗肺癌的目标，还需做进一步的研究。
, http://www.100md.com
本项目由河南省科委(981170211)资助
参考文献
[1] Kim NW, Pjatyszek MA, Prouse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266∶2011-2015.
[2] Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature, 1990,345∶458-460.
[3] Iman DS, Harris CC. Oncogene and suppressor genes in human lung carcinogenesis. Crit Rev Oncogenesis, 1991,2∶161-171.
, 百拇医药
[4] Greider CW, Blackburn EH. A telomeric sequence in the RNA of tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature, 1989,337∶331-337.
[5] Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small cell and non-small cell lung cancers. Cancer, 1995,87∶895.
[6] Tahara H, Kuniyasu H, Yasui W, et al. Telomerase activity in preneoplastic and neoplestic gastric and colorectal lesion. Clin Cancer Res, 1995,1∶1245-1251.
[7] Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto M, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995,55∶3258-3262.
[8] Feng J, Funk WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. Science, 1995,269∶1236-1241.
(收稿：1998-04-04 修回：1998-11-06), 百拇医药
单位：陈鲁琦(450003 郑州，河南省胸科医院)；王苏芝(河南省卫生职工医学院)；陈鲁豫(河南省平顶山市第一人民医院)；王旻(河南省卫生防疫站)；张阳，李建端(河南省医科大学基础部)
关键词：
中华医学遗传学杂志990221 端粒酶是当前肿瘤学领域的研究热点，大量的研究表明端粒酶与肿瘤细胞的无限增殖能力密切相关。但对于肺癌的报道较少，我们采用端粒重复片段扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)结合银染技术对中国河南地区散在性非小细胞肺癌(NSCLC)中端粒酶活性表达情况进行了初步的研究[1]，以探讨其在肺癌发生发展中的意义。
1 材料和方法
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1.1 标本 65份不同肺组织样本取自我院1996年～1997年新鲜手术切除标本，取材后速置液氮中保存。65份肺组织包括30例原发性肺癌肿瘤组织及其癌旁的正常组织，5例非肿瘤手术患者的正常肺组织。所有标本均经病理证实。
1.2 端粒酶活性测定 按Kim等所述方法稍有改动。肺组织用500μl预冷冻洗液冲洗(10mmol/L Tris HCl，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L KCl, 1mmol/L BME)离心1次，200μl预冷裂解液(10mmol/L Tris HCl，1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA，0.5% CHAPS，5mmol/L BME, 10%甘油，0.1mmol/L PMSF)加入，匀浆器匀浆(4℃，450r/min，1分钟)，0℃孵化30分钟，离心吸取上清(组织提取液)，将提取液行蛋白浓度测定后稀释至3μg/μl。采用TRAP法检测端粒酶活性。PCR反应体积50μl，反应体系含组织提取液2μl，5μl 500μmol/L 4×dNTP，10×PCR缓冲液，0.1μg TS引物(5′-AATCCGTCGA-GCAGAGTT-3′)，混匀后预热至90℃，迅速加入0.1μg Cx引物(5′-CCCTTACCC-TTACCCTTACCCTAA-3′)，3U TaqDNA聚合酶，置PCR仪上进行31个循环。加入电泳加样缓冲液1μl，在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。
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1.3 银染 取下凝胶置于10%乙醇中固定5分钟，双蒸水漂洗2次，1%硝酸固定5分钟，双蒸水漂洗2次，500ml 0.1%硝酸银染液染色10分钟，双蒸水漂洗2次，显色液(0.28mol/L碳酸钠，0.1%甲醛，0.1mg/ml硫代硫酸钠)显色3～6分钟，双蒸水漂洗2次，10%乙酸固定终止反应，双蒸水漂洗2次，照像并记录结果。
1.4 统计学方法 采用χ2检验。
2 结果
2.1 NSCLC组织及其癌旁组织中端粒酶活性表达情况 由表1可见肺癌组织端粒酶活性阳性表达，癌旁正常肺组织端粒酶活性无表达。NSCLC组织及其癌旁组织两组间相比差异有显著性(P<0.05)。同时所测的5例正常肺组织标本端粒酶活性表达阴性。
表1 端粒酶活性在30例NSCLC组织中的表达 组别
, 百拇医药
例数
端粒酶活性(+)
例数
(%)
NSCLC
30
25
83
癌旁组织
30
0
100
合计
, 百拇医药
60
25
2.2 端粒酶活性与临床病理参数关系 根据肺癌组织的分化程度、肿瘤大小、淋巴结有无转移和不同的临床病理分期进行分组，各组端粒酶活性表达情况见表2。表2 端粒酶活性与临床病理参数关系 临床病理参数
例数
端 粒 酶 活 性 (+)
例数
(%)
分化程度
高分化
5
3
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60.0
中分化
15
13
86.7
低分化
10
9
90.0
肿瘤大小
<3cm
13
11
, http://www.100md.com
84.6
≥3cm
17
14
82.4
淋巴结转移
无转移
11
8
72.7
有转移
19
17
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89.5
临床分期
Ⅰ、Ⅱ期
16
12
75.0
Ⅲ、Ⅳ期
14
13
92.9
组织类型
鳞癌
13
, 百拇医药
11
85.6
腺癌
17
14
82.4
3 讨论
端粒酶是一种核糖核蛋白体，主要存在于人体生殖细胞、永生化细胞及肿瘤细胞中，以独特的反转录形式合成染色体末端的端粒。端粒是真核细胞染色体末端的多个重复序列(TTAGGG)和相关蛋白质组成，这一结构在染色体复制及保持染色体稳定中起重要作用。研究表明人类体细胞端粒DNA长度随细胞分裂及年龄增长而逐渐缩短，端粒酶则能重新填补染色体末端已缩短的端粒。早在1990年Harley等[2]就在研究中指出，端粒酶活化是细胞获得不死性的必需途径，而获得不死性是肿瘤恶变的重要一环。以往受方法学的限制，仅能在少数几种恶性肿瘤组织中测得端粒酶活性，直到1994年Kim等率先创立了TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性主要存在于大多数恶性肿瘤组织中，人体正常组织细胞中未见有端粒酶活性。
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我们分析了30例NSCLC患者的端粒酶活化的表达状态，从结果可以看出，端粒酶活化阳性表达在正常肺组织中并不存在，在肿瘤患者中端粒酶活化阳性表达仅存在于肿瘤组织中，而不存在于正常组织中。因此，我们认为在所研究的病例中，端粒酶活化是一种局部组织的获得性变化。从肿瘤发生的理论上看，其中一种理论认为癌发生是细胞转化的过程，而细胞转化是由于终末分化途径中的一种异常，即正常细胞最终分化为不分裂状态，癌细胞则逃脱此命运而继续增殖[3]。本实验结果，肺肿瘤组织中存在端粒酶活性，占总人数的83%(25/30)。这些具有端粒酶活化的细胞已超过了细胞分裂周期的M1(老化期)和M2(危机期)，在端粒酶的反转录过程中端粒长度可保持稳定，从而具有了稳定的繁殖能力，获得了永生化转化，发展成为具有无限增殖力的肿瘤细胞。
从端粒酶活化的性质上看，端粒酶活化表达仅在增殖细胞中，而非癌细胞中，不具备端粒酶活性。Greider等[4]证明，端粒酶RNA中存在有一段端粒重复片段序列引物位于其43～51位序列的CAACCCCAA，刚好编码端粒DNA重复片段GGGGTT，如果端粒酶RNA在该区域发生突变，合成的端粒序列中亦有相应的变化。由于端粒酶与端粒独特的反转录形式，因此，所测得端粒酶活性的体细胞可认为是具有无限增殖能力的细胞。Hiyama等[5]的研究表明，肿瘤细胞中的濒死性细胞端粒酶活性不表达，在他们所测得标本中若濒死性细胞比率较增殖细胞高时，端粒酶活性不表达，并指出端粒酶活性在某些肿瘤中的低表达或不表达可能是由于那些濒死性细胞存在的结果。我们的研究中存在5例肺癌组织标本端粒酶活性不表达，是否由于标本中濒死性细胞比率较高，因未做进一步的研究尚不能定论。
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在端粒酶活化阳性表达与NSCLC患者的病理参数关系的研究中，发现端粒酶活性阳性表达与肺癌的肿瘤大小、淋巴结转移、病理学临床分期、组织学分级相关，肿瘤大、有淋巴结转移、Ⅲ、Ⅳ病期、低分化者端粒酶活性阳性表达者高。Tahara等[6]和Hiyama等[7]在对胃癌患者的研究发现，端粒酶阳性者其病灶较阴性者大，淋巴结转移率也大于后者，并且其术后预后状况较差。这提示了端粒酶阳性表达者预后较差，因此端粒酶活性的分析对判断肿瘤患者的存活率有重要意义。
肺癌乃至所有肿瘤治疗都不十分令人满意，肿瘤的生物治疗目前研究十分活跃。端粒酶是一个常见的在肿瘤细胞中被激活的基因，已有实验证明，将部分反义端粒酶RNA介入培养的肿瘤细胞株中，能抑制或杀死肿瘤细胞[8]。这些结果显示出了基因治疗肿瘤的潜在价值。虽然我们的实验表明端粒酶活性在中国人非小细胞肺癌组织中广泛存在，但为实现基因分析的早期诊断及治疗肺癌的目标，还需做进一步的研究。
, http://www.100md.com
本项目由河南省科委(981170211)资助
参考文献
[1] Kim NW, Pjatyszek MA, Prouse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266∶2011-2015.
[2] Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature, 1990,345∶458-460.
[3] Iman DS, Harris CC. Oncogene and suppressor genes in human lung carcinogenesis. Crit Rev Oncogenesis, 1991,2∶161-171.
, 百拇医药
[4] Greider CW, Blackburn EH. A telomeric sequence in the RNA of tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature, 1989,337∶331-337.
[5] Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small cell and non-small cell lung cancers. Cancer, 1995,87∶895.
[6] Tahara H, Kuniyasu H, Yasui W, et al. Telomerase activity in preneoplastic and neoplestic gastric and colorectal lesion. Clin Cancer Res, 1995,1∶1245-1251.
[7] Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto M, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995,55∶3258-3262.
[8] Feng J, Funk WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. Science, 1995,269∶1236-1241.
(收稿：1998-04-04 修回：1998-11-06), 百拇医药