脊髓性肌萎缩患儿的NAIP基因分析
作者：麻宏伟 王阳 宓真 武盈玉 赵颇 赵淑霞 姜梅 李永昕
单位：麻宏伟 王阳 宓真 武盈玉 赵颇 赵淑霞 姜梅(110003沈阳，中国医科大学第二临床学院遗传室)；李永昕(辽宁省抚顺总矿物局总医院)
关键词：脊髓性肌萎缩；神经原性细胞凋亡抑制蛋白基因；基因缺失
中华医学遗传学杂志990210 【摘要】 目的 探讨脊髓性肌萎缩的基因型与临床表型(survival motor neurone,SMN)的关系。方法 应用PCR技术对13例运动神经元型基因缺失的脊髓性肌萎缩患儿进一步进行神经原性细胞凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein NAIP)基因分析(Ⅰ型5例，Ⅱ型4例，Ⅲ型4例)。结果 2例Ⅰ型患儿携有NAIP基因缺失(2/5，40%)。结论 NAIP基因缺失可能与脊髓性肌萎缩的临床表型严重程度有关。
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Study of NAIP gene in spinal muscular atrophy
MA Hongwei*, WANG Yang, MI Zhen, WU Yingyu,ZHAO Po, ZHAO Shuxia, JIANG Mei, LI Yongxin
*The Second Hospital, China Medical University, Shenyang,110003 P.R. China E-mail:cmu2hosp@iris. cmu.deu.cn
【Abstract】 Objective Investigating the correlation between the genotype and spinal muscular atrophy(SMA) clinical phenotype. Methods Neuronal apoptosis inhibitory protein(NAIP) gene analysis was performed by PCR amplification of exon 5 in 13 unrelated SMA patients with deletions of SMN gene.Results Two Type-Ⅰ patients(2/5,40%) lacked the NAIP exon 5.Conclusion The results suggest a possible correlation between NAIP gene deletion and the disease severity of SMA.
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【Key words】 Spinal muscular atrophy Neuronal apoptosis inhibitory protein Gene deletion
脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)是以脊髓前角细胞变性为特征的遗传性神经肌肉疾病。其主要表现为进行性肌无力和肌萎缩。本病为常染色体隐性遗传,发病率为1/600～1/
1000[1]。根据发病年龄和进展速度不同，分为3个亚型。现已报道该病的2个候选基因，一个是存活的运动神经元(survival motor neurone, SMN)基因，另一个是神经原性细胞凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein, NAIP)基因[1-3]。近年来，国外对SMA患者这两个基因进行了分析，发现SMN基因的缺失频率很高，表明SMN基因缺失可能直接涉及本病，但是SMN基因缺失并不与疾病的严重程度有关；而NAIP基因缺失常发生于Ⅰ型患者，表明NAIP基因缺失可能与疾病的严重程度相关[4]。我们[5，6]以及国内其他学者[7，8]已经对SMN基因作了有关研究。现将我们的结果报告如下。
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1 对象与方法
1.1 对象 13例SMA患儿均来自1995年以来我院遗传咨询门诊病例。按照Melki SMA诊断分型标准，5例患儿诊断为Ⅰ型，4例诊断为Ⅱ型，另外4例为Ⅲ型。其父母表型均正常。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用酚-氯仿方法提取外周静脉血白细胞DNA。
1.2.2 PCR引物 扩增NAIP基因第5外显子的引物及内对照引物(NAIP基因第13外显子)参考Roy
等[2]的设计，引物分别位于NAIP基因第5和第13外显子内，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。扩增NAIP基因第5外显子的引物为：1863，CTCTCA-GCCTGCTCTTCAGAT；1864，AAAGCCTCTGA-CGAGAGGATC，扩增片段为435bp。内对照引物为：1258，ATGCTTGGATCTCTAGAATGG；1343，CC-AGCTCCTAGAGAAAGAAGGA，扩增片段为241bp。
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1.2.3 PCR反应条件 反应体系为50μl，内含10×5μl Buffer,4×2μl dNTP(5mmol/L)，Mg2+ 1.5μl(25mmol/L)，引物各2.5μl(10pmol/μl)，基因组DNA 1μl(100ng/μl)，反应混合物先经95℃变性1分钟，再加入Taq聚合物0.15U，DNA热循环(TC-美国PE公司)，循环过程为94℃60秒，60℃ 60秒，72℃90秒，共30个循环，72℃延伸10分钟。
1.2.4 电泳 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，时间约1小时，0.5μg/ml溴化乙啶(EB)染色后，紫外灯下观察结果，照相。
2 结果
两对引物扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示出435bp和241bp两条扩增带(图1的2)。435bp扩增带是NAIP第5外显子扩增带，241bp扩增带是内对照扩增带。2例Ⅰ型患儿无NAIP基因第5外显子435bp扩增带(图1的3，4)。
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图1 NAIP基因第5外显子PCR扩增产物电泳图 1.Marker Ⅷ；2.正常对照；3、4.患儿；435bp为第5外显子扩增片段；241bp为内对照扩增片段
Fig 1 Result of PCR amplification of exon 5 Lane 1:marker Ⅷ; Lane 2:normal individual;Lanes 3,4:SMA patients; 435bp:fragment of exon 5; 241bp:fragment of internal control
3 讨论
根据发病年龄和进展速度不同，Melki[9，10]将脊髓性肌萎缩分为3型：Ⅰ型为急性婴儿型(Werding-Hoffmann disease)，发病年龄均在1岁内，病情进展迅速，常由于呼吸肌功能障碍引起肺部感染一般在1～2岁内死亡。Ⅱ型为中间型，发病年龄在1岁左右，病情进展相对比较慢，躯干肌无力不严重，头能直立，能坐，但不能站与走，可以活到少年期，甚至活到成年，但可发生脊柱变形。Ⅲ型为少年型(Kugeblerg-Welander syndrome)，一般在1岁以后发病，病情进展较慢，也可在3～4岁后病情不继续加重。根据上述标准，13例中，5例诊断为Ⅰ型，4例为Ⅱ型，4例为Ⅲ型。以前经SMN基因分析均显示出第7外显子缺失。实际上，在SMA基因定位区域内(5q12-q14)，有2个基因与SMA有关，一个是SMN基因，另一个是NAIP基因，NAIP基因位于SMN基因的远端，其中SMN基因被认为是决定性基因，约98.6%的SMA患者显示该基因突变[1]，而NAIP基因可能与SMA的表型有关，临床表型重的Ⅰ型患者NAIP基因缺失的频率(45%)比临床表型轻的Ⅱ、Ⅲ型患者(18%)高[1，11]。我们的研究结果也支持这一点。2例NAIP基因缺失的标本均为临床诊断为Ⅰ型的SMA患儿(2/5，40%)，尚未在正常人(50例)以及Ⅱ型和Ⅲ型的患者中检测到NAIP基因缺失。结果表明NAIP基因也涉及SMA的发病机理，至少说明临床表现轻重的部分原因与基因缺失大小有关，缺失范围大，涉及到了NAIP基因，临床表型则重；缺失范围小，仅为单独的SMN基因缺失，临床表现轻。最近Burler等[4]进行了大样本研究，对106名法国SMA患者NAIP基因缺失分析表明：Ⅰ型占66%(29/44)；Ⅱ型占6.5%(2/31)；Ⅲ型占13%(4/31)。台湾地区也曾对当地42名SMA患者(Ⅰ型10例，Ⅱ型21例，Ⅲ型11例)进行了NAIP基因分析，未发现任何异常[12]，说明还有其它因素影响SMA的临床表现，如5q21-q14区域的多态性，基因的拷贝数目等。本研究结果提示，伴有或不伴有NAIP基因缺失与SMA表型有关，NAIP基因的研究有助于对预后的估计。进一步的基因分析及大样本研究将有助于解释临床表型的差异。
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本课题为卫生部基金(96Q-040)和国家教委基金(436)资助
参考文献
[1] Letebvre S, Burglel L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell, 1995, 80(1)∶155-165.
[2] Roy N, Mahadevan MS, Mclean M, et al. The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy. Cell, 1995, 80(1)∶167-178.
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[3] Lewin B. Gene for SMA: mutation in parvo. Cell, 1995, 80(1)∶1-5.
[4] Burle P, Burglen L, Clermont O, et al. Large scale deletions of the 5q13 region are specific to Werding-Hoffmann disease. J Med Genet, 1996, 33(4)∶281-283.
[5] 麻宏伟，王阳，宓真，等.进行性脊髓性肌萎缩症的临床和基因研究.中华神经科杂志，1998，31(1)∶10.
[6] 王阳，麻宏伟，宓真，等.一种脊髓性肌萎缩快速简便的基因诊断方法.中华医学遗传学杂志，1997，14(6)∶384-385.
[7] 袁丽芳，刘天慈，杨涛，等.儿童期脊肌萎缩症的基因诊断及产前基因诊断.中华儿科杂志，1997，35(12)∶631-634.
, 百拇医药
[8] 刘天慈，吴沪生，袁丽芳，等.脊肌萎缩症临床及基因诊断研究.中国实用儿科杂志，1998，13(1)∶15-16.
[9] Melki J, Abdelhak S, Sheth P, et al. Gene for proximal spinal muscular atrophies maps to chromosome 5q. Nature, 1990, 344(6268)∶767-768.
[10] Melki J, Sheth P, Abdelhak S, et al. Mapping of acute (type Ⅰ) spinal muscular atrophy to chromosome 5q12-q14.Lancet, 1990, 336(8710)∶271-273.
[11] Mahadavan MS, Korneluk RG, Roy N, et al. SMA genes:deleted and duplicated. Nature Genet, 1995, 9(2)∶112-113.
[12] Chang JG, Jong YJ, Huang JM, et al. Molecular basis of spinal muscular atrophy in Chinese. Am J Hum Genet, 1995, 57(6)∶1503-1505.
(收稿：1998-04-21 修回：1998-08-27), http://www.100md.com
单位：麻宏伟 王阳 宓真 武盈玉 赵颇 赵淑霞 姜梅(110003沈阳，中国医科大学第二临床学院遗传室)；李永昕(辽宁省抚顺总矿物局总医院)
关键词：脊髓性肌萎缩；神经原性细胞凋亡抑制蛋白基因；基因缺失
中华医学遗传学杂志990210 【摘要】 目的 探讨脊髓性肌萎缩的基因型与临床表型(survival motor neurone,SMN)的关系。方法 应用PCR技术对13例运动神经元型基因缺失的脊髓性肌萎缩患儿进一步进行神经原性细胞凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein NAIP)基因分析(Ⅰ型5例，Ⅱ型4例，Ⅲ型4例)。结果 2例Ⅰ型患儿携有NAIP基因缺失(2/5，40%)。结论 NAIP基因缺失可能与脊髓性肌萎缩的临床表型严重程度有关。
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Study of NAIP gene in spinal muscular atrophy
MA Hongwei*, WANG Yang, MI Zhen, WU Yingyu,ZHAO Po, ZHAO Shuxia, JIANG Mei, LI Yongxin
*The Second Hospital, China Medical University, Shenyang,110003 P.R. China E-mail:cmu2hosp@iris. cmu.deu.cn
【Abstract】 Objective Investigating the correlation between the genotype and spinal muscular atrophy(SMA) clinical phenotype. Methods Neuronal apoptosis inhibitory protein(NAIP) gene analysis was performed by PCR amplification of exon 5 in 13 unrelated SMA patients with deletions of SMN gene.Results Two Type-Ⅰ patients(2/5,40%) lacked the NAIP exon 5.Conclusion The results suggest a possible correlation between NAIP gene deletion and the disease severity of SMA.
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【Key words】 Spinal muscular atrophy Neuronal apoptosis inhibitory protein Gene deletion
脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)是以脊髓前角细胞变性为特征的遗传性神经肌肉疾病。其主要表现为进行性肌无力和肌萎缩。本病为常染色体隐性遗传,发病率为1/600～1/
1000[1]。根据发病年龄和进展速度不同，分为3个亚型。现已报道该病的2个候选基因，一个是存活的运动神经元(survival motor neurone, SMN)基因，另一个是神经原性细胞凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein, NAIP)基因[1-3]。近年来，国外对SMA患者这两个基因进行了分析，发现SMN基因的缺失频率很高，表明SMN基因缺失可能直接涉及本病，但是SMN基因缺失并不与疾病的严重程度有关；而NAIP基因缺失常发生于Ⅰ型患者，表明NAIP基因缺失可能与疾病的严重程度相关[4]。我们[5，6]以及国内其他学者[7，8]已经对SMN基因作了有关研究。现将我们的结果报告如下。
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1 对象与方法
1.1 对象 13例SMA患儿均来自1995年以来我院遗传咨询门诊病例。按照Melki SMA诊断分型标准，5例患儿诊断为Ⅰ型，4例诊断为Ⅱ型，另外4例为Ⅲ型。其父母表型均正常。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用酚-氯仿方法提取外周静脉血白细胞DNA。
1.2.2 PCR引物 扩增NAIP基因第5外显子的引物及内对照引物(NAIP基因第13外显子)参考Roy
等[2]的设计，引物分别位于NAIP基因第5和第13外显子内，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。扩增NAIP基因第5外显子的引物为：1863，CTCTCA-GCCTGCTCTTCAGAT；1864，AAAGCCTCTGA-CGAGAGGATC，扩增片段为435bp。内对照引物为：1258，ATGCTTGGATCTCTAGAATGG；1343，CC-AGCTCCTAGAGAAAGAAGGA，扩增片段为241bp。
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1.2.3 PCR反应条件 反应体系为50μl，内含10×5μl Buffer,4×2μl dNTP(5mmol/L)，Mg2+ 1.5μl(25mmol/L)，引物各2.5μl(10pmol/μl)，基因组DNA 1μl(100ng/μl)，反应混合物先经95℃变性1分钟，再加入Taq聚合物0.15U，DNA热循环(TC-美国PE公司)，循环过程为94℃60秒，60℃ 60秒，72℃90秒，共30个循环，72℃延伸10分钟。
1.2.4 电泳 PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，时间约1小时，0.5μg/ml溴化乙啶(EB)染色后，紫外灯下观察结果，照相。
2 结果
两对引物扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示出435bp和241bp两条扩增带(图1的2)。435bp扩增带是NAIP第5外显子扩增带，241bp扩增带是内对照扩增带。2例Ⅰ型患儿无NAIP基因第5外显子435bp扩增带(图1的3，4)。
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图1 NAIP基因第5外显子PCR扩增产物电泳图 1.Marker Ⅷ；2.正常对照；3、4.患儿；435bp为第5外显子扩增片段；241bp为内对照扩增片段
Fig 1 Result of PCR amplification of exon 5 Lane 1:marker Ⅷ; Lane 2:normal individual;Lanes 3,4:SMA patients; 435bp:fragment of exon 5; 241bp:fragment of internal control
3 讨论
根据发病年龄和进展速度不同，Melki[9，10]将脊髓性肌萎缩分为3型：Ⅰ型为急性婴儿型(Werding-Hoffmann disease)，发病年龄均在1岁内，病情进展迅速，常由于呼吸肌功能障碍引起肺部感染一般在1～2岁内死亡。Ⅱ型为中间型，发病年龄在1岁左右，病情进展相对比较慢，躯干肌无力不严重，头能直立，能坐，但不能站与走，可以活到少年期，甚至活到成年，但可发生脊柱变形。Ⅲ型为少年型(Kugeblerg-Welander syndrome)，一般在1岁以后发病，病情进展较慢，也可在3～4岁后病情不继续加重。根据上述标准，13例中，5例诊断为Ⅰ型，4例为Ⅱ型，4例为Ⅲ型。以前经SMN基因分析均显示出第7外显子缺失。实际上，在SMA基因定位区域内(5q12-q14)，有2个基因与SMA有关，一个是SMN基因，另一个是NAIP基因，NAIP基因位于SMN基因的远端，其中SMN基因被认为是决定性基因，约98.6%的SMA患者显示该基因突变[1]，而NAIP基因可能与SMA的表型有关，临床表型重的Ⅰ型患者NAIP基因缺失的频率(45%)比临床表型轻的Ⅱ、Ⅲ型患者(18%)高[1，11]。我们的研究结果也支持这一点。2例NAIP基因缺失的标本均为临床诊断为Ⅰ型的SMA患儿(2/5，40%)，尚未在正常人(50例)以及Ⅱ型和Ⅲ型的患者中检测到NAIP基因缺失。结果表明NAIP基因也涉及SMA的发病机理，至少说明临床表现轻重的部分原因与基因缺失大小有关，缺失范围大，涉及到了NAIP基因，临床表型则重；缺失范围小，仅为单独的SMN基因缺失，临床表现轻。最近Burler等[4]进行了大样本研究，对106名法国SMA患者NAIP基因缺失分析表明：Ⅰ型占66%(29/44)；Ⅱ型占6.5%(2/31)；Ⅲ型占13%(4/31)。台湾地区也曾对当地42名SMA患者(Ⅰ型10例，Ⅱ型21例，Ⅲ型11例)进行了NAIP基因分析，未发现任何异常[12]，说明还有其它因素影响SMA的临床表现，如5q21-q14区域的多态性，基因的拷贝数目等。本研究结果提示，伴有或不伴有NAIP基因缺失与SMA表型有关，NAIP基因的研究有助于对预后的估计。进一步的基因分析及大样本研究将有助于解释临床表型的差异。
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本课题为卫生部基金(96Q-040)和国家教委基金(436)资助
参考文献
[1] Letebvre S, Burglel L, Reboullet S, et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell, 1995, 80(1)∶155-165.
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[7] 袁丽芳，刘天慈，杨涛，等.儿童期脊肌萎缩症的基因诊断及产前基因诊断.中华儿科杂志，1997，35(12)∶631-634.
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[8] 刘天慈，吴沪生，袁丽芳，等.脊肌萎缩症临床及基因诊断研究.中国实用儿科杂志，1998，13(1)∶15-16.
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[10] Melki J, Sheth P, Abdelhak S, et al. Mapping of acute (type Ⅰ) spinal muscular atrophy to chromosome 5q12-q14.Lancet, 1990, 336(8710)∶271-273.
[11] Mahadavan MS, Korneluk RG, Roy N, et al. SMA genes:deleted and duplicated. Nature Genet, 1995, 9(2)∶112-113.
[12] Chang JG, Jong YJ, Huang JM, et al. Molecular basis of spinal muscular atrophy in Chinese. Am J Hum Genet, 1995, 57(6)∶1503-1505.
(收稿：1998-04-21 修回：1998-08-27), http://www.100md.com