中国南北地区两个人群HLA-A座位DNA分型的比较研究
作者：孙筱放 孙逸平 麦卫阳 陈欣洁 廖宝平 潘倩莹 黎青 黄艳仪 陈元本
单位：孙筱放 麦卫阳 陈欣洁 廖宝平 潘倩莹 黎青 黄艳仪 陈元本(510150 广州市第二人民医院妇产科研究所)；孙逸平(北京中日友好医院)
关键词：HLA-A座位；等位基因；多聚酶链反应/位点特异性寡核苷酸探针分型
中国南北地区两个人群HLA 【摘要】 目的 对我国北京和广州的各一个群体进行HLA-A座位分型并进行比较研究。方法 用PCR/SSOP的DNA基因分型方法，使用引物1对，探针54种。用同位素磷32标记探针进行DNA杂交，用X片曝光判断结果。结果 共检出HLA-A基因18种，南北人群有一定程度的差异，表现在北方北京地区人群中A*0205、0210和A*2901未检出，A*2601、3001和3101等基因高于南方广州人群；而南方广州群体中A*3101、3201和6801未检出，A*0203、1101高于北方群体。并发现血清型A2有6种基因亚型，包括A*0201、0203、0205、0206、0207、0210，其中以0201为主体。结论 中国南北人群的遗传背景存在一定的差异，A2基因亚型分型在器官移植配型中有重要意义。
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A comparative study of HLA-A locus in northern and
southern Chinese by means of PCR/SSOP typing
SUN Xiaofang*, SUN Yiping, MAI Weiyang, CHEN Xinjie,LIAO Baoping, PAN Qianying, LI Qing, HUANG Yanyi, CHEN Yuanben
*Research Institute of Obstetrics and Gynaecology, Guangzhou No.2 People's Hospital,510150
【Abstract】 Objective To compare the HLA-A locus in a popolation selected from Beijing(northern group)with that in a population selected from Guangzhou (southern group). Methods HLA typing was performed by using PCR/SSOP method. A pair of primer and 54 probes were used. Results In 18 alleles identified, the differences in gene frequency between northern and southern Chinese were found. In northern group, A*0205,0210 and 2901 were absent, and the frequencies of A*2601, 3001 and 3101 were higher than those of southern group; while in southern group, A*3103, 3201 and 6801 were absent, the frequencies of A*0203 and 1101 were higher than those of northern group; and in addition, six subtypes of A2 serological specificity, namely A*0201, 0203, 0205, 0206, 0207 and 0210, were found, in which A*0201 predominated.Conclusion There are some differences in the genetic background of northern and southern Chinese. A2 subtypes have important implications for unrelated-donor transplantation.
, 百拇医药
【Key words】 HLA-A locus Allele Polymerase chain reaction/site specific oligonucleotide probe typing
在我们早期的血清学研究中，曾广泛使用国际标准淋巴细胞毒方法对我国广大地区作过HLA-A、-B、-C座位的测定，因此对中国人HLA分型的资料已十分丰富[1-3]。至今，血清学分型在器官移植配型中仍扮演着十分重要的角色。但由于血清学分型是在多肽水平上，不可避免地有一定的局限性，主要是可区分的型别受限制。根据1997年的命名[4]，仅以HLA-A座位为例，等位基因已达83个而血清学特异性仅能检出32个。HLA-A座位的血清学分型难点之一在于HLA-A2具有高度的亚型变异，已发现等位基因22个，而血清学分型仅能检出4型。另外，HLA-A19的亚型包括A29、A30、A31、A32、A33等，若依靠血清学分型难以区分，这是以往众多群体研究中A19各亚型的数据差别很大的原因。对HLA Ⅰ类基因进行DNA分型的难度要比Ⅱ类基因大得多。首先，Ⅰ类基因各座位间由于进化上的同源性而有高度的类似性。这给设计座位特异性引物带来困难；其次，HLA Ⅰ类分子的肽结合部位的高度多态性是由重链的第一和第二可变区决定的，而在基因水平上，则分别分布于外显子2和3区，因此要求对此两区都进行检测；第三，某些HLA-A座位的等位基因间DNA核苷酸序列类似，这给设计探针带来困难；因此，对HLA Ⅰ类基因的DNA分型要比Ⅱ类基因滞后很多。近来HLA研究的进展以及第十二届国际组织相容性会议也都明确了HLA-DNA分型对器官移植及人类群体研究的重要意义。为此，我们对中国南北地区两个群体进行HLA-A座位的DNA分型，并在此基础上讨论我国南北人群HLA-A座位等位基因的分布特点、差异和意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 研究对象 北京地区随机人群67人，广州地区随机人群102人。均为当地祖籍、无血缘关系。每人抽血3ml，提取DNA待查。
1.2 基因组DNA的制备 采用盐析法提取DNA，详见文献[5]。
1.3 引物和探针的设计 引物及全部探针序列见参考文献[6]，我们使用的特异性引物能扩增HLA-A座位基因从外显子1到外显子3的DNA片段，在此基础上设计全部特异性探针。引物1对：在5′端名A1P：5′TCCCCAGACGCCGAGGATGGCC-3′(从5′内含子的-16位到5′外显子1的第6位)。3′端引物名ABC3P：3′-GCCCATGGTCCCCGGTGCCC-5′(位于外显子3的274到内含子3的+17位)。扩增的DNA长度为1 045bp，见图1。全部探针共54种，见表1。杂交条件及特异性见文献[7]。
, 百拇医药
表1 HLA-A分型的寡核苷酸探针
Tab 1 Oligonucleotide probes for HLA-A typing
Name
(名称)
Sequence(5′-3′)
(序列)(5′-3′)
Position
(位置)
Exon2(外显子2)
A221
GTATTTCTTCACATCCGTG
, 百拇医药
17-
35
A212
GTATTTCTACACCTCCGTG
17-
35
A213
GTATTTCACCACATCCGTG
17-
35
A214
GTATTTCTCCACATCCGTG
, 百拇医药
17-
35
A221
GCCCGGCAGTGGAGAGCCC
41-
59
A222
CCGCGGGAAGCCCCGCTT
47-
64
A232
CCGCGAGCCGGAGGATGGA
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118-
136
A241
GCAGGAGAGGCCTGAGTAT
158-
176
A252a
TTCCGTGTCTCCCCTCCCA
195-
177
A254
ACTTTCCCTGTCTCCTCGT
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199-
181
A255
GGAACACACGGAATGTGAA
184-
202
A256
TTGGGACCTGCAGACACGG
176-
194
A271
ACCGAGCGAACCTGGGGAC
, 百拇医药
220-
238
A273
GAGAGAGCCTGCGGATCGC
224-
242
A275
GAGTGGACCTGGGGACCCT
224-
242
A276
CACAGATTGACCGAGTGGA
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211-
229
A215b
TTCTACACTTCCGTGTCC
21-
38
A220
CCGCGGGGAGCCCCGCTT
47-
64
A243
GCAGGAGGGGCCGGAGTAT
, 百拇医药
158-
176
A272
TCACAGACTCACCGAGTGG
210-
228
Exon3(外显子3)
A300c
CCTGCGCTCCTGGACCGC
116-
134
A301
, 百拇医药
CCTGCGCTCTTGGACCGC
116-
134
A308
CCAGAGGATGTATGGATGC
14-
32
A309
GGCTGCGACGTGGGGTCGG
27-
45
A335
, 百拇医药
GGGAGGCGGCCCATGAGGC
169-
187
A356
CGCTGCAGCGCGCGGGTAC
262-
+5
A310
CCAGAGGATGTGTGGCTGC
14-
32
A311
, 百拇医药
TCACACCGTCCAGAGGATG
6-
24
A317
CACCGTCCAGATGATGTA
8-
25
A318
GGCTGCCACGTGGGGTCGG
27-
45
A319
, 百拇医药
CGTCCAGATGATGTTTGGC
11-
29
A320
GGTCGGACTGGCGCTTCC
40-
57
A321
GCGGGTACCGGCAGGACGC
61-
98
A322
, 百拇医药
GGGTACCACCAGTACGCCT
63-
101
A323
GCAGGACGCTTACGACGG
71-
88
A324
GGGTATGAACAGCACGCCT
63-
81
A327
, 百拇医药
CATCGCCTTGAACGAGGA
98-
115
A330
AGCTCAGACCACCAAGCAC
146-
164
A331
GGAGACGGCCCATGAGGCG
170-
188
A332
, 百拇医药
AGGCGGCCCATGCGGCGGA
172-
190
A333
AGGCGGCCCGTTGGGCGGA
172-
190
A334
GGCGGCCCGTCGGGCGGAG
173-
191
A341
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GTGGCGGACGAGTTGAGAG
183-
201
A342
GAGCAGCGGAGAGTCTACC
188-
206
A343
GGCGGAGCAGCAGAGAGCC
185-
203
A344
, 百拇医药
GGCGGAGCAGTTGAGAGCC
185-
203
A345
GGCGGAGCAGTGGAGAGCC
185-
203
A350
GGCACGTGCGTGGAGTGGC
213-
231
A351
, 百拇医药
CTGGAGGGCCGGTGCGTGG
207-
225
A352
ACCTGGATGGCACGTGCGT
205-
223
A353
ACGTGCGTGGACGGGCTCC
216-
234
A354
, 百拇医药
GCTCCGCAGACACCTGGAG
230-
248
A355
GGCGAGTGCGTGGAGTGGC
213-
231
A357
GGCGAGTGCGTGGACGGGGC
213-
231
a:probes A252 and A254 are complementary to the coding sequence；b:A251, A220, A243, A272, A308, A309, A335 and A356 are supplementary probes；c:A300 and A301 are probes used for negative and positive controls(a：探针A252和A254与编码序列是互补的；b：A251、A220、A243、A272、A308、A309、A335和A356是附加的探针；c：A300和A301探针用于阴性和阳性对照)
, 百拇医药
图1 HLA-A 的PCR扩增 黑框表示外显子，点框表示内含子，箭头指示PCR引物的方向；整个PCR片段(包括引物)为1045bp
Fig 1 PCR amplification of the HLA-A gene Exons are indicated by black boxes; intron are indicated by shadow boxes; arrows indicate directions of PCR primers;the whole PCR fragment including primers is 1045bp
1.4 PCR扩增 PCR扩增的条件见文献[6，7]。PCR总体积100μl，含基因组DNA 0.2μg，引物浓度30pmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.15mmol/L，Taq DNA聚和酶1单位，10μl 10×PCR缓冲液(内含15mmol/L MgCl2，10μl DMSO)，95℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟，35次循环，最后一次循环72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果。
, 百拇医药
1.5 PCR扩增产物斑点印渍 将PCR扩增的产物转移到96孔培养板中，与等体积的0.8mol/L NaOH混匀，每孔加入10μl 0.25%的溴酚蓝，然后从每份PCR产物混合液中取4μl点样于BioTrace HP(Gelmen Sciences, Ann Arbor, MI, USA),空气干燥，在HP膜上可见直径约5cm的蓝色斑点。通常48个PCR产物可在1张4cm×7cm的膜上排成6行。将膜在烤箱内60℃烘干1小时待杂交。
1.6 寡核苷酸杂交 将已印渍好的膜用3×SSC浸湿，在10ml管内进行预杂交(预杂交液：每管2ml含15%甲酰胺，10% 50×Denhardt's液，5×SSPE，1%SDS，5%葡聚糖以及0.2mg/ml的经煮沸鲑精DNA)。在旋转杂交仪中42℃预杂交1小时，然后加入γ-32P末端标记的探针，42℃预杂交1小
时[6]。用3mol/L的氯化四甲胺58℃洗膜30分钟。最后在-70℃条件下X片曝光(30分钟至8小时不等)。
, 百拇医药
2 结果
在两个人群中共检出HLA-A座位等位基因18个，列于表2。
表2 中国南北人群HLA-A座位等位基因频率
Tab 2 HLA-Alleles in northern and southern Chinese
Allele
(等位基因)
Gene frequencies(基因频率)
P value
(P值)
N(北)
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S(南)
A*0101
0.037
0.010
ns
A*0201
0.187
0.128
ns
A*0203
0.008
0.098
<0.001
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A*0205
0.000
0.005
ns
A*0206
0.048
0.040
ns
A*0207
0.067
0.033
ns
A*0210
, 百拇医药
0.000
0.025
ns
A*0301
0.045
0.029
ns
A*1101
0.164
0.338
<0.0001
A*2301
0.075
, 百拇医药
0.005
ns
A*2402
0.149
0.152
ns
A*2601
0.082
0.020
<0.0025
A*2901
0.000
0.015
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ns
A*3001
0.090
0.005
<0.001
A*3101
0.037
0.000
<0.025
A*3201
0.022
0.000
ns
, 百拇医药
A*3303
0.030
0.054
ns
A*6801
0.022
0.000
ns
*N：Northern Chinese(北方人群)，S：Southern Chinese(南方人群)
3 讨论
等位基因和亚型：根据1997年新的HLA命名，HLA-A座位点的等位基因已达到83种，但我们仅检出18种，如以分子表示亚型的检出数，分母表示亚型的命名数,分别为：A1(1/1)、A2(6/22)、A3(1/3)、A11(1/4)、A23(1/1)、A24(1/13)、A26(1/8)、A28(1/5)、A29(1/3)、A30(1/4)、A31(1/2)、A32(1/2)、A33(1/2)。除A2外所有其它型均只检出一个亚型，可见中国人遗传背景相当均一。这种HLA基因的相对均一在医学实践上十分有利。首先，在器官和骨髓移植方面，比较容易找到相配的供体，另外，在HLA与疾病相关的研究中会发现比较一致的结果。研究中我们还发现A2的亚型检出了6个(以A*0201为主体)。这说明过去用血清学方法认为是A2相配合的供受体，事实上很可能并不相配。计算表明，在北方北京人群中随机选择，A2相符的可能性仅为36.4%，而在南方广州人群中由于A2亚型的分布更为分散，其相符的随机可能性仅为12.4%。故此我们建议在非亲缘供受体进行骨髓或器官移植时应重视A2亚型的配型。由于HLA Ⅰ类基因DNA分型操作繁杂，而A2亚型分型较简单易行，可先实行之。A2的频率占50%左右，而且由于其它的A位点亚型很少，基本可忽略，这很有利于实际操作，血清学配型仍很能解决问题。
, 百拇医药
过去通过对HLA Ⅰ类抗原的血清学研究和Ⅱ类基因的DNA分型研究提示中国人可能有两个平行的起源[1-3，7-9]。本文也有类似结果。由于随机婚配和人口迁移，基因流动和混合，当然也不排除人类自然选择的原因，可以看到和纬度平行的梯度差异。表现在广州人群占有优势的基因有A*0203、A*1101等，而在北京人群较高的基因有A*2601、A*3001等。然而大部分基因共有的这一主要格局反映出中国人HLA基因的主旋律相同是共同的民族背景。但另外一些少见基因今日仍局限于特定的地区，尚未扩散而表现出地理隔离，例如A*0205、A*2901在本研究的北京群体中未检出，而A*3101、A*3201、A*6801在广州群体中未检出。这些基因可能在更大的程度上反映了我国先民的地理上的差别和隔离，从而能更好地提供人群的起源和迁移的信息。在今后进一步的群体研究中，它们是有意义的指标。
志谢 本文得到澳大利亚国立大学人类遗传室高小江先生大力支持
, 百拇医药
本课题由广州市科委重点攻关项目基金(9421722)资助
参考文献
[1] 孙逸平，宋长兴，高小江，等.我国部分少数民族HLA多态性研究.中华微生物学和免疫学杂志，1982，2(3)∶133-137.
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[3] Lee TD, Zhao TM, Mickey R, et al. The polymorphism of HLA antigens in the Chinese. Tissue Antigens, 1988, 32(4)∶188-208.
, 百拇医药
[4] Walter F, Bodmer. HLA:What's name? A commentary on HLA nomenclature development over the years. Tissue Antigens, 1997, 49(3 Pt 2)∶293-296.
[5] Miller SA, Kykes DD, Poleskty HF, et al. A simple salting-out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 1988, 16(3)∶1215.
[6] Gao XJ, Jakobsen IB, Serjeantson SM. Characterization of the HLA-A polymorphism by locus-specific polymerase chain reaction amplification and oligonucleotide hybridization. Human Immunol，1994，41(4)∶267-279.
, http://www.100md.com
[7] Sun YP, Gao XJ, An JB, et al. HLA class Ⅱ polymorphism in five Chinese populations detected by polymerase chain reaction and sequence-specific oligonucleotide probes. In: Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T ed, Proceeding of the Eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference. HLA 1991 Volume 2. Oxford: Oxford Science Publication, 1992. 237-240.
[8] Chen RB, Ye GY, Geng ZC, et al. HLA polymorphism of the principal minority nationalities in mainland China. In: Tsuji K, Aizawa M, Sasazuki T ed, Proceeding of the Eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference. HLA 1991 Volume 2. Oxford: Oxford Science Publication, 1992. 676-678.
[9] Gao XJ, Sun YP, An JB, et al. DNA typing for HLA-DR,-DQ and -DP alleles in a Chinese population using the polymerase chain reaction (PCR) and oligonucleotide probes. Tissue Antigens, 1991, 38(1)∶24-30.
(收稿：1998-04-13 修回：1999-01-15), 百拇医药
单位：孙筱放 麦卫阳 陈欣洁 廖宝平 潘倩莹 黎青 黄艳仪 陈元本(510150 广州市第二人民医院妇产科研究所)；孙逸平(北京中日友好医院)
关键词：HLA-A座位；等位基因；多聚酶链反应/位点特异性寡核苷酸探针分型
中国南北地区两个人群HLA 【摘要】 目的 对我国北京和广州的各一个群体进行HLA-A座位分型并进行比较研究。方法 用PCR/SSOP的DNA基因分型方法，使用引物1对，探针54种。用同位素磷32标记探针进行DNA杂交，用X片曝光判断结果。结果 共检出HLA-A基因18种，南北人群有一定程度的差异，表现在北方北京地区人群中A*0205、0210和A*2901未检出，A*2601、3001和3101等基因高于南方广州人群；而南方广州群体中A*3101、3201和6801未检出，A*0203、1101高于北方群体。并发现血清型A2有6种基因亚型，包括A*0201、0203、0205、0206、0207、0210，其中以0201为主体。结论 中国南北人群的遗传背景存在一定的差异，A2基因亚型分型在器官移植配型中有重要意义。
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A comparative study of HLA-A locus in northern and
southern Chinese by means of PCR/SSOP typing
SUN Xiaofang*, SUN Yiping, MAI Weiyang, CHEN Xinjie,LIAO Baoping, PAN Qianying, LI Qing, HUANG Yanyi, CHEN Yuanben
*Research Institute of Obstetrics and Gynaecology, Guangzhou No.2 People's Hospital,510150
【Abstract】 Objective To compare the HLA-A locus in a popolation selected from Beijing(northern group)with that in a population selected from Guangzhou (southern group). Methods HLA typing was performed by using PCR/SSOP method. A pair of primer and 54 probes were used. Results In 18 alleles identified, the differences in gene frequency between northern and southern Chinese were found. In northern group, A*0205,0210 and 2901 were absent, and the frequencies of A*2601, 3001 and 3101 were higher than those of southern group; while in southern group, A*3103, 3201 and 6801 were absent, the frequencies of A*0203 and 1101 were higher than those of northern group; and in addition, six subtypes of A2 serological specificity, namely A*0201, 0203, 0205, 0206, 0207 and 0210, were found, in which A*0201 predominated.Conclusion There are some differences in the genetic background of northern and southern Chinese. A2 subtypes have important implications for unrelated-donor transplantation.
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【Key words】 HLA-A locus Allele Polymerase chain reaction/site specific oligonucleotide probe typing
在我们早期的血清学研究中，曾广泛使用国际标准淋巴细胞毒方法对我国广大地区作过HLA-A、-B、-C座位的测定，因此对中国人HLA分型的资料已十分丰富[1-3]。至今，血清学分型在器官移植配型中仍扮演着十分重要的角色。但由于血清学分型是在多肽水平上，不可避免地有一定的局限性，主要是可区分的型别受限制。根据1997年的命名[4]，仅以HLA-A座位为例，等位基因已达83个而血清学特异性仅能检出32个。HLA-A座位的血清学分型难点之一在于HLA-A2具有高度的亚型变异，已发现等位基因22个，而血清学分型仅能检出4型。另外，HLA-A19的亚型包括A29、A30、A31、A32、A33等，若依靠血清学分型难以区分，这是以往众多群体研究中A19各亚型的数据差别很大的原因。对HLA Ⅰ类基因进行DNA分型的难度要比Ⅱ类基因大得多。首先，Ⅰ类基因各座位间由于进化上的同源性而有高度的类似性。这给设计座位特异性引物带来困难；其次，HLA Ⅰ类分子的肽结合部位的高度多态性是由重链的第一和第二可变区决定的，而在基因水平上，则分别分布于外显子2和3区，因此要求对此两区都进行检测；第三，某些HLA-A座位的等位基因间DNA核苷酸序列类似，这给设计探针带来困难；因此，对HLA Ⅰ类基因的DNA分型要比Ⅱ类基因滞后很多。近来HLA研究的进展以及第十二届国际组织相容性会议也都明确了HLA-DNA分型对器官移植及人类群体研究的重要意义。为此，我们对中国南北地区两个群体进行HLA-A座位的DNA分型，并在此基础上讨论我国南北人群HLA-A座位等位基因的分布特点、差异和意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 研究对象 北京地区随机人群67人，广州地区随机人群102人。均为当地祖籍、无血缘关系。每人抽血3ml，提取DNA待查。
1.2 基因组DNA的制备 采用盐析法提取DNA，详见文献[5]。
1.3 引物和探针的设计 引物及全部探针序列见参考文献[6]，我们使用的特异性引物能扩增HLA-A座位基因从外显子1到外显子3的DNA片段，在此基础上设计全部特异性探针。引物1对：在5′端名A1P：5′TCCCCAGACGCCGAGGATGGCC-3′(从5′内含子的-16位到5′外显子1的第6位)。3′端引物名ABC3P：3′-GCCCATGGTCCCCGGTGCCC-5′(位于外显子3的274到内含子3的+17位)。扩增的DNA长度为1 045bp，见图1。全部探针共54种，见表1。杂交条件及特异性见文献[7]。
, 百拇医药
表1 HLA-A分型的寡核苷酸探针
Tab 1 Oligonucleotide probes for HLA-A typing
Name
(名称)
Sequence(5′-3′)
(序列)(5′-3′)
Position
(位置)
Exon2(外显子2)
A221
GTATTTCTTCACATCCGTG
, 百拇医药
17-
35
A212
GTATTTCTACACCTCCGTG
17-
35
A213
GTATTTCACCACATCCGTG
17-
35
A214
GTATTTCTCCACATCCGTG
, 百拇医药
17-
35
A221
GCCCGGCAGTGGAGAGCCC
41-
59
A222
CCGCGGGAAGCCCCGCTT
47-
64
A232
CCGCGAGCCGGAGGATGGA
, http://www.100md.com
118-
136
A241
GCAGGAGAGGCCTGAGTAT
158-
176
A252a
TTCCGTGTCTCCCCTCCCA
195-
177
A254
ACTTTCCCTGTCTCCTCGT
, http://www.100md.com
199-
181
A255
GGAACACACGGAATGTGAA
184-
202
A256
TTGGGACCTGCAGACACGG
176-
194
A271
ACCGAGCGAACCTGGGGAC
, 百拇医药
220-
238
A273
GAGAGAGCCTGCGGATCGC
224-
242
A275
GAGTGGACCTGGGGACCCT
224-
242
A276
CACAGATTGACCGAGTGGA
, http://www.100md.com
211-
229
A215b
TTCTACACTTCCGTGTCC
21-
38
A220
CCGCGGGGAGCCCCGCTT
47-
64
A243
GCAGGAGGGGCCGGAGTAT
, 百拇医药
158-
176
A272
TCACAGACTCACCGAGTGG
210-
228
Exon3(外显子3)
A300c
CCTGCGCTCCTGGACCGC
116-
134
A301
, 百拇医药
CCTGCGCTCTTGGACCGC
116-
134
A308
CCAGAGGATGTATGGATGC
14-
32
A309
GGCTGCGACGTGGGGTCGG
27-
45
A335
, 百拇医药
GGGAGGCGGCCCATGAGGC
169-
187
A356
CGCTGCAGCGCGCGGGTAC
262-
+5
A310
CCAGAGGATGTGTGGCTGC
14-
32
A311
, 百拇医药
TCACACCGTCCAGAGGATG
6-
24
A317
CACCGTCCAGATGATGTA
8-
25
A318
GGCTGCCACGTGGGGTCGG
27-
45
A319
, 百拇医药
CGTCCAGATGATGTTTGGC
11-
29
A320
GGTCGGACTGGCGCTTCC
40-
57
A321
GCGGGTACCGGCAGGACGC
61-
98
A322
, 百拇医药
GGGTACCACCAGTACGCCT
63-
101
A323
GCAGGACGCTTACGACGG
71-
88
A324
GGGTATGAACAGCACGCCT
63-
81
A327
, 百拇医药
CATCGCCTTGAACGAGGA
98-
115
A330
AGCTCAGACCACCAAGCAC
146-
164
A331
GGAGACGGCCCATGAGGCG
170-
188
A332
, 百拇医药
AGGCGGCCCATGCGGCGGA
172-
190
A333
AGGCGGCCCGTTGGGCGGA
172-
190
A334
GGCGGCCCGTCGGGCGGAG
173-
191
A341
, http://www.100md.com
GTGGCGGACGAGTTGAGAG
183-
201
A342
GAGCAGCGGAGAGTCTACC
188-
206
A343
GGCGGAGCAGCAGAGAGCC
185-
203
A344
, 百拇医药
GGCGGAGCAGTTGAGAGCC
185-
203
A345
GGCGGAGCAGTGGAGAGCC
185-
203
A350
GGCACGTGCGTGGAGTGGC
213-
231
A351
, 百拇医药
CTGGAGGGCCGGTGCGTGG
207-
225
A352
ACCTGGATGGCACGTGCGT
205-
223
A353
ACGTGCGTGGACGGGCTCC
216-
234
A354
, 百拇医药
GCTCCGCAGACACCTGGAG
230-
248
A355
GGCGAGTGCGTGGAGTGGC
213-
231
A357
GGCGAGTGCGTGGACGGGGC
213-
231
a:probes A252 and A254 are complementary to the coding sequence；b:A251, A220, A243, A272, A308, A309, A335 and A356 are supplementary probes；c:A300 and A301 are probes used for negative and positive controls(a：探针A252和A254与编码序列是互补的；b：A251、A220、A243、A272、A308、A309、A335和A356是附加的探针；c：A300和A301探针用于阴性和阳性对照)
, 百拇医药
图1 HLA-A 的PCR扩增 黑框表示外显子，点框表示内含子，箭头指示PCR引物的方向；整个PCR片段(包括引物)为1045bp
Fig 1 PCR amplification of the HLA-A gene Exons are indicated by black boxes; intron are indicated by shadow boxes; arrows indicate directions of PCR primers;the whole PCR fragment including primers is 1045bp
1.4 PCR扩增 PCR扩增的条件见文献[6，7]。PCR总体积100μl，含基因组DNA 0.2μg，引物浓度30pmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.15mmol/L，Taq DNA聚和酶1单位，10μl 10×PCR缓冲液(内含15mmol/L MgCl2，10μl DMSO)，95℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟，35次循环，最后一次循环72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果。
, 百拇医药
1.5 PCR扩增产物斑点印渍 将PCR扩增的产物转移到96孔培养板中，与等体积的0.8mol/L NaOH混匀，每孔加入10μl 0.25%的溴酚蓝，然后从每份PCR产物混合液中取4μl点样于BioTrace HP(Gelmen Sciences, Ann Arbor, MI, USA),空气干燥，在HP膜上可见直径约5cm的蓝色斑点。通常48个PCR产物可在1张4cm×7cm的膜上排成6行。将膜在烤箱内60℃烘干1小时待杂交。
1.6 寡核苷酸杂交 将已印渍好的膜用3×SSC浸湿，在10ml管内进行预杂交(预杂交液：每管2ml含15%甲酰胺，10% 50×Denhardt's液，5×SSPE，1%SDS，5%葡聚糖以及0.2mg/ml的经煮沸鲑精DNA)。在旋转杂交仪中42℃预杂交1小时，然后加入γ-32P末端标记的探针，42℃预杂交1小
时[6]。用3mol/L的氯化四甲胺58℃洗膜30分钟。最后在-70℃条件下X片曝光(30分钟至8小时不等)。
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2 结果
在两个人群中共检出HLA-A座位等位基因18个，列于表2。
表2 中国南北人群HLA-A座位等位基因频率
Tab 2 HLA-Alleles in northern and southern Chinese
Allele
(等位基因)
Gene frequencies(基因频率)
P value
(P值)
N(北)
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S(南)
A*0101
0.037
0.010
ns
A*0201
0.187
0.128
ns
A*0203
0.008
0.098
<0.001
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A*0205
0.000
0.005
ns
A*0206
0.048
0.040
ns
A*0207
0.067
0.033
ns
A*0210
, 百拇医药
0.000
0.025
ns
A*0301
0.045
0.029
ns
A*1101
0.164
0.338
<0.0001
A*2301
0.075
, 百拇医药
0.005
ns
A*2402
0.149
0.152
ns
A*2601
0.082
0.020
<0.0025
A*2901
0.000
0.015
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ns
A*3001
0.090
0.005
<0.001
A*3101
0.037
0.000
<0.025
A*3201
0.022
0.000
ns
, 百拇医药
A*3303
0.030
0.054
ns
A*6801
0.022
0.000
ns
*N：Northern Chinese(北方人群)，S：Southern Chinese(南方人群)
3 讨论
等位基因和亚型：根据1997年新的HLA命名，HLA-A座位点的等位基因已达到83种，但我们仅检出18种，如以分子表示亚型的检出数，分母表示亚型的命名数,分别为：A1(1/1)、A2(6/22)、A3(1/3)、A11(1/4)、A23(1/1)、A24(1/13)、A26(1/8)、A28(1/5)、A29(1/3)、A30(1/4)、A31(1/2)、A32(1/2)、A33(1/2)。除A2外所有其它型均只检出一个亚型，可见中国人遗传背景相当均一。这种HLA基因的相对均一在医学实践上十分有利。首先，在器官和骨髓移植方面，比较容易找到相配的供体，另外，在HLA与疾病相关的研究中会发现比较一致的结果。研究中我们还发现A2的亚型检出了6个(以A*0201为主体)。这说明过去用血清学方法认为是A2相配合的供受体，事实上很可能并不相配。计算表明，在北方北京人群中随机选择，A2相符的可能性仅为36.4%，而在南方广州人群中由于A2亚型的分布更为分散，其相符的随机可能性仅为12.4%。故此我们建议在非亲缘供受体进行骨髓或器官移植时应重视A2亚型的配型。由于HLA Ⅰ类基因DNA分型操作繁杂，而A2亚型分型较简单易行，可先实行之。A2的频率占50%左右，而且由于其它的A位点亚型很少，基本可忽略，这很有利于实际操作，血清学配型仍很能解决问题。
, 百拇医药
过去通过对HLA Ⅰ类抗原的血清学研究和Ⅱ类基因的DNA分型研究提示中国人可能有两个平行的起源[1-3，7-9]。本文也有类似结果。由于随机婚配和人口迁移，基因流动和混合，当然也不排除人类自然选择的原因，可以看到和纬度平行的梯度差异。表现在广州人群占有优势的基因有A*0203、A*1101等，而在北京人群较高的基因有A*2601、A*3001等。然而大部分基因共有的这一主要格局反映出中国人HLA基因的主旋律相同是共同的民族背景。但另外一些少见基因今日仍局限于特定的地区，尚未扩散而表现出地理隔离，例如A*0205、A*2901在本研究的北京群体中未检出，而A*3101、A*3201、A*6801在广州群体中未检出。这些基因可能在更大的程度上反映了我国先民的地理上的差别和隔离，从而能更好地提供人群的起源和迁移的信息。在今后进一步的群体研究中，它们是有意义的指标。
志谢 本文得到澳大利亚国立大学人类遗传室高小江先生大力支持
, 百拇医药
本课题由广州市科委重点攻关项目基金(9421722)资助
参考文献
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(收稿：1998-04-13 修回：1999-01-15), 百拇医药