血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性与非胰岛素依赖性糖尿病肾病的相关性
作者：吴红梅 屈燧林 邓珏林 黄倩 廖少希 张文 周静 李献 敬慧娥
单位：吴红梅 屈燧林 李献 610041 成都，华西医科大学附属第一医院肾内科；黄倩 廖少希 张文 敬慧娥 临床分子生物学实验室；邓珏林 周静 干部病房
关键词：
中华医学遗传学杂志990621 血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ converting enzyme, ACE)使血管紧张素Ⅰ(angiotensin I,Ang Ⅰ)转换成血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)和使缓激肽失活，调节肾小球出入小动脉不同程度收缩，增高球内压，造成早期肾脏损害。研究表明[1]，机体ACE活性受ACE基因插入(I)/缺失(D)(I/D)多态性影响。ACE基因Ⅰ/D多态性与多种心血管疾病密切相关[2]。研究发现遗传因素与糖尿病肾病(diabetic nephroptly,DN)的易感性有关[3]。我们对非胰岛素依赖性糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM)患者和正常健康人进行了ACE基因I/D多态性的测定，旨在探讨ACE基因I/D多态性是否参与NIDDM肾病的发病，为临床早期预测NIDDM肾病提供一定的方向。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 127例门诊及住院NIDDM患者，均符合1985年WHO糖尿病诊断标准。男65例，女62例，平均年龄58.4±11.6岁，病程9.5±5.0年，无其它内科疾病，两周内未用过血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin Ⅰ converting enzyme inhibitor, ACEI)。参照Mogensen等[4]的DN诊断标准，将NIDDM患者分为肾病组(DN组)和非肾病组(NDN组)。DN组：62例，男31例，女31例，平均年龄59.9±10.6岁，病程9.82±5.3年，尿白蛋白排泄率(urine albumin excretion, UAE)>30mg/24h，连续2～3次；NDN组：65例，男34例，女31例，平均年龄57.0±12.0岁，病程9.2±4.7年，UAE<30mg/24h，连续2～3次。正常对照组(对照组)：90名，男48名，女42名，平均年龄30.1±7.9岁，选自成都地区健康献血员。
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1.2 方法 用常规苯酚/氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，根据Hubert等[5]发表的ACE基因结构，对应于ACE基因第16内含子PHA4.3区域两侧序列，参考Rigat等[6]设计的PCR反应引物，由上海生物工程公司合成，引物序列：ACE-F，5′-CTGGAGACCACTCCCATC-CTTTCT-3′；ACE-R，5′-GATGTGGCC-ATCACATTCGTCAGAT-3′。在PTC-200型DNA扩增仪上，初期变性94℃，5分钟；继之34个周期，每个周期中变性94℃，1分钟；退火65℃，1分钟及延伸72℃，1分半钟；终末延伸72℃，5分钟，将PCR产物在2%琼脂糖溴乙锭凝胶上电泳，在紫外灯下显影，通过凝胶照相及图像分析系统确定基因型。
1.3 统计学分析 采用Stata计算机软件，计算各组ACE基因I/D多态的基因型频率，确定其符合Hardy-Weinberg平衡，由基因型计算等位基因频率，组间频率用χ2检验。
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2 结果
2.1 ACE基因3种基因型 人ACE基因位于17q23，第16号内含子中如存在287bp的Alu重复顺序，PCR产物长度为490bp，称为插入型(I型)；没有Alu顺序，产物为190bp，为缺失型(D型)。故群体中ACE基因可有3种基因型：DD型、DI型及II型。
2.2 NIDDM组和对照组ACE基因多态性比较 两组ACE基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(NIDDM组：χ2＝2.21，P>0.1；对照组：χ2＝0.49，P>0.25)，基因型及等位基因频率均无显著差异(基因型分布χ2＝0.421，P>0.05；等位基因频率χ2＝0.196，P>0.05)，见表1。
表1 NIDDM组和对照组ACE基因I/D多态性频率比较
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NIDDM组
(n=127)
对照组
(n=90)
等位基因
D
107(0.42)
72(0.40)
I
147(0.58)
108(0.60)
基因型
DD
, 百拇医药
27(0.21)
16(0.18)
DI
53(0.42)
40(0.44)
II
47(0.37)
34(0.38)
注：基因型数字为例数(频率)，等位基因为染色体数(频率)
2.3 DN组和NDN组ACE基因多态性频率比较 两组ACE基因型分布有显著差异，表现为DN组DD及DD+DI基因型频率和D等位基因频率明显高于NDN组，见表2。
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表2 DN组和NDN组ACE基因多态性比较
DN组
(n=62)
NDN组
(n=65)
等位基因
D
64(0.52)
43(0.33)
I
60(0.48)
87(0.67)
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基因型
DD
18(0.29)
9(0.14)
DI
28(0.45)
25(0.38)
II
16(0.26)
31(0.48)
基因型分布：χ2＝7.89，P＝0.019；DD+DI比II：χ2＝6.520，P＝0.011；DD比非DD：χ2＝4.372，P＝0.037；等位基因频率：χ2＝8.944，P＝0.003
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3 讨论
近年研究发现，ACE基因I/D多态 性与多种心血管疾病密切相关，提示该基因位点变异与功能有关[2]。为此，ACE基因作为DN的候选基因研究引起了各国学者的兴趣。Marre等[7]研究发现在IDDM患者中ACE基因I/D多态性与DN发病有关，DN组以DD基因型占优势，II型少，ACE II基因型是DN的保护基因，而DD或DI型是其易感基因。Mizuiri等[8]在日本人中对NIDDM患者的研究亦显示DN患者以DI基因型和D等位基因占优势。吴松华等[9]研究亦提示ACE基因I/D多态性与早发NIDDM肾病发病有关。我们的结果显示NIDDM组和对照组ACE基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，两组ACE基因型分布并无显著差异，DN组和NDN组基因型分布有显著差异，表现为DN组以DD及DD+DI基因型为主，D等位基因频率也明显高于NDN组，提示ACE基因I/D多态性与NIDDM发病无关，ACE基因仅参与了DN发病，ACE基因DD或DI型是DN发病的危险因素，但Tarnow等[10]在法国人中对IDDM患者研究显示ACE基因多态性与DN发病并不相关。因此，在NIDDM高危人群中进行ACE基因调查，这对早期发现和及时防治NIDDM肾病发病及延缓肾功能进行性减退有着十分积极的临床意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Tiret L, Rigat B, Visvikis S, et al.Evidence, from combined segregation and linkage analysis, That a variant of the angiotensin I-converting enzyme(ACE) gene controls plasma ACE levels. Am J Hum Genet, 1992,51(1)∶197-205.
2 Cambien F. The angiotensin-converting enzyme(ACE) genetic polymorphism:its relationship with plasma ACE level and myocardial infarction. Clin Genet,1994,46(1)∶94-101.
, http://www.100md.com 3 Rosenberg HE, Correa-Retter R. Pathogenesis and risk factors for diabetic nephropathy. In:Jacobson HR, Striker GE, Klakr S, et al.eds.The principles and practice of nephrology. St.Lowis:Mosby, 1995.330-336.
4 Mogensen CE, Christensen CK. Predicting diabetic nephropathy in insulin-dependent patients. New Eng Med,1984,311(2)∶89-93.
5 Hubert C, Houot AM, Corvol P, et al.Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. J Biol Chem,1991,266(23)∶15377-15383.
, http://www.100md.com
6 Rigat B, Hubert C, Corvol P, et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (DCP 1) (dipeptidyl carboxy peptidase I).Nucleic Acid Res,1992,20(6)∶1433.
7 Marre M, Bernadet P, Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism, plasma levels, and diabetic retinal and renal complications. Diabetes, 1994,43(3)∶384-388.
8 Mizuiri S, Hemmi H, Inoue A, et al.Angiotensin-converting enzyme polymor-phism and development of diabetic nephropathy in non-insulin-dependent diabetes mellitus.Nephron,1995,70(4)∶455-459.
, http://www.100md.com
9 吴松华，项坤山，翁青，等.糖尿病肾脏病变与血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性的关系.中华医学杂志，1997，77(3)∶183-186.
10 Tarnow L, Cambien F, Rossing P, et al.Lack of relationship between an insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene and diabetic nephropathy and proliferative retinopathy in IDDM patients. Diabetes, 1995,44(5)∶489-494.
(收稿：1999-02-08 修回：1999-06-10), 百拇医药
单位：吴红梅 屈燧林 李献 610041 成都，华西医科大学附属第一医院肾内科；黄倩 廖少希 张文 敬慧娥 临床分子生物学实验室；邓珏林 周静 干部病房
关键词：
中华医学遗传学杂志990621 血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ converting enzyme, ACE)使血管紧张素Ⅰ(angiotensin I,Ang Ⅰ)转换成血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)和使缓激肽失活，调节肾小球出入小动脉不同程度收缩，增高球内压，造成早期肾脏损害。研究表明[1]，机体ACE活性受ACE基因插入(I)/缺失(D)(I/D)多态性影响。ACE基因Ⅰ/D多态性与多种心血管疾病密切相关[2]。研究发现遗传因素与糖尿病肾病(diabetic nephroptly,DN)的易感性有关[3]。我们对非胰岛素依赖性糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM)患者和正常健康人进行了ACE基因I/D多态性的测定，旨在探讨ACE基因I/D多态性是否参与NIDDM肾病的发病，为临床早期预测NIDDM肾病提供一定的方向。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 127例门诊及住院NIDDM患者，均符合1985年WHO糖尿病诊断标准。男65例，女62例，平均年龄58.4±11.6岁，病程9.5±5.0年，无其它内科疾病，两周内未用过血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin Ⅰ converting enzyme inhibitor, ACEI)。参照Mogensen等[4]的DN诊断标准，将NIDDM患者分为肾病组(DN组)和非肾病组(NDN组)。DN组：62例，男31例，女31例，平均年龄59.9±10.6岁，病程9.82±5.3年，尿白蛋白排泄率(urine albumin excretion, UAE)>30mg/24h，连续2～3次；NDN组：65例，男34例，女31例，平均年龄57.0±12.0岁，病程9.2±4.7年，UAE<30mg/24h，连续2～3次。正常对照组(对照组)：90名，男48名，女42名，平均年龄30.1±7.9岁，选自成都地区健康献血员。
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1.2 方法 用常规苯酚/氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA，根据Hubert等[5]发表的ACE基因结构，对应于ACE基因第16内含子PHA4.3区域两侧序列，参考Rigat等[6]设计的PCR反应引物，由上海生物工程公司合成，引物序列：ACE-F，5′-CTGGAGACCACTCCCATC-CTTTCT-3′；ACE-R，5′-GATGTGGCC-ATCACATTCGTCAGAT-3′。在PTC-200型DNA扩增仪上，初期变性94℃，5分钟；继之34个周期，每个周期中变性94℃，1分钟；退火65℃，1分钟及延伸72℃，1分半钟；终末延伸72℃，5分钟，将PCR产物在2%琼脂糖溴乙锭凝胶上电泳，在紫外灯下显影，通过凝胶照相及图像分析系统确定基因型。
1.3 统计学分析 采用Stata计算机软件，计算各组ACE基因I/D多态的基因型频率，确定其符合Hardy-Weinberg平衡，由基因型计算等位基因频率，组间频率用χ2检验。
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2 结果
2.1 ACE基因3种基因型 人ACE基因位于17q23，第16号内含子中如存在287bp的Alu重复顺序，PCR产物长度为490bp，称为插入型(I型)；没有Alu顺序，产物为190bp，为缺失型(D型)。故群体中ACE基因可有3种基因型：DD型、DI型及II型。
2.2 NIDDM组和对照组ACE基因多态性比较 两组ACE基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(NIDDM组：χ2＝2.21，P>0.1；对照组：χ2＝0.49，P>0.25)，基因型及等位基因频率均无显著差异(基因型分布χ2＝0.421，P>0.05；等位基因频率χ2＝0.196，P>0.05)，见表1。
表1 NIDDM组和对照组ACE基因I/D多态性频率比较
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NIDDM组
(n=127)
对照组
(n=90)
等位基因
D
107(0.42)
72(0.40)
I
147(0.58)
108(0.60)
基因型
DD
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27(0.21)
16(0.18)
DI
53(0.42)
40(0.44)
II
47(0.37)
34(0.38)
注：基因型数字为例数(频率)，等位基因为染色体数(频率)
2.3 DN组和NDN组ACE基因多态性频率比较 两组ACE基因型分布有显著差异，表现为DN组DD及DD+DI基因型频率和D等位基因频率明显高于NDN组，见表2。
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表2 DN组和NDN组ACE基因多态性比较
DN组
(n=62)
NDN组
(n=65)
等位基因
D
64(0.52)
43(0.33)
I
60(0.48)
87(0.67)
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基因型
DD
18(0.29)
9(0.14)
DI
28(0.45)
25(0.38)
II
16(0.26)
31(0.48)
基因型分布：χ2＝7.89，P＝0.019；DD+DI比II：χ2＝6.520，P＝0.011；DD比非DD：χ2＝4.372，P＝0.037；等位基因频率：χ2＝8.944，P＝0.003
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3 讨论
近年研究发现，ACE基因I/D多态 性与多种心血管疾病密切相关，提示该基因位点变异与功能有关[2]。为此，ACE基因作为DN的候选基因研究引起了各国学者的兴趣。Marre等[7]研究发现在IDDM患者中ACE基因I/D多态性与DN发病有关，DN组以DD基因型占优势，II型少，ACE II基因型是DN的保护基因，而DD或DI型是其易感基因。Mizuiri等[8]在日本人中对NIDDM患者的研究亦显示DN患者以DI基因型和D等位基因占优势。吴松华等[9]研究亦提示ACE基因I/D多态性与早发NIDDM肾病发病有关。我们的结果显示NIDDM组和对照组ACE基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，两组ACE基因型分布并无显著差异，DN组和NDN组基因型分布有显著差异，表现为DN组以DD及DD+DI基因型为主，D等位基因频率也明显高于NDN组，提示ACE基因I/D多态性与NIDDM发病无关，ACE基因仅参与了DN发病，ACE基因DD或DI型是DN发病的危险因素，但Tarnow等[10]在法国人中对IDDM患者研究显示ACE基因多态性与DN发病并不相关。因此，在NIDDM高危人群中进行ACE基因调查，这对早期发现和及时防治NIDDM肾病发病及延缓肾功能进行性减退有着十分积极的临床意义。
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参考文献
1 Tiret L, Rigat B, Visvikis S, et al.Evidence, from combined segregation and linkage analysis, That a variant of the angiotensin I-converting enzyme(ACE) gene controls plasma ACE levels. Am J Hum Genet, 1992,51(1)∶197-205.
2 Cambien F. The angiotensin-converting enzyme(ACE) genetic polymorphism:its relationship with plasma ACE level and myocardial infarction. Clin Genet,1994,46(1)∶94-101.
, http://www.100md.com 3 Rosenberg HE, Correa-Retter R. Pathogenesis and risk factors for diabetic nephropathy. In:Jacobson HR, Striker GE, Klakr S, et al.eds.The principles and practice of nephrology. St.Lowis:Mosby, 1995.330-336.
4 Mogensen CE, Christensen CK. Predicting diabetic nephropathy in insulin-dependent patients. New Eng Med,1984,311(2)∶89-93.
5 Hubert C, Houot AM, Corvol P, et al.Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. J Biol Chem,1991,266(23)∶15377-15383.
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6 Rigat B, Hubert C, Corvol P, et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene (DCP 1) (dipeptidyl carboxy peptidase I).Nucleic Acid Res,1992,20(6)∶1433.
7 Marre M, Bernadet P, Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism, plasma levels, and diabetic retinal and renal complications. Diabetes, 1994,43(3)∶384-388.
8 Mizuiri S, Hemmi H, Inoue A, et al.Angiotensin-converting enzyme polymor-phism and development of diabetic nephropathy in non-insulin-dependent diabetes mellitus.Nephron,1995,70(4)∶455-459.
, http://www.100md.com
9 吴松华，项坤山，翁青，等.糖尿病肾脏病变与血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性的关系.中华医学杂志，1997，77(3)∶183-186.
10 Tarnow L, Cambien F, Rossing P, et al.Lack of relationship between an insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene and diabetic nephropathy and proliferative retinopathy in IDDM patients. Diabetes, 1995,44(5)∶489-494.
(收稿：1999-02-08 修回：1999-06-10), 百拇医药