p53基因在视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb44中的表达及意义
作者：陈大年 张晓玮* 罗成仁
单位：610041成都，华西医科大学附属第一医院眼科
关键词：
p53基因在视网膜母细胞瘤细胞系HXO 野生型p53基因是一个重要的抑癌基因，50%以上的人体肿瘤可检测到p53基因突变。但p53基因在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)发生中的作用如何，目前的研究结果仍有争议。HXO-Rb44是我国建立的一株来源于实体RB的恶性RB细胞系[1]，该细胞系中p53基因表达状况还未进行鉴定。我们利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)及流式细胞术(flow cytometry,FCM)间接免疫荧光法，对HXO-Rb44中p53基因表达进行形态学定性、定位观察及定量检测，为进一步利用该细胞系研究RB的发病机理，利用抑癌基因进行RB的体内外基因治疗提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 主要材料及仪器设备
1.1.1 RB细胞系HXO-Rb44由湖南医科大学肿瘤研究所提供；细胞培养试剂RPMI-1640培养基为美国GIBCO BRL公司产品；正常健康人外周血由志愿者提供；淋巴细胞分离液为上海精华生物科技有限公司产品。
1.1.2 鼠抗人p53单克隆抗体为DAKO公司产品，工作浓度为1∶50，4℃保存；SPTM试剂盒，美国Zymed公司产品；DAB染色试剂盒，Sigma公司产品；Triton X-100，Sigma公司产品；异硫氰酸胍(FITC)标记的羊抗鼠IgG，美国Santa Cruz公司产品，工作浓度为1∶20，-20℃避光保存。
1.1.3 流式细胞仪为美国Coulter公司，ELITE ESP型，华西医科大学附一院肿瘤生物治疗中心提供。
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1.2 实验方法
1.2.1 HXO-Rb44细胞培养 HXO-Rb44细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液内，垂直放于含5%CO2、37℃细胞培养箱内。HXO-Rb44细胞体外呈悬浮生长，故采用半量换液法，每周1∶3传代两次。
1.2.2 外周血淋巴细胞分离 将抗凝血缓慢加到等量的淋巴细胞分离液内(不可振荡混匀)，1800r/min离心20分钟后，可见有3个液体界面。用巴氏吸管仔细吸取中间层乳白色液体，PBS液离心洗涤1000r/min×3分钟，共2次，即制备好淋巴细胞。
1.2.3 免疫组织化学染色检测p53基因表达 采用SP法(按试剂盒内说明)进行染色。采用已知阳性的肺癌组织切片作为p53基因表达的阳性对照；以PBS代替一抗作为阴性对照；以正常视网膜组织作为正常对照。结果判定：分别在至少有5个代表性的100×高倍视野下计数500个细胞中的染色阳性细胞数。以每100个细胞中的阳性细胞数作为参数进行分析。阳性细胞数<10%为表达阴性；阳性细胞数在10%～50%之间为表达阳性，>50%为强阳性表达。
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1.2.4 流式细胞仪间接免疫荧光法定量检测p53基因表达 实验步骤：(1)取1×106 HXO-Rb44及1×106淋巴细胞各100μl，放入试管中，100%甲醇(-20℃冰浴)固定20分钟，离心洗涤1800r/min×3分钟；(2)加适量0.5% Triton X-100室温打孔10分钟，PBS洗3次；(3)加p53单克隆抗体100μl，4℃冰浴30分钟；PBS洗3次；(4)加FITC-IgG 100μl，4℃避光放置20分钟；PBS洗3次，弃上清，除去未结合的多余荧光抗体；(5)试管内加适量PBS，上机检测。实验对照：以正常人外周血淋巴细胞作为正常对照：以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：以平均荧光强度(mean fluorescence intensity,mean Flu)表示基因产物表达的相对含量，公式为：mean Flu=受检细胞基因产物表达的平均荧光强度减去阴性对照样品平均荧光强度。
2 结果
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2.1 RB细胞系HXO-Rb44中P53蛋白的表达SP免疫组织化学染色显示P53蛋白阳性反应位于细胞核，呈棕黄色。正常视网膜组织中未见P53蛋白阳性反应细胞，P53蛋白表达为阴性(图1)；HXO-Rb44中平均每100个RB细胞中P53蛋白染色阳性细胞数为45.3±0.18，因此，其P53蛋白表达为阳性(图2)。
图1 正常视网膜组织p53免疫组织化学染色阴性 SP×400
图2 HXO-Rb44 p53免疫组织化学染色结果 RB细胞核呈棕黄色阳性反应 SP×1000
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2.2 RB细胞系HXO-Rb44中P53蛋白的表达量 FCM间接免疫荧光法定量检测表明：HXO-Rb44细胞P53蛋白表达量为正常人淋巴细胞的5倍，正常人淋巴细胞无P53蛋白表达(图3)。
图3 P53蛋白表达量的流式细胞仪间接免疫荧光检测图 A-阴性对照样品，mean Flu=0.325，B-HXO-Rb44细胞，mean Flu=1.6；C-淋巴细胞，mean Flu=0.320
3 讨论
Rb基因是被人类发现并克隆成功的第1个抑癌基因。Rb基因经两次突变而失活是RB发生的重要分子机理。但随着人们对RB的深入研究，已发现许多癌基因(bcl-2,c-Fos,c-Jun，ki-ras等)及抑癌基因(如p16，p15等)在RB中的异常表达。这些研究结果均从另一个角度提示：RB的发生、发展有多因素参与，是多种癌基因激活与抑癌基因失活共同作用的结果。
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p53基因位于染色体17p，相对分子质量为53×103的核蛋白。p53基因分为野生型及突变型两种。野生型P53基因是一个重要的抑癌基因。由于野生型P53蛋白含量微，半衰期短，仅20～30分钟，因而很难从蛋白表达水平上检测到野生型P53蛋白的积聚；而突变型P53基因，其蛋白表达增高，半衰期延长，在细胞内聚集。因此，能够检测到的P53蛋白几乎均是突变型P53蛋白。1995年Yuge等[2]首次在RB实体瘤中发现有突变型P53蛋白的高表达。这与我们对HXO-Rb44的实验结果一致，HXO-Rb44中有突变型P53蛋白表达。1996年Emre等[3]又进一步从DNA水平上用PCR技术证实10例RB中5例在P53基因的第1内含子的VNTR区域中有杂合性丢失。Kato等[4]认为p53基因的LOH与原发性RB形成无关，但在RB进行性发展中可能起一定作用。目前认为野生型p53基因在RB发生发展中的作用与p53基因诱导的细胞凋亡作用有关，p53基因调控RB中的细胞凋亡。在Rb基因失活的情况下，p53存在，细胞凋亡；p53缺失，则细胞持续不断增殖形成RB[5，6]。但在Faraldi及Hovig等[7，8]的研究中并未检出RB肿瘤中突变的P53蛋白，故在RB中是否有p53基因的改变还有待进一步研究。
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本课题受国家自然科学基金(39570751)、CMB基金(9509)和中国医学科学院基金资助
*现在河南省眼科研究所
参考文献
1 徐和平，王成业，刘双珍，等.视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb44的建立及其生物学特性的检测.眼科研究，1994，12(2)∶183-186.
2 Yuge K, Nakajima M, Uemura Y, et al. Immunohistochemical features of the human retina and retinoblastoma. Virchows Arch, 1995，426(6)∶571-575.
3 Emre S, Sungur A, Bilgic S, et al.Loss of heterozygosity in the VNTR region of intron 1 of p53 in two retinoblastoma cases. Pediatr Hematol Oncol,1996，13(3)∶253-256.
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4 Kato MV, Shimizu T, Ishizaki K, et al.Loss of heterozygosity on chromosome 17 and mutation of the p53 gene in retinoblastoma. Cancer Lett,1996,106(1)∶75-82.
5 Nork TM, Poulsen GL, Millecchia LL, et al.p53 regulates apoptosis in human retinoblastoma. Arch Ophthalmol, 1997,115(2)∶213-219.
6 Howes KA, Ransom N, Papermaster DS, et al.Apoptosis of RB:alternative fates of photoreceptors expressing the HPV-16 E7 gene in the presence or absence of p53.Gene Dev,1994,8(11)∶1300-1310.
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7 Faraldi F, Calzolari A, Alfieri E, et al.Lack of detection of p53 expression in RB tumor cells. Pathologica,1994,86(4)∶401-402.
8 Hovig E, Andreassen A, Fangun BM, et al.WTp53 mutation detected in cells established from an osteosarcoma, but not in the retinoblastoma of a patient with bilateral retinoblastoma and multiple primary osteosarcomas. Cancer Genet Cytogenet,1992,64(2)∶178-182.
(收稿：1998-12-20 修回：1999-03-08), 百拇医药(陈大年 张晓玮* 罗成仁)
单位：610041成都，华西医科大学附属第一医院眼科
关键词：
p53基因在视网膜母细胞瘤细胞系HXO 野生型p53基因是一个重要的抑癌基因，50%以上的人体肿瘤可检测到p53基因突变。但p53基因在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)发生中的作用如何，目前的研究结果仍有争议。HXO-Rb44是我国建立的一株来源于实体RB的恶性RB细胞系[1]，该细胞系中p53基因表达状况还未进行鉴定。我们利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)及流式细胞术(flow cytometry,FCM)间接免疫荧光法，对HXO-Rb44中p53基因表达进行形态学定性、定位观察及定量检测，为进一步利用该细胞系研究RB的发病机理，利用抑癌基因进行RB的体内外基因治疗提供实验依据。
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1 材料与方法
1.1 主要材料及仪器设备
1.1.1 RB细胞系HXO-Rb44由湖南医科大学肿瘤研究所提供；细胞培养试剂RPMI-1640培养基为美国GIBCO BRL公司产品；正常健康人外周血由志愿者提供；淋巴细胞分离液为上海精华生物科技有限公司产品。
1.1.2 鼠抗人p53单克隆抗体为DAKO公司产品，工作浓度为1∶50，4℃保存；SPTM试剂盒，美国Zymed公司产品；DAB染色试剂盒，Sigma公司产品；Triton X-100，Sigma公司产品；异硫氰酸胍(FITC)标记的羊抗鼠IgG，美国Santa Cruz公司产品，工作浓度为1∶20，-20℃避光保存。
1.1.3 流式细胞仪为美国Coulter公司，ELITE ESP型，华西医科大学附一院肿瘤生物治疗中心提供。
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1.2 实验方法
1.2.1 HXO-Rb44细胞培养 HXO-Rb44细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液内，垂直放于含5%CO2、37℃细胞培养箱内。HXO-Rb44细胞体外呈悬浮生长，故采用半量换液法，每周1∶3传代两次。
1.2.2 外周血淋巴细胞分离 将抗凝血缓慢加到等量的淋巴细胞分离液内(不可振荡混匀)，1800r/min离心20分钟后，可见有3个液体界面。用巴氏吸管仔细吸取中间层乳白色液体，PBS液离心洗涤1000r/min×3分钟，共2次，即制备好淋巴细胞。
1.2.3 免疫组织化学染色检测p53基因表达 采用SP法(按试剂盒内说明)进行染色。采用已知阳性的肺癌组织切片作为p53基因表达的阳性对照；以PBS代替一抗作为阴性对照；以正常视网膜组织作为正常对照。结果判定：分别在至少有5个代表性的100×高倍视野下计数500个细胞中的染色阳性细胞数。以每100个细胞中的阳性细胞数作为参数进行分析。阳性细胞数<10%为表达阴性；阳性细胞数在10%～50%之间为表达阳性，>50%为强阳性表达。
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1.2.4 流式细胞仪间接免疫荧光法定量检测p53基因表达 实验步骤：(1)取1×106 HXO-Rb44及1×106淋巴细胞各100μl，放入试管中，100%甲醇(-20℃冰浴)固定20分钟，离心洗涤1800r/min×3分钟；(2)加适量0.5% Triton X-100室温打孔10分钟，PBS洗3次；(3)加p53单克隆抗体100μl，4℃冰浴30分钟；PBS洗3次；(4)加FITC-IgG 100μl，4℃避光放置20分钟；PBS洗3次，弃上清，除去未结合的多余荧光抗体；(5)试管内加适量PBS，上机检测。实验对照：以正常人外周血淋巴细胞作为正常对照：以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：以平均荧光强度(mean fluorescence intensity,mean Flu)表示基因产物表达的相对含量，公式为：mean Flu=受检细胞基因产物表达的平均荧光强度减去阴性对照样品平均荧光强度。
2 结果
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2.1 RB细胞系HXO-Rb44中P53蛋白的表达SP免疫组织化学染色显示P53蛋白阳性反应位于细胞核，呈棕黄色。正常视网膜组织中未见P53蛋白阳性反应细胞，P53蛋白表达为阴性(图1)；HXO-Rb44中平均每100个RB细胞中P53蛋白染色阳性细胞数为45.3±0.18，因此，其P53蛋白表达为阳性(图2)。
图1 正常视网膜组织p53免疫组织化学染色阴性 SP×400
图2 HXO-Rb44 p53免疫组织化学染色结果 RB细胞核呈棕黄色阳性反应 SP×1000
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2.2 RB细胞系HXO-Rb44中P53蛋白的表达量 FCM间接免疫荧光法定量检测表明：HXO-Rb44细胞P53蛋白表达量为正常人淋巴细胞的5倍，正常人淋巴细胞无P53蛋白表达(图3)。
图3 P53蛋白表达量的流式细胞仪间接免疫荧光检测图 A-阴性对照样品，mean Flu=0.325，B-HXO-Rb44细胞，mean Flu=1.6；C-淋巴细胞，mean Flu=0.320
3 讨论
Rb基因是被人类发现并克隆成功的第1个抑癌基因。Rb基因经两次突变而失活是RB发生的重要分子机理。但随着人们对RB的深入研究，已发现许多癌基因(bcl-2,c-Fos,c-Jun，ki-ras等)及抑癌基因(如p16，p15等)在RB中的异常表达。这些研究结果均从另一个角度提示：RB的发生、发展有多因素参与，是多种癌基因激活与抑癌基因失活共同作用的结果。
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p53基因位于染色体17p，相对分子质量为53×103的核蛋白。p53基因分为野生型及突变型两种。野生型P53基因是一个重要的抑癌基因。由于野生型P53蛋白含量微，半衰期短，仅20～30分钟，因而很难从蛋白表达水平上检测到野生型P53蛋白的积聚；而突变型P53基因，其蛋白表达增高，半衰期延长，在细胞内聚集。因此，能够检测到的P53蛋白几乎均是突变型P53蛋白。1995年Yuge等[2]首次在RB实体瘤中发现有突变型P53蛋白的高表达。这与我们对HXO-Rb44的实验结果一致，HXO-Rb44中有突变型P53蛋白表达。1996年Emre等[3]又进一步从DNA水平上用PCR技术证实10例RB中5例在P53基因的第1内含子的VNTR区域中有杂合性丢失。Kato等[4]认为p53基因的LOH与原发性RB形成无关，但在RB进行性发展中可能起一定作用。目前认为野生型p53基因在RB发生发展中的作用与p53基因诱导的细胞凋亡作用有关，p53基因调控RB中的细胞凋亡。在Rb基因失活的情况下，p53存在，细胞凋亡；p53缺失，则细胞持续不断增殖形成RB[5，6]。但在Faraldi及Hovig等[7，8]的研究中并未检出RB肿瘤中突变的P53蛋白，故在RB中是否有p53基因的改变还有待进一步研究。
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本课题受国家自然科学基金(39570751)、CMB基金(9509)和中国医学科学院基金资助
*现在河南省眼科研究所
参考文献
1 徐和平，王成业，刘双珍，等.视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb44的建立及其生物学特性的检测.眼科研究，1994，12(2)∶183-186.
2 Yuge K, Nakajima M, Uemura Y, et al. Immunohistochemical features of the human retina and retinoblastoma. Virchows Arch, 1995，426(6)∶571-575.
3 Emre S, Sungur A, Bilgic S, et al.Loss of heterozygosity in the VNTR region of intron 1 of p53 in two retinoblastoma cases. Pediatr Hematol Oncol,1996，13(3)∶253-256.
, http://www.100md.com
4 Kato MV, Shimizu T, Ishizaki K, et al.Loss of heterozygosity on chromosome 17 and mutation of the p53 gene in retinoblastoma. Cancer Lett,1996,106(1)∶75-82.
5 Nork TM, Poulsen GL, Millecchia LL, et al.p53 regulates apoptosis in human retinoblastoma. Arch Ophthalmol, 1997,115(2)∶213-219.
6 Howes KA, Ransom N, Papermaster DS, et al.Apoptosis of RB:alternative fates of photoreceptors expressing the HPV-16 E7 gene in the presence or absence of p53.Gene Dev,1994,8(11)∶1300-1310.
, http://www.100md.com
7 Faraldi F, Calzolari A, Alfieri E, et al.Lack of detection of p53 expression in RB tumor cells. Pathologica,1994,86(4)∶401-402.
8 Hovig E, Andreassen A, Fangun BM, et al.WTp53 mutation detected in cells established from an osteosarcoma, but not in the retinoblastoma of a patient with bilateral retinoblastoma and multiple primary osteosarcomas. Cancer Genet Cytogenet,1992,64(2)∶178-182.
(收稿：1998-12-20 修回：1999-03-08), 百拇医药(陈大年 张晓玮* 罗成仁)