人外周血单个核细胞CD14基因的扩增及序列测定
作者：张万江 鲍朗 邱洪宇 晏菊芳 胡昌华 张会东
单位：张万江(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；鲍朗(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；邱洪宇(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；晏菊芳(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；胡昌华(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；张会东(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)
关键词：单个核细胞；CD14基因；序列测定
中华医学遗传学杂志 CHINESE JOURNAL OF MEDICAL GENETICS 2000 Vol 【摘要】 目的 介绍一种获取人CD14基因的简易方法。方法 利用CD14基因组成的特点，采用聚合酶链反应技术以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板扩增获取人CD14基因。结果 从人外周血单个核细胞基因组DNA中成功扩增出大小约1.1 kb的人CD14基因，并且经基因序列测定表明，克隆的人CD14基因序列与文献报道完全相同。结论 以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板，扩增人CD14基因的方法是一种获取CD14基因简捷、有效的方法。
, 百拇医药
Amplification and sequence of human CD14 gene from human mononuclear cell in peripheral blood*
ZHANG Wanjiang BAO Lang, QIU Hongyu YAN Jufang HU Changhua ZHANG Huidong. (Research Unit of Infection & Immunity, West China University of Medical Sciences, Chengdu,Sichuan,610041 P.R.China. E-mail:Baolang@wcums.edu.cn)
【Abstract】 Objective To introduce a new method for getting human CD14 gene.Methods Based on the character of CD14 gene, the authors amplified the CD14 gene directly from genome DNA of human mononuclear cell in peripheral blood by PCR for the first time. Results A human CD14 gene about 1.1kb was successfully amplified from genome DNA of human mononuclear cell in peripheral blood, and the sequence analysis has indicated that the CD14 gene cloned in this way is the same as the sequence reported by other authors. Conclusion It is a simple and effective method to obtain human CD14 gene from genome DNA of human mononuclear cell in peripheral blood.
, 百拇医药
【Key words】 mononuclear cell; CD14 gene; sequencing
细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌外膜层的主要成分，是引起人和实验动物败血症的主要致病因素。LPS的毒性作用主要是通过与宿主细胞表面的CD14受体(mCD14)以及体液中可溶性的CD14(sCD14)结合，经尚未明了的信号传导机理激活宿主细胞来实现的，因此CD14是革兰阴性细菌感染后，引起机体组织细胞的损害和免疫功能紊乱，诱发全身炎症反应综合征的关键分子。我们采用了PCR技术，从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增出人CD14基因，并且经基因序列测定表明，我们克隆的人CD14基因序列与文献报道完全相同[1]，为进一步确定LPS的作用机理以及寻找LPS的拮抗药物奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 RPML-1640培养基、淋巴细胞分层液(上海试剂二厂)、植物血凝素(广东医药工业研究所)；rIL-2由四川省肿瘤研究所提供；蛋白酶K、RnaseA和琼脂糖均为Sigma产品；dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR Marker、λ DNA/EcoRI+Hind Ⅲ均为华美公司产品；其余试剂均为国内或进口分析纯。
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1.2 人外周血单个核细胞分离、培养 取健康人外周新鲜血(成都市中心血站提供)，用淋巴细胞分层液分离单个核细胞，离心，洗涤，镜检，用RPMI-1640完全培养基，含植物血凝素50 mg/L，rIL-2 1000 μ/ml，于37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱培养7天。
1.3 人外周血单个核细胞基因组DNA的提取
1.3.1 取培养的人外周血单个核细胞离心25 000 r/min×10 min，收集细胞，用0.01 mol/L PBS(pH7.2)洗涤、离心，弃上清。
1.3.2 取沉淀加细胞裂解液(100 μg/ml蛋白酶K，10 mmol/L Tris-C1 pH8.0，15 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA pH8.0，0.4% SDS)800 μl重悬细胞，37℃保温24h。
, 百拇医药
1.3.3 加450 μl平衡酚，混匀，离心，5000 r/min×10 min。
1.3.4 转移上层水相，重复酚抽提1次。
1.3.5 转移上层水相，加入450 μl氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，离心，5000 r/min×10 min。
1.3.6 转移上层水相，加入1/10体积3 mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置-20℃ 60 min后离心10 000r/min×10 min。
1.3.7 以体积分数为0.70乙醇洗涤2次，真空抽干，沉淀溶入100 μl含Rnase A的TE(Rnase A的终浓度为20 μg/ml)缓冲液中，取5 μl作1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(以λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ为标准品)余置-20℃保存备用。
, 百拇医药
1.4 PCR引物的设计与合成 根据文献[1，2]报道的人CD14基因序列设计1对扩增引物，其上游引物P1为：5′-ATAGTCGACATGGAGCGCGCGTCCTG-CTTG，其中含该基因起始密码和SaⅡ酶切位点；下游引物P2为：5′-ATATCTAGACTGTCTTGGATC-TTAGGC，其中含该基因终止密码和XbaⅠ酶切位点。引物由美国Life Technologies公司合成。
1.5 PCR扩增人CD14基因 以基因组DNA作为扩增模板，在0.2 ml PCR反应管中依次加入26.5 μl超纯水，15 μl 10×PCR反应缓冲液，10 μl dNTP(A、G、C、T各2.5 mmol/L)，Taq酶2 U(1 U/μl)，P1、P2各20 μl(3 pmol/μl)，模板5 μl，MgCl2：1.5 μl(25 mmol/L)，PCR扩增程序为：94℃变性5 min；95℃ 45 s，65℃ 45 s，72℃ 2 min，30个循环72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μl作1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(以PCR Marker为标准品)余置-20℃保存备用。
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1.6 PCR产物的基因序列测定 由TaKaRa Biotech Company测定。
2 结果
2.1 提取的人外周血单个核细胞基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测表明无降解，无RNA残留(图1)。
图1 人大颗粒淋巴细胞基因组DNA 1：人大颗粒淋巴细胞基因组DNA；
2：λDNA/Hind Ⅲ+EcoR I分子量标准
Fig 1 Human large granular lymphocyte genome DNA lane 1:human large granular lymphocyte genome DNA; lane 2：λDNA/Hind Ⅲ+EcoR I marker
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2.2 以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板，经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测出现1条清晰的DNA条带(图2)，大小约1.1 kb，与文献报道人CD14基因大小相符。
图2 PCR扩增人CD14基因 1：PCR扩增人CD14基因；2：PCR分子量标准
Fig 2 Amplification human CD14 gene by PCR lane 1:amplification human CD14 gene by PCR; lane 2:PCR marker
2.3 PCR扩增的人CD14基因经基因序列测定，基因序列与文献[1]报道完全相同。
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3 讨论
CD14是一种分子量为5 5000的糖蛋白，包括mCD14和sCD14两种形式，mCD14主要以膜结合形式存在于单核/巨噬细胞表面，sCD14存在于体液中，与mCD14的胞外区段结构相同，可能是由单核/巨噬细胞分泌或mCD14的胞外区段脱落进入血循环。 sCD14的主要功能是使缺乏mCD14的细胞发生变化而被低浓度LPS激活。如：上皮细胞、内皮细胞等。由于mCD14大量存在于单个核细胞表面，因此，我们取材选用了外周血单个核细胞。
人CD14基因由两个外显子编码，其中第1个外显子只含起始密码子ATG[1]，因此，考虑可采用PCR技术从基因组DNA中扩增CD14基因。实验结果证明我们的设想是正确的，我们从人外周血单个核细胞基因组DNA中克隆了人的CD14基因，这一方法较国内、外研究者为获得CD14基因而普遍用CHO等细胞经诱导培养后提取细胞mRNA，再经RT-PCR方法获得的方法，要简便易行，并且取材方便。
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CD14作为主要的LPS受体，在革兰阴性细菌引起的炎症反应和败血症中起重要的信号传导作用，LPS的毒性作用主要借助CD14介导的信号传导激活宿主细胞，产生生物活性脂质、氧自由基及炎症预激细胞因子，(如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、γ干扰素等)，造成组织细胞损害及机体免疫功能紊乱。目前研究发现，革兰阳性菌的胞壁成分以及莱姆病螺旋体脂蛋白等也可通过与CD14结合而激活宿主细胞[3，4]，造成机体组织细胞的损害和免疫功能紊乱。因此，CD14是参与病原菌感染所致机体损害、免疫功能紊乱以及全身炎症反应综合征的关键分子。我们采用PCR技术从人外周血单个核细胞基因组DNA中克隆了CD14基因，基因分析表明我们所克隆的人CD14基因应能表达具有生理功能的CD14，为进一步研究LPS的作用机理以及寻找LPS的拮抗药物提供了保证。
基金项目：国家自然科学基金(39770663)；四川省学术和技术带头人培养基金(4989923)
参考文献
, 百拇医药
[1]Ferrero E, Goyert SM. Nucleotide sequence of the gene encoding the monocyte differentiation antigen, CD14. Nucleic Acids Res, 1988,15(9)∶4173.
[2]Simmons DL, Tan S, Tener DG, et al.Monocyte antigen CD14 is a phospholipid anchored membrane protein. Blood, 1989,73(1)∶284-289.
[3]Pugin J, Heumann ID, Tomasz A, et al.CD14 in a patter recognition receptor. Immunity, 1994,1(6)∶509-516.
[4]Gluliermo H, Giambartolomei vida A, Dennis Barbara L, et al.Induction of pro- and anti-Inflammatory cytokines by Borrelia Burgdorferi lipoproteins in monocytes is mediated by CD14. Infection Immunity, 1999,67(1)∶140-147.
收稿日期：1999-07-06, http://www.100md.com
单位：张万江(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；鲍朗(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；邱洪宇(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；晏菊芳(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；胡昌华(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)；张会东(610041 成都，华西医科大学感染免疫研究室)
关键词：单个核细胞；CD14基因；序列测定
中华医学遗传学杂志 CHINESE JOURNAL OF MEDICAL GENETICS 2000 Vol 【摘要】 目的 介绍一种获取人CD14基因的简易方法。方法 利用CD14基因组成的特点，采用聚合酶链反应技术以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板扩增获取人CD14基因。结果 从人外周血单个核细胞基因组DNA中成功扩增出大小约1.1 kb的人CD14基因，并且经基因序列测定表明，克隆的人CD14基因序列与文献报道完全相同。结论 以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板，扩增人CD14基因的方法是一种获取CD14基因简捷、有效的方法。
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Amplification and sequence of human CD14 gene from human mononuclear cell in peripheral blood*
ZHANG Wanjiang BAO Lang, QIU Hongyu YAN Jufang HU Changhua ZHANG Huidong. (Research Unit of Infection & Immunity, West China University of Medical Sciences, Chengdu,Sichuan,610041 P.R.China. E-mail:Baolang@wcums.edu.cn)
【Abstract】 Objective To introduce a new method for getting human CD14 gene.Methods Based on the character of CD14 gene, the authors amplified the CD14 gene directly from genome DNA of human mononuclear cell in peripheral blood by PCR for the first time. Results A human CD14 gene about 1.1kb was successfully amplified from genome DNA of human mononuclear cell in peripheral blood, and the sequence analysis has indicated that the CD14 gene cloned in this way is the same as the sequence reported by other authors. Conclusion It is a simple and effective method to obtain human CD14 gene from genome DNA of human mononuclear cell in peripheral blood.
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【Key words】 mononuclear cell; CD14 gene; sequencing
细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌外膜层的主要成分，是引起人和实验动物败血症的主要致病因素。LPS的毒性作用主要是通过与宿主细胞表面的CD14受体(mCD14)以及体液中可溶性的CD14(sCD14)结合，经尚未明了的信号传导机理激活宿主细胞来实现的，因此CD14是革兰阴性细菌感染后，引起机体组织细胞的损害和免疫功能紊乱，诱发全身炎症反应综合征的关键分子。我们采用了PCR技术，从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增出人CD14基因，并且经基因序列测定表明，我们克隆的人CD14基因序列与文献报道完全相同[1]，为进一步确定LPS的作用机理以及寻找LPS的拮抗药物奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 RPML-1640培养基、淋巴细胞分层液(上海试剂二厂)、植物血凝素(广东医药工业研究所)；rIL-2由四川省肿瘤研究所提供；蛋白酶K、RnaseA和琼脂糖均为Sigma产品；dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR Marker、λ DNA/EcoRI+Hind Ⅲ均为华美公司产品；其余试剂均为国内或进口分析纯。
, http://www.100md.com
1.2 人外周血单个核细胞分离、培养 取健康人外周新鲜血(成都市中心血站提供)，用淋巴细胞分层液分离单个核细胞，离心，洗涤，镜检，用RPMI-1640完全培养基，含植物血凝素50 mg/L，rIL-2 1000 μ/ml，于37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱培养7天。
1.3 人外周血单个核细胞基因组DNA的提取
1.3.1 取培养的人外周血单个核细胞离心25 000 r/min×10 min，收集细胞，用0.01 mol/L PBS(pH7.2)洗涤、离心，弃上清。
1.3.2 取沉淀加细胞裂解液(100 μg/ml蛋白酶K，10 mmol/L Tris-C1 pH8.0，15 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA pH8.0，0.4% SDS)800 μl重悬细胞，37℃保温24h。
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1.3.3 加450 μl平衡酚，混匀，离心，5000 r/min×10 min。
1.3.4 转移上层水相，重复酚抽提1次。
1.3.5 转移上层水相，加入450 μl氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，离心，5000 r/min×10 min。
1.3.6 转移上层水相，加入1/10体积3 mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置-20℃ 60 min后离心10 000r/min×10 min。
1.3.7 以体积分数为0.70乙醇洗涤2次，真空抽干，沉淀溶入100 μl含Rnase A的TE(Rnase A的终浓度为20 μg/ml)缓冲液中，取5 μl作1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(以λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ为标准品)余置-20℃保存备用。
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1.4 PCR引物的设计与合成 根据文献[1，2]报道的人CD14基因序列设计1对扩增引物，其上游引物P1为：5′-ATAGTCGACATGGAGCGCGCGTCCTG-CTTG，其中含该基因起始密码和SaⅡ酶切位点；下游引物P2为：5′-ATATCTAGACTGTCTTGGATC-TTAGGC，其中含该基因终止密码和XbaⅠ酶切位点。引物由美国Life Technologies公司合成。
1.5 PCR扩增人CD14基因 以基因组DNA作为扩增模板，在0.2 ml PCR反应管中依次加入26.5 μl超纯水，15 μl 10×PCR反应缓冲液，10 μl dNTP(A、G、C、T各2.5 mmol/L)，Taq酶2 U(1 U/μl)，P1、P2各20 μl(3 pmol/μl)，模板5 μl，MgCl2：1.5 μl(25 mmol/L)，PCR扩增程序为：94℃变性5 min；95℃ 45 s，65℃ 45 s，72℃ 2 min，30个循环72℃延伸10 min。反应结束后，取5 μl作1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(以PCR Marker为标准品)余置-20℃保存备用。
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1.6 PCR产物的基因序列测定 由TaKaRa Biotech Company测定。
2 结果
2.1 提取的人外周血单个核细胞基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测表明无降解，无RNA残留(图1)。
图1 人大颗粒淋巴细胞基因组DNA 1：人大颗粒淋巴细胞基因组DNA；
2：λDNA/Hind Ⅲ+EcoR I分子量标准
Fig 1 Human large granular lymphocyte genome DNA lane 1:human large granular lymphocyte genome DNA; lane 2：λDNA/Hind Ⅲ+EcoR I marker
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2.2 以人外周血单个核细胞基因组DNA为模板，经PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测出现1条清晰的DNA条带(图2)，大小约1.1 kb，与文献报道人CD14基因大小相符。
图2 PCR扩增人CD14基因 1：PCR扩增人CD14基因；2：PCR分子量标准
Fig 2 Amplification human CD14 gene by PCR lane 1:amplification human CD14 gene by PCR; lane 2:PCR marker
2.3 PCR扩增的人CD14基因经基因序列测定，基因序列与文献[1]报道完全相同。
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3 讨论
CD14是一种分子量为5 5000的糖蛋白，包括mCD14和sCD14两种形式，mCD14主要以膜结合形式存在于单核/巨噬细胞表面，sCD14存在于体液中，与mCD14的胞外区段结构相同，可能是由单核/巨噬细胞分泌或mCD14的胞外区段脱落进入血循环。 sCD14的主要功能是使缺乏mCD14的细胞发生变化而被低浓度LPS激活。如：上皮细胞、内皮细胞等。由于mCD14大量存在于单个核细胞表面，因此，我们取材选用了外周血单个核细胞。
人CD14基因由两个外显子编码，其中第1个外显子只含起始密码子ATG[1]，因此，考虑可采用PCR技术从基因组DNA中扩增CD14基因。实验结果证明我们的设想是正确的，我们从人外周血单个核细胞基因组DNA中克隆了人的CD14基因，这一方法较国内、外研究者为获得CD14基因而普遍用CHO等细胞经诱导培养后提取细胞mRNA，再经RT-PCR方法获得的方法，要简便易行，并且取材方便。
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CD14作为主要的LPS受体，在革兰阴性细菌引起的炎症反应和败血症中起重要的信号传导作用，LPS的毒性作用主要借助CD14介导的信号传导激活宿主细胞，产生生物活性脂质、氧自由基及炎症预激细胞因子，(如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、γ干扰素等)，造成组织细胞损害及机体免疫功能紊乱。目前研究发现，革兰阳性菌的胞壁成分以及莱姆病螺旋体脂蛋白等也可通过与CD14结合而激活宿主细胞[3，4]，造成机体组织细胞的损害和免疫功能紊乱。因此，CD14是参与病原菌感染所致机体损害、免疫功能紊乱以及全身炎症反应综合征的关键分子。我们采用PCR技术从人外周血单个核细胞基因组DNA中克隆了CD14基因，基因分析表明我们所克隆的人CD14基因应能表达具有生理功能的CD14，为进一步研究LPS的作用机理以及寻找LPS的拮抗药物提供了保证。
基金项目：国家自然科学基金(39770663)；四川省学术和技术带头人培养基金(4989923)
参考文献
, 百拇医药
[1]Ferrero E, Goyert SM. Nucleotide sequence of the gene encoding the monocyte differentiation antigen, CD14. Nucleic Acids Res, 1988,15(9)∶4173.
[2]Simmons DL, Tan S, Tener DG, et al.Monocyte antigen CD14 is a phospholipid anchored membrane protein. Blood, 1989,73(1)∶284-289.
[3]Pugin J, Heumann ID, Tomasz A, et al.CD14 in a patter recognition receptor. Immunity, 1994,1(6)∶509-516.
[4]Gluliermo H, Giambartolomei vida A, Dennis Barbara L, et al.Induction of pro- and anti-Inflammatory cytokines by Borrelia Burgdorferi lipoproteins in monocytes is mediated by CD14. Infection Immunity, 1999,67(1)∶140-147.
收稿日期：1999-07-06, http://www.100md.com