中国黑腹果蝇中分离变相因子［Segregation Distorter(SD)］的初步研究
作者：郝莉 顾正龙 戴灼华
单位：北京大学生命科学学院， 北京 100871
关键词：分离变相因子；黑腹果蝇；基因频率；PCR扩增
遗传学报000403
摘要： 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的分离变相因子[Segregation Distorter (SD)]是一种非常典型的具有减数分裂驱动性质的特殊遗传因子。SD在世界不同地区的黑腹果蝇群体中广泛存在，通过杂交的方法测得其频率在1%～5%范围之内。首次在中国北京、青岛采集大量野生黑腹果蝇样本，对SD进行频率测定，发现SD在中国野生黑腹果蝇群体中也广泛存在，且频率与世界其他地区SD频率基本吻合。在此基础之上，进一步从北京北安河地区的黑腹果蝇群体中筛选得到一个SD果蝇品系(SD bah)。采用了PCR扩增SD片段的方法鉴定SD的存在，与传统的杂交方法相比，此法既简便、快速，又准确、可靠，该方法的建立在SD频率测定、SD品系建立及其他研究中具有较高的应用价值。
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中图分类号：Q349+. 55；Q754 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-298-303
The Frequency Distribution and Establishment of Fruit Fly Strain of Segregation Distorter in Drosophila melanogaster in China
HAO Li, GU Zheng-Long, DAI Zhuo-Hua
(College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China)
Abstract: Segregation Distorter (SD) is a meiotic drive system of natural occurrence. Heterozygous SD/SD+ males transmit the SD chromosome in vast excess over the normal homolog. SD chromosomes have been recovered at low frequency (1%～5%) from almost every population that has been screened for them in many places of the world. To examine whether there is SD system in natural populations of Drosophila melanogaster in China, we surveyed a few populations of D. melanogaster in Beijing and Qingdao respectively. The results suggested that SD is also found in every population examined at frequency of 1%～5%. On the basis of learning distribution of SD in China, we established a fruit fly stoch of SD from wild population of D. melanogaster in Beianhe district of Beijing. Furthermore, instead of using traditional genetic hybridization, we used molecular approach, PCR, to examine the distribution of SD chromosomes, which has been proved a very effective, quick and convenient method.
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Key words: Segregation Distorter (SD); Drosophila melanogaster; gene frequency; PCR
1957年，Sandler & Novitski发现个别等位基因在杂合状态时，会以非孟德尔比例分离，导致杂合子产生数量不等的两种配子，于是将这种现象称为减数分裂驱动(meiotic drive)[1，2]。位于Drosophila melanogaster的第II染色体上的分离变相因子(SD)就是一种非常典型的具有减数分裂驱动性质的特殊遗传因子。
SD杂合雄性个体(SD/SD+)的后代中，高达90%～100%的个体都将只携带SD染色体(k＝95%～99%，k值代表一对同源染色体中的某一条在后代中出现的比例，用于衡量分离变相水平的高低)，相反，杂合雌性个体并不表现出分离异常[3，4]。SD广泛存在于世界许多地区的不同D. melanogaster野生群体中，并且具有1%～5%的频率。SD系统横跨第II染色体的着丝粒区域，是一个基因复合体结构，由3个紧密连锁的基因座位Sd、Rsp、E(SD)组成：(1) Sd(segregation distorter)是产生分离变相表型的基因，定位于长11.5kb的EcoRI酶切片段上，与野生型Sd+基因相比多了一5kb串联重复片段，一旦此片段缺失就会导致分离变相表型的丧失[5，6]；(2) Rsp (responder)是Sd的靶基因，具有多种等位基因形式，对Sd的敏感程度呈连续变化，自然界中发现的SD染色体上与Sd连锁的一般都是Rspi(不敏感)，Rsp基因由长度为120bp富含AT的一系列串联重复片段组成，随着重复片段数目的增加，Rsp对Sd的敏感程度也随之增加[3，7，8]； (3)E(SD)是Sd的增强调节基因，它的存在能使分离变相水平大大增加[9]。细胞学分析表明杂合雄性个体之所以产生几乎100%的携带SD的后代，是因为携带SD+染色体的精子在成熟过程中发育异常，最终丧失其生殖功能所致，且与精子发育过程中非正常染色质浓缩有着密切关系[1，10]。最新研究表明，分离变相表型的产生主要是由Sd基因编码的一种缺陷的dRanGAP蛋白所引起，它很可能通过干扰携带Rsps或Rspss精子的正常核质运输过程而导致发育异常。
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研究SD具有十分重要的进化意义。SD只存在于D. melanogaster中，SD中靶基因Rsp串联重复片段数目的扩增是在D. melanogaster物种分化形成之后发生的[2]。世界各地区的不同野生黑腹果蝇群体中存在I型和II型两类SD，其中I型比较原始，主要分布于地中海地区，II型则由I型进化而来，并逐渐扩散至世界其他地区[1，2，12]，因此研究不同群体中的SD的性质有助于我们了解它们之间进化关系。但遗憾的是，在中国这个果蝇资源极其丰富的国家，关于这方面的研究还完全处于空白状态。我们首次对中国大陆尤其是北京地区的野生黑腹果蝇群体是否含有SD进行了调查，并且建立了中国第一个SD果蝇品系，为今后进一步研究不同黑腹果蝇群体中SD的多态性以及SD自身分子进化奠定了基础。值得一提的是，本研究采用了PCR扩增的分子技术，在方法学上为SD的研究开辟了一条新的途径。
1 材料和方法
1.1 材料供SD频率测定所用的野生D. melanogaster，在采集后立即浸泡于95%乙醇中，根据外生殖器特征与其近缘姊妹种D. simulans相鉴别后，在-20℃下保存。作为PCR正对照的SD mad品系果蝇以玉米-琼脂为培养基，于恒温22±1℃培养。果蝇品系及来源详见表1。
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表1 果蝇材料及来源
Table 1 Origin of the materials 种
Species
品系
Strain
采集地
采集者
D.melanogaster
野生 wild type
北京大兴 Daxing,Beijing
郝莉 Hao Li
, 百拇医药
野生 wild type
北京香山 Xiangshan,Beijing
戴灼华，郝莉等 Dai Zhuohua,Hao Li
野生 wild type
北京北安河 Beianhe,Beijing
郝莉，傅正泓等 Hao Li,Fu Zhenghong
野生 wild type
青岛 Qingdao,Shandong
戴灼华 Dai Zhuohua
SD mad
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Wisconsin,U S A
吴仲义赠 Chung-I Wu
1.2 提取基因组DNA 根据果蝇数量的多少分别利用2种不同方法提取。多于5只果蝇的基因组DNA是按照本实验室已建立的常规方法[13]，得到的DNA约为20kb左右的片段(见图1)。单只果蝇基因组DNA的提取方法参照本实验室马云梅等人新建立的微量样品基因组DNA提取方法[14]。
图1 果蝇基因组DNA电泳鉴定
Fig.1 The detection of fruit fly's genomic DNA
1.λDNA/HindⅢ+EcoRI marker;2、3.Drosophila melanogaster's genomic DNA
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1.3 PCR反应 利用Sd基因序列(吴仲义教授提供)合成引物(引物序列及相对位置见图2)，进行PCR扩增，只有携带SD果蝇的基因组DNA才能扩增出约1.1kb的DNA片段。经过反复实验，其反应最佳体系为：34l双蒸水，5μl 10×缓冲液，2μl引物1(2mol/L)，2μl引物2(2mol/L)，4μl 4×dNTP(2.5mmol/L)，1μl Taq DNA多聚酶，2l模板DNA(10只果蝇基因组DNA，若为单只果蝇，模板量需适当增加)；PCR反应最佳条件为，94℃预变性300s，每一循环：94℃变性60s，52℃复性60s，72℃延伸60s，35个循环结束后延伸300s。PCR反应产物利用加有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外透射仪下观察、拍照，Sd基因扩增结果见图3。
图2 Sd基因引物序列及其位置
, 百拇医药 Fig.2 The sequence and location of primers for Sd
图3 Sd基因PCR扩增电泳结果
Fig.3 The product of PCR of Sd
1.λDNA/HindⅢ+EcoRI marker;2.D. melanogaster with Sd;3.D.melanogaster without Sd
1.4 建立SD果蝇品系的杂交步骤从野生黑腹果蝇群体中挑选雄性个体，将其与CyO/sp、Tm3/Sb平衡致死品系的处女蝇进行单对杂交，8d后(其中4d后需将亲本转移至一新培养瓶内)取出亲本。提取其中雄性亲本的基因组DNA，通过PCR扩增以鉴定是否含有SD基因复合体，弃去没有SD的杂交子代。对于证明含有SD的杂交子一代，挑选其中直翅表型的雌(必须是处女蝇)、雄个体进行第二轮单对杂交，约8d后，取出雌、雄亲本，分别鉴定是否携带SD。只有当一对杂交亲本中雌、雄个体都含有SD，此杂交后代才可作为SD品系保留，实验步骤见图4。
, 百拇医药
图4 建立SD品系的步骤
Fig.4 The protocol to establish the SD strain
2 结果与讨论
2.1 SD染色体的鉴定 鉴定SD染色体的传统方法是测定分离变相水平(即k值)的大
小。将野生个体与cnbw/cn bw品系的果蝇进行杂交，获得均为++/cn bw组合的F1，由于只有杂合雄性个体(SD/SD+)才会表现出分离比异常，因此在测定k值的过程中，特别选用F1中的雄性个体与cnbw/cn bw品系的处女蝇进行回交。已知cn bw/cn bw纯合时会使果蝇的眼睛显现白色，杂合状态下仍然表现野生红眼表型。记录回交后代中红眼个体的比例，对不同杂交得出的比例进行算术平均，此数值就可以近似看作k值(15)。当k≈0.5时，携带的不是SD染色体；当k>0.5时，可确定携带了SD染色体。由于此法需要进行杂交以及肉眼鉴别果蝇的眼色，因此工作量很大，且周期较长，给测定大量样本的SD频率带来困难。
, 百拇医药
为此，本研究利用SD研究的最新成果，采取分子生物学手段进行SD染色体的鉴定。由于Sd基因比Sd+基因多出一个5kb串联重复片段(见图5)，并且已知Sd基因序列。在此基础上，合成c51.1A+和Larry-两个引物,它们与染色体同源配对的位置见图5。只有Sd基因能扩增出一个1.1kb的片段，而Sd+基因因为两引物起始合成的方向相反，无法扩增出任何条带。利用此法能准确、快速、有效地获得SD在一未知群体中的频率。这无疑为今后对SD的研究提供了一种非常方便、高效的手段。
图5 引物与Sd基因的对应位置
Fig.5 The locationof primers on Sd
2.2 中国黑腹果蝇中SD的频率 利用PCR扩增的方法可以直接鉴定果蝇基因组DNA中是否含有Sd基因，由于已知SD在世界其他地区野生黑腹果蝇群体中维持一较低且稳定的频率(1%～5%)，为了提高效率，对于大样本量的群体，我们以5～10只果蝇总DNA为单位进行PCR扩增，当某样品呈现阳性结果时，可以认为这5～10只果蝇中有1只为携带SD的果蝇。以北京大兴黑腹果蝇样本为例，样本大小为460只，以5只果蝇为一单位，提取其总DNA，分别进行460/5＝92次PCR扩增鉴定，结果有17个样品为阳性，因而我们认为460只果蝇中有17只携带SD，计算SD频率得17/460＝3.69%。根据这种方法对不同地区采集的野生黑腹果蝇群体中SD的频率进行检测，结果如表2。可以发现，SD在中国，尤其北京地区的野生黑腹果蝇群体的频率与世界其他地区的1%～5%的结果基本一致，但不同地区之间的频率有较大差异。
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表2 SD在中国不同地区的频率
Table 2 The frequency of SD in different populations of D.melanogaster in China 样本来源
Qrigin of sample
频率
Frequency(%)
样本大小(只)}
Size of sample
测定单位(只)
Unit
北京大兴 Daxing,Beijing
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3.69
460
5
北京香山 Xiangshan,Beijing
2.41
540
10
北京北安河 Beianhe,Beijing
5.00
100
1
山东青岛 Qingdao,Shandong
, 百拇医药
0.67
330
10
SD染色体由于其分离变相作用，应该逐渐在群体中占有优势，但实际上在SD/SD纯合个体致死的选择压的作用下，SD无法扩散至整个群体。因而，这种因素还不能完全解释在自然群体中SD仅维持在一较低的频率(1%～5%)范围内的原因，必然存在其他因素控制SD频率处于这样一种平衡状态。为了能尽快找到控制SD频率的其他因素，我们在现有的研究结果基础上，将进一步开展一些生态学及群体遗传学方面的研究工作，例如在同一地区、不同季节条件下测定SD的频率，观察其波动规律，研究温度、湿度、食物种类等各种生态因素对SD在野生果蝇群体中频率的影响等等，以便最终决定SD在群体中的平衡模式。
2.3 SD bah品系的建立 对采自北京北安河(bah)地区的野生黑腹果蝇进行筛选，挑选100只雄性个体，分别与CyO/sp, Tm3/Sb平衡致死品系的处女蝇进行第1轮单对杂交，8d后，分别对这100只雄性亲本进行PCR扩增，从中筛选出5只含有SD的果蝇。对其中2个果蝇的杂交后代进行第2轮杂交，即在每个杂交后代中挑选直翅表型的雌、雄个体进行单对杂交，8d后，分别对每对杂交的雌、雄亲本进行PCR扩增以鉴定SD存在与否，最终获得一个父、母亲本均携带SD的果蝇品系，这就是我们所建立的SD果蝇品系，命名为SD bah。此品系父本、子一代及子二代的SD扩增结果见图6。
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图6 SD bah品系父本、子一代、子二代SD扩增结果
Fig.6 The SD PCR product of parents,F1 and F2 of SD bah stoch
1.parents; 2.F1; 3.F2; 4.λDNA/HindⅢ+EcoRI marker; 5.SD mad
中国SD果蝇品系的建立为今后进一步深入研究SD在不同果蝇群体中的遗传多态性以及SD自身的分子进化奠定了基础。值得一提的是，SD bah品系是通过分子方法鉴定SD存在而建立的，因此若需了解这个品系的分离变相水平的高低还需利用传统的杂交方法进一步加以确定。
致谢： 本研究得到了芝加哥大学吴仲义教授的热情指导和无私帮助，谨表谢意。
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参考文献
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[3]Ganetzky B. On the components of Segregation Distortion in Drosophila melanogaster. Genetics, 1977, 86: 321～355.
, 百拇医药
[4]Temin R G, Marthas M. Factors influencing the effect of Segregation Distortion in natural populations of Drosophila melanogaster. Genetics, 1984, 107: 375～393.
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[13]J 萨姆布鲁克， E F 弗里奇. 分子克隆实验指南(第二版)， 1992， 463～469.
[14]马云梅. Chelex®100提取果蝇非新鲜标本核基因组方法的建立. 北京大学学报， 1998 34： 841～843., http://www.100md.com
单位：北京大学生命科学学院， 北京 100871
关键词：分离变相因子；黑腹果蝇；基因频率；PCR扩增
遗传学报000403
摘要： 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的分离变相因子[Segregation Distorter (SD)]是一种非常典型的具有减数分裂驱动性质的特殊遗传因子。SD在世界不同地区的黑腹果蝇群体中广泛存在，通过杂交的方法测得其频率在1%～5%范围之内。首次在中国北京、青岛采集大量野生黑腹果蝇样本，对SD进行频率测定，发现SD在中国野生黑腹果蝇群体中也广泛存在，且频率与世界其他地区SD频率基本吻合。在此基础之上，进一步从北京北安河地区的黑腹果蝇群体中筛选得到一个SD果蝇品系(SD bah)。采用了PCR扩增SD片段的方法鉴定SD的存在，与传统的杂交方法相比，此法既简便、快速，又准确、可靠，该方法的建立在SD频率测定、SD品系建立及其他研究中具有较高的应用价值。
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中图分类号：Q349+. 55；Q754 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-298-303
The Frequency Distribution and Establishment of Fruit Fly Strain of Segregation Distorter in Drosophila melanogaster in China
HAO Li, GU Zheng-Long, DAI Zhuo-Hua
(College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China)
Abstract: Segregation Distorter (SD) is a meiotic drive system of natural occurrence. Heterozygous SD/SD+ males transmit the SD chromosome in vast excess over the normal homolog. SD chromosomes have been recovered at low frequency (1%～5%) from almost every population that has been screened for them in many places of the world. To examine whether there is SD system in natural populations of Drosophila melanogaster in China, we surveyed a few populations of D. melanogaster in Beijing and Qingdao respectively. The results suggested that SD is also found in every population examined at frequency of 1%～5%. On the basis of learning distribution of SD in China, we established a fruit fly stoch of SD from wild population of D. melanogaster in Beianhe district of Beijing. Furthermore, instead of using traditional genetic hybridization, we used molecular approach, PCR, to examine the distribution of SD chromosomes, which has been proved a very effective, quick and convenient method.
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Key words: Segregation Distorter (SD); Drosophila melanogaster; gene frequency; PCR
1957年，Sandler & Novitski发现个别等位基因在杂合状态时，会以非孟德尔比例分离，导致杂合子产生数量不等的两种配子，于是将这种现象称为减数分裂驱动(meiotic drive)[1，2]。位于Drosophila melanogaster的第II染色体上的分离变相因子(SD)就是一种非常典型的具有减数分裂驱动性质的特殊遗传因子。
SD杂合雄性个体(SD/SD+)的后代中，高达90%～100%的个体都将只携带SD染色体(k＝95%～99%，k值代表一对同源染色体中的某一条在后代中出现的比例，用于衡量分离变相水平的高低)，相反，杂合雌性个体并不表现出分离异常[3，4]。SD广泛存在于世界许多地区的不同D. melanogaster野生群体中，并且具有1%～5%的频率。SD系统横跨第II染色体的着丝粒区域，是一个基因复合体结构，由3个紧密连锁的基因座位Sd、Rsp、E(SD)组成：(1) Sd(segregation distorter)是产生分离变相表型的基因，定位于长11.5kb的EcoRI酶切片段上，与野生型Sd+基因相比多了一5kb串联重复片段，一旦此片段缺失就会导致分离变相表型的丧失[5，6]；(2) Rsp (responder)是Sd的靶基因，具有多种等位基因形式，对Sd的敏感程度呈连续变化，自然界中发现的SD染色体上与Sd连锁的一般都是Rspi(不敏感)，Rsp基因由长度为120bp富含AT的一系列串联重复片段组成，随着重复片段数目的增加，Rsp对Sd的敏感程度也随之增加[3，7，8]； (3)E(SD)是Sd的增强调节基因，它的存在能使分离变相水平大大增加[9]。细胞学分析表明杂合雄性个体之所以产生几乎100%的携带SD的后代，是因为携带SD+染色体的精子在成熟过程中发育异常，最终丧失其生殖功能所致，且与精子发育过程中非正常染色质浓缩有着密切关系[1，10]。最新研究表明，分离变相表型的产生主要是由Sd基因编码的一种缺陷的dRanGAP蛋白所引起，它很可能通过干扰携带Rsps或Rspss精子的正常核质运输过程而导致发育异常。
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研究SD具有十分重要的进化意义。SD只存在于D. melanogaster中，SD中靶基因Rsp串联重复片段数目的扩增是在D. melanogaster物种分化形成之后发生的[2]。世界各地区的不同野生黑腹果蝇群体中存在I型和II型两类SD，其中I型比较原始，主要分布于地中海地区，II型则由I型进化而来，并逐渐扩散至世界其他地区[1，2，12]，因此研究不同群体中的SD的性质有助于我们了解它们之间进化关系。但遗憾的是，在中国这个果蝇资源极其丰富的国家，关于这方面的研究还完全处于空白状态。我们首次对中国大陆尤其是北京地区的野生黑腹果蝇群体是否含有SD进行了调查，并且建立了中国第一个SD果蝇品系，为今后进一步研究不同黑腹果蝇群体中SD的多态性以及SD自身分子进化奠定了基础。值得一提的是，本研究采用了PCR扩增的分子技术，在方法学上为SD的研究开辟了一条新的途径。
1 材料和方法
1.1 材料供SD频率测定所用的野生D. melanogaster，在采集后立即浸泡于95%乙醇中，根据外生殖器特征与其近缘姊妹种D. simulans相鉴别后，在-20℃下保存。作为PCR正对照的SD mad品系果蝇以玉米-琼脂为培养基，于恒温22±1℃培养。果蝇品系及来源详见表1。
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表1 果蝇材料及来源
Table 1 Origin of the materials 种
Species
品系
Strain
采集地
采集者
D.melanogaster
野生 wild type
北京大兴 Daxing,Beijing
郝莉 Hao Li
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野生 wild type
北京香山 Xiangshan,Beijing
戴灼华，郝莉等 Dai Zhuohua,Hao Li
野生 wild type
北京北安河 Beianhe,Beijing
郝莉，傅正泓等 Hao Li,Fu Zhenghong
野生 wild type
青岛 Qingdao,Shandong
戴灼华 Dai Zhuohua
SD mad
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Wisconsin,U S A
吴仲义赠 Chung-I Wu
1.2 提取基因组DNA 根据果蝇数量的多少分别利用2种不同方法提取。多于5只果蝇的基因组DNA是按照本实验室已建立的常规方法[13]，得到的DNA约为20kb左右的片段(见图1)。单只果蝇基因组DNA的提取方法参照本实验室马云梅等人新建立的微量样品基因组DNA提取方法[14]。
图1 果蝇基因组DNA电泳鉴定
Fig.1 The detection of fruit fly's genomic DNA
1.λDNA/HindⅢ+EcoRI marker;2、3.Drosophila melanogaster's genomic DNA
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1.3 PCR反应 利用Sd基因序列(吴仲义教授提供)合成引物(引物序列及相对位置见图2)，进行PCR扩增，只有携带SD果蝇的基因组DNA才能扩增出约1.1kb的DNA片段。经过反复实验，其反应最佳体系为：34l双蒸水，5μl 10×缓冲液，2μl引物1(2mol/L)，2μl引物2(2mol/L)，4μl 4×dNTP(2.5mmol/L)，1μl Taq DNA多聚酶，2l模板DNA(10只果蝇基因组DNA，若为单只果蝇，模板量需适当增加)；PCR反应最佳条件为，94℃预变性300s，每一循环：94℃变性60s，52℃复性60s，72℃延伸60s，35个循环结束后延伸300s。PCR反应产物利用加有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外透射仪下观察、拍照，Sd基因扩增结果见图3。
图2 Sd基因引物序列及其位置
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图3 Sd基因PCR扩增电泳结果
Fig.3 The product of PCR of Sd
1.λDNA/HindⅢ+EcoRI marker;2.D. melanogaster with Sd;3.D.melanogaster without Sd
1.4 建立SD果蝇品系的杂交步骤从野生黑腹果蝇群体中挑选雄性个体，将其与CyO/sp、Tm3/Sb平衡致死品系的处女蝇进行单对杂交，8d后(其中4d后需将亲本转移至一新培养瓶内)取出亲本。提取其中雄性亲本的基因组DNA，通过PCR扩增以鉴定是否含有SD基因复合体，弃去没有SD的杂交子代。对于证明含有SD的杂交子一代，挑选其中直翅表型的雌(必须是处女蝇)、雄个体进行第二轮单对杂交，约8d后，取出雌、雄亲本，分别鉴定是否携带SD。只有当一对杂交亲本中雌、雄个体都含有SD，此杂交后代才可作为SD品系保留，实验步骤见图4。
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图4 建立SD品系的步骤
Fig.4 The protocol to establish the SD strain
2 结果与讨论
2.1 SD染色体的鉴定 鉴定SD染色体的传统方法是测定分离变相水平(即k值)的大
小。将野生个体与cnbw/cn bw品系的果蝇进行杂交，获得均为++/cn bw组合的F1，由于只有杂合雄性个体(SD/SD+)才会表现出分离比异常，因此在测定k值的过程中，特别选用F1中的雄性个体与cnbw/cn bw品系的处女蝇进行回交。已知cn bw/cn bw纯合时会使果蝇的眼睛显现白色，杂合状态下仍然表现野生红眼表型。记录回交后代中红眼个体的比例，对不同杂交得出的比例进行算术平均，此数值就可以近似看作k值(15)。当k≈0.5时，携带的不是SD染色体；当k>0.5时，可确定携带了SD染色体。由于此法需要进行杂交以及肉眼鉴别果蝇的眼色，因此工作量很大，且周期较长，给测定大量样本的SD频率带来困难。
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为此，本研究利用SD研究的最新成果，采取分子生物学手段进行SD染色体的鉴定。由于Sd基因比Sd+基因多出一个5kb串联重复片段(见图5)，并且已知Sd基因序列。在此基础上，合成c51.1A+和Larry-两个引物,它们与染色体同源配对的位置见图5。只有Sd基因能扩增出一个1.1kb的片段，而Sd+基因因为两引物起始合成的方向相反，无法扩增出任何条带。利用此法能准确、快速、有效地获得SD在一未知群体中的频率。这无疑为今后对SD的研究提供了一种非常方便、高效的手段。
图5 引物与Sd基因的对应位置
Fig.5 The locationof primers on Sd
2.2 中国黑腹果蝇中SD的频率 利用PCR扩增的方法可以直接鉴定果蝇基因组DNA中是否含有Sd基因，由于已知SD在世界其他地区野生黑腹果蝇群体中维持一较低且稳定的频率(1%～5%)，为了提高效率，对于大样本量的群体，我们以5～10只果蝇总DNA为单位进行PCR扩增，当某样品呈现阳性结果时，可以认为这5～10只果蝇中有1只为携带SD的果蝇。以北京大兴黑腹果蝇样本为例，样本大小为460只，以5只果蝇为一单位，提取其总DNA，分别进行460/5＝92次PCR扩增鉴定，结果有17个样品为阳性，因而我们认为460只果蝇中有17只携带SD，计算SD频率得17/460＝3.69%。根据这种方法对不同地区采集的野生黑腹果蝇群体中SD的频率进行检测，结果如表2。可以发现，SD在中国，尤其北京地区的野生黑腹果蝇群体的频率与世界其他地区的1%～5%的结果基本一致，但不同地区之间的频率有较大差异。
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表2 SD在中国不同地区的频率
Table 2 The frequency of SD in different populations of D.melanogaster in China 样本来源
Qrigin of sample
频率
Frequency(%)
样本大小(只)}
Size of sample
测定单位(只)
Unit
北京大兴 Daxing,Beijing
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3.69
460
5
北京香山 Xiangshan,Beijing
2.41
540
10
北京北安河 Beianhe,Beijing
5.00
100
1
山东青岛 Qingdao,Shandong
, 百拇医药
0.67
330
10
SD染色体由于其分离变相作用，应该逐渐在群体中占有优势，但实际上在SD/SD纯合个体致死的选择压的作用下，SD无法扩散至整个群体。因而，这种因素还不能完全解释在自然群体中SD仅维持在一较低的频率(1%～5%)范围内的原因，必然存在其他因素控制SD频率处于这样一种平衡状态。为了能尽快找到控制SD频率的其他因素，我们在现有的研究结果基础上，将进一步开展一些生态学及群体遗传学方面的研究工作，例如在同一地区、不同季节条件下测定SD的频率，观察其波动规律，研究温度、湿度、食物种类等各种生态因素对SD在野生果蝇群体中频率的影响等等，以便最终决定SD在群体中的平衡模式。
2.3 SD bah品系的建立 对采自北京北安河(bah)地区的野生黑腹果蝇进行筛选，挑选100只雄性个体，分别与CyO/sp, Tm3/Sb平衡致死品系的处女蝇进行第1轮单对杂交，8d后，分别对这100只雄性亲本进行PCR扩增，从中筛选出5只含有SD的果蝇。对其中2个果蝇的杂交后代进行第2轮杂交，即在每个杂交后代中挑选直翅表型的雌、雄个体进行单对杂交，8d后，分别对每对杂交的雌、雄亲本进行PCR扩增以鉴定SD存在与否，最终获得一个父、母亲本均携带SD的果蝇品系，这就是我们所建立的SD果蝇品系，命名为SD bah。此品系父本、子一代及子二代的SD扩增结果见图6。
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图6 SD bah品系父本、子一代、子二代SD扩增结果
Fig.6 The SD PCR product of parents,F1 and F2 of SD bah stoch
1.parents; 2.F1; 3.F2; 4.λDNA/HindⅢ+EcoRI marker; 5.SD mad
中国SD果蝇品系的建立为今后进一步深入研究SD在不同果蝇群体中的遗传多态性以及SD自身的分子进化奠定了基础。值得一提的是，SD bah品系是通过分子方法鉴定SD存在而建立的，因此若需了解这个品系的分离变相水平的高低还需利用传统的杂交方法进一步加以确定。
致谢： 本研究得到了芝加哥大学吴仲义教授的热情指导和无私帮助，谨表谢意。
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