猪肥胖基因cDNA的克隆与分析
作者：戴茹娟 李宁 吴常信
单位：戴茹娟 吴常信(中国农业大学动物科技学院，北京 100094)；李宁(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京 100094)
关键词：ob基因；Leptin蛋白；猪脂肪cDNA文库
遗传学报000402
摘要：肥胖基因(ob)是近年刚被克隆的新基因，该基因产物Leptin是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子。首次报道猪ob基因全长序列，并对不同物种ob基因的同源性进行了比较。以 Uni朲APTM为载体构建了猪脂肪cDNA文库，根据已知的人和鼠ob基因序列设计PCR引物，利用PCR法筛选猪脂肪cDNA文库，并用RT-CR从脂肪RNA中扩增的366bp猪ob基因片段作探针，获得了全长3 277bp的猪ob基因cDNA的克隆和序列。ob基因序列在不同的物种之间具有很强的保守性。猪与人和鼠ob基因编码区核苷酸序列的同源性分别为88.5%和84.7%；猪ob基因编码的Leptin蛋白氨基酸序列和人、鼠Leptin蛋白的同源性分别为86.0%和83.4%。RT-CR分析表明：猪ob基因不仅在脂肪组织中大量表达，而且在肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肌肉组织中也有微量表达。表明猪ob基因的表达调控与人和鼠可能存在差异。
, 百拇医药
中图分类号：Q343 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-0290-297
Molecular Cloning and Analysing of Porcine Obese cDNA
DAI Ru-Juan, WU Chang-Xin
(College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)
LI Ning
(National Laboratories for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)
, 百拇医药
Abstract: Obese gene (ob) is a novel gene cloned recently. The product of ob geneLeptin is an important signal reflecting body fat mass and controlling body weight. In this study the complete nucleotide sequences of porcine ob cDNA were identified, and the homology with ob genes from other species was also compared. The porcine fat cDNA was constructed based on λUni-ZAPTM system. The primers designed on the consensus region of human and mouse ob gene were employed to perform PCR-screening of the cDNA library, and a 366bp DNA fragment amplified from total RNA of pig fat cells was used to confirm positives as a hybridization probe. The complete ob cDNA with 3277bp in length was cloned and sequenced . The nucleotide sequences of ob genes between different species were very conservative. The overall identity of ob nucleotide sequences was 88.5% between pig and human, 84.7% between pig and mouse. The homology of ob amino acid sequences was 86.0% between pig and human. 83.4% between pig and mouse. The result of RT-PCR for transcripts detection of pig ob gene indicate that ob gene was expressed not only mainly in adipose tissue but also slightly in other tissues such as kidney, liver, spleen,heart and muscle, which imply that expression nature of pig ob gene is different from that of human and mouse ob gene.
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Key words: ob gene; Leptin protein; porcine fat cDNA library
不同猪种在脂肪蓄积能力方面差异比较大，西方商业猪种大都为瘦肉型，瘦肉率基本都在55%～60%以上，而我国大部分地方猪种为脂肪型，瘦肉率只有45%～50%左右，表明我国地方猪种具有较强的脂肪蓄积能力[1]。脂肪型和瘦肉型猪在脂肪含量上的巨大差异，虽然受环境和饲料的影响，但主要还是二者的遗传背景的差异造成的。长久以来，动物遗传育种工作者希望能找到影响猪生长和脂肪蓄积的主基因，并对一些影响脂肪合成和代谢的激素和酶的基因进行了分析，如生长激素、乙酰辅酶A等等，没有发现这些基因对脂肪蓄积具有主基因效应。
肥胖基因(Obese: ob)于1954年在小鼠中发现，为常染色体隐性遗传。1994年，小鼠和人ob基因的克隆和分析充分证明了ob/ob肥胖型小鼠的肥胖表型是由于ob基因的遗传变异而不能产生正常蛋白产物造成的。ob基因的产物“瘦蛋白”(Leptin)主要作用于大脑的摄食和饱食中枢，对体脂的蓄积进行反馈调控，对体重、体内脂肪蓄积和摄食行为有重要调节作用[2]。科学家们利用重组的人与鼠Leptin蛋白，对肥胖型小鼠(ob/ob)进行处理，可明显改善ob/ob小鼠的肥胖表型，体重在3周内下降40%，正常小鼠的体重由于Leptin蛋白的处理也下降了12%[3～5]。
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考虑到ob基因产物可以反映体内脂肪含量信息及调节体重，我们推测猪ob基因有可能是影响猪生长和脂肪蓄积的数量性状位点，它的克隆和分析将对猪的育种和提高瘦肉生产率有重要意义。在猪的育种生产过程中，我们发现猪的瘦肉生长率的选择提高总是与饲料转换率的降低相联系，这一现象尤其在猪自由采食时更明显。解释这一现象的假设有可能是Leptin蛋白的表达和作用是被紧密连在一起调控的。猪的ob基因位点有可能是潜在的影响体脂含量、摄食量及饱食感的一个数量性状位点[6]。另外，由于猪与人基因组序列在进化上的保守性，猪ob基因的分析使猪有可能成为研究人类肥胖病的有利动物模型，并且可以进一步分析ob基因在不同物种的表达调控机理。
目前，关于畜禽肥胖基因的报道较少，国外还没有全长畜禽ob基因序列的报道，本文克隆分析了猪肥胖基因的全长cDNA序列，并对ob在不同组织的表达分布进行了分析。
1 材料和方法
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1.1 组织样从刚屠宰的猪采取各种新鲜组织样品，立即放入液氮中，采取的组织样可在-70℃长期保存。
1.2 PCR引物的设计我们选择人和鼠ob基因cDNA编码区序列的保守区，主要依据人ob基因的序列设计了两对引物，分别可从猪脂肪RNA中反转录扩增366bp和684bp的ob基因片段。引物序列如下：
obF1 5′ GTCACCAGGATCAATGACAT 3′ 20bp；
obR1 5′ CTGTCACAGCATGTCCTGCAGAG 3′ 23bp；
obF2 5′ AGCGATCCCAGGGAAGGAAAATG 3′ 23bp；
obR2 5′ GGCTTAGGGTCTTATGCCTTTGG 3′ 23bp。
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1.3 RT-CR扩增条件的建立PCR仪为Gene Amp PCR System 2400, RT-CR试剂盒为Promega公司的AccessRT-CR System。反应体积为25l，含有1×AMV/Tfl buffer,dNTPs的终浓度为0.2mmol/L, 引物浓度各为1m, Mg2+浓度为1mmol/L，AMV反转录酶终浓度0.1U/l,Tfl DNA聚合酶0.1U/l。RNA样品0.5～1g。扩增条件为48℃反转录60min, 94℃变性3min, 1个循环；94℃变性50s, 55℃, 退火1min 30s, 68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸7min，1个循环，4℃保存。RT-CR反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分析。利用建立的RT-CR反应条件分析猪ob基因在不同组织的表达分布。
1.4 RT-CR产物的回收克隆与序列分析利用GENECLEAN II试剂盒将RT-CR产物从凝胶中回收，连接到Promega公司的pGEM朤载体上，转化DH5π感受态细胞获得重组菌落。利用ABI-77全自动序列分析仪进行测序。
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1.5 猪脂肪组织cDNA文库的构建与筛选利用ISOGENE RNA提取试剂盒从脂肪组织大量制备总RNA后，立即利用Pharmacia公司的mRNA Purification kit和Stratagene公司的cDNA合成试剂盒进行mRNA的分离纯化和反转录合成cDNA。将合成的cDNA按比例连接到Stratagene公司的 Uni朲APTM XR载体上，并用包装蛋白进行包装，建立猪脂肪组织的cDNA文库。利用PCR柹缚夥ù又碇綾DNA文库中分离克隆猪ob基因[7]。
1.6 猪ob基因cDNA的序列测定与分析通过酶切分析建立猪ob基因的酶切图谱后，对猪ob基因进行亚克隆。采用ABI公司PRISMTM Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing和Ready Reaction Dye Terminate Cycle Sequencing试剂盒对亚克隆进行序列反应，通过ABI-77全自动序列分析仪进行序列分析。利用GENETYX-.5软件对测得的ob基因序列与人、鼠序列进行同源性比较分析。
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2 结果
2.1 RT-CR分析ob基因在猪不同组织的表达分布利用引物obF1, obR1分析了ob基因在脂肪、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肌肉组织中的表达情况。
从图1我们可以看出猪ob基因在脂肪组织中大量表达，明显高于其他组织。但我们也意外发现猪ob基因在检测的其他组织也有微量的表达，这与在人和鼠中的研究报道有极大差异。虽然目前有人在人胎盘细胞中也检测到了ob基因的表达，但ob基因主要在人和鼠的脂肪组织中表达，而在其他大多数组织，如我们实验中所检测的几种组织，不论用Northern杂交还是RT-CR均不能检测到该基因转录物的存在[2，8，9]。这说明猪ob基因的表达分布及其调控机制与人和鼠存在差异。
图1 RT-PCR分析猪ob基因在猪不同组织的表达分布
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A.RT-PCR主物的电泳图;B.RT-PCR主物的Southern杂交分析.1.1kb ladder DNA marker;
2.心脏组织;3.肝脏组织;4.脾脏组织;5.肌肉组织;6.肾脏组织;7.脂肪组织
Fig.1 RT-PCR analysis of the ob gene expression in different tissues
A:Electrophoresis of RT-PCR products;B.Analysis of RT-PCR products by Southern blot.
1.1kb DNA ladder; 2.Heart; 3.Liver; 4.Spleen; 5.Muscle; 6.Kidney; 7.Fat
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为进一步检测RT-CR扩增产物的特异性和准确性，对RT-CR产物进行了Southern杂交。将RT-CR产物电泳后转移至尼龙膜，用DIG标记的人ob cDNA基因作探针，进行Southern杂交分析，所有RT-CR产物带均显阳性(图1，B)，表明为特异性扩增。
2.2 RT-CR产物的克隆与分析我们设计的两对引物obF1、obR1和obF2，obR2分别可从猪脂肪RNA中反转录扩增366bp和684bp的ob基因片段，其中obF1、obR1这一对引物的扩增强度和特异性非常好。将obF1、obR1这一对引物扩增的366bp长片段从凝胶上切下来，利用GENECLEAN试剂盒进行回收，连接到pGEM朤载体上，转化DH5π感受态细胞，获得含有猪ob基因366bp片段的阳性克隆。序列分析结果表明这部分编码区与人ob基因编码区序列的同源性为89.3%，与鼠ob基因的同源性为84.7%。这充分表明RT-CR扩增片段为特异性扩增的猪ob基因片段。
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2.3 猪肥胖基因的分离与鉴定利用Stratagene公司的 Uni朲APTMXR载体，我们构建了猪脂肪cDNA文库，文库容量为1×107，重组克隆与非重组克隆的比例大于1201， 文库平均插入片段大小为1.4kb，完全符合实验要求(图2)。我们利用PCR-筛库法将猪脂肪cDNA文库浓缩到每2×103个克隆至少含有1个目的克隆，然后用RT-CR扩增的猪ob基因366bp片段作探针进行噬菌斑原位杂交，获得猪ob基因的阳性克隆。根据 ZAP DNA载体的特性，将阳性克隆转化成质粒克隆后，制备DNA以进行分析。
图2 猪脂肪cDNA方库平均插入片段大小的鉴定
M1:λ/HindⅢ DNA marker,M2:λ/StyⅠDNA marker.1～10:随机选择的克隆
Fig.2 Identification of the average size of inserts from cDNA library
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M1:λ/HindⅢ DNA marker,M2:λ/StyⅠDNA marker.1～10:Randomly selected clones
利用obF2、obR2引物对阳性克隆DNA进行序列分析，进一步证实克隆的片段为猪ob基因。对猪ob基因克隆进行酶切分析，建立其酶切图谱(图3)。
图3 猪ob基因阳性克隆插片段的限制性酶切图谱(阴影部位为编码区)
Fig.3 Restriction map of the positive cloning of pig ob cDNA (The shadow box was the coding region )
2.4 猪ob基因序列的测定与分析根据阳性克隆插入片段的酶切图谱(图3)，利用EcoRI和XhoI进行双酶切，回收酶切得到的片段，亚克隆到pBluescript朣K(+)质粒，获得3个亚克隆pF1.5、pF1.0、pF0.7，进行双向序列分析，再结合利用obF2、obR2引物进行Dye朤erminate测序的结果，我们获得了全长猪ob基因的序列，并对其编码的蛋白质氨基酸序列进行了推测(图4)。
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Fig.4 The complete nucleotide sequence of pig ob cDNA and the predicted amino acid sequence
(GenBank accession Number:AF052691).The coding and non-coding nucleotide sequence was indicated with capital and small letter respectively where the double-underlined region was a ploy A signal.The G+C content of pig obcDNA was 54.32% ,and which in the coding region was 59.13%
用Genetyx-8.5 DNA软件，对猪和人、鼠ob基因DNA序列，蛋白质氨基酸序列的同源性进行了比较，结果表明猪与人、鼠ob基因DNA序列在编码区的同源性分别为88.5%和84.7%，猪与人、鼠ob基因表达的Leptin蛋白氨基酸同源性分别为86%和83.4%(图5)。
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图5 猪与人、鼠ob基因编码的Leptin蛋白氨基酸同源性比较
Fig.5 Alignment of the ob amino acid sequence of pig with those of mouse and human
3 讨论
本研究克隆并序列分析了全长的猪肥胖基因(ob)序列。ob基因序列在不同的物种之间具有很强的保守性。猪与人和鼠ob基因编码区核苷酸序列的同源性分别为88.5%和84.7%；猪与人和鼠ob基因编码的Leptin蛋白的氨基酸序列的同源性分别为86.0%和83.4%。猪与人Leptin蛋白氨基酸的同源性(86.0%)高于鼠与人之间的同源性(84%)，表明猪与人的核苷酸和蛋白氨基酸序列在进化上更为保守。对猪肥胖基因的研究有可能使猪成为研究人类肥胖症的潜在动物模型。
, http://www.100md.com RT-CR分析结果表明：猪ob基因不仅在脂肪组织中大量表达，同时在肝脏、肾脏、脾脏、肌肉和心脏组织也有微量表达，由于RT-CR十分敏感，因而本研究尚不能确定这些表达差异之间的倍数关系。要阐明这些微量表达是否有生理学意义，则需要更深一步的研究。人和鼠的ob基因在胎盘组织检测到有微量表达，但主要是在脂肪组织中表达，在上面列举的几种组织中不论用Northern杂交还是RT-CR均不能检测ob基因转录产物的存在。但是，最近的研究表明，人和鼠的ob基因还可以在胃细胞[11]和免疫细胞[12]中表达，因此相信对ob基因的表达和功能研究还会有新的发现。目前已证明ob基因产物Leptin蛋白在人和鼠体重调控中的重要作用，如果先天缺乏或产生无功能的Leptin蛋白就会造成肥胖，并且实验已证明了重组Leptin蛋白对小鼠有降低体内脂肪含量和体重的作用。那么给猪注射Leptin蛋白，是否能够达到降低猪脂肪含量和背膘厚的目的，以及外源性Leptin蛋白会引起猪哪些生理上的变化，这都是将来需要研究的问题。目前猪ob基因的定位是利用PCR对体细胞杂交体进行扩增检测而定位的，全长ob cDNA基因的克隆使得我们可以利用染色体原位杂交技术，将该基因在染色体上更精确地定位。
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我国是个养猪大国，提高猪种的瘦肉率有重要经济意义，目前利用传统的育种技术改良猪种的瘦肉率进展缓慢，尽管分子生物学技术、标记辅助选择研究有可能大规模地改良瘦肉性状，但相关的基础研究仍十分有限。目前仍未见到影响瘦肉性状和背膘厚的主效基因的报道。人与鼠的肥胖与肥胖受体基因的克隆与分析表明，猪ob基因的克隆与分析对改良猪脂肪蓄积性状有重要意义。目前已发现不同品种猪ob基因位点存在多态，它的进一步分析对了解ob基因对猪脂肪蓄积的基因效应及大规模改良猪种的瘦肉率性状有重要意义[10]。
参考文献
[1]张仲葛等编. 中国猪品种志. 上海：上海科学技术出版社，1986.
[2]Zhang Y et al. Positional cloning of the mouse abese gene and its human homologue. Nature, 1994, 372:425～432.
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[3]Pelleymounter M A et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science, 1995, 269:540～543.
[4]Halaas J L et al. Weight reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science, 1995, 269:543～546.
[5]Campfield L A et al. Recombinant mouse ob protein: evidence for a peripheral signal linking adiposity andcentral neural networks. Science, 1995, 269:546～549.
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[6]Neuenschwander S et al. Partial characterization of porcine obesity gene (OBS) and its localization to chromosome 18 by somatic cell hybrids. Anim. Genet., 1996, 27:275～278.
[7]戴茹娟等. 利用PCR法从文库中快速克隆人促红细胞生成素基因. 农业生物技术学报，1996，4：76～80.
[8]Funahashi T et al. Enhanced expression of rat obese (ob) gene in adipose tissues of VMH lesioned rats. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 211:469～475.
[9]Masuzaki H et al. Augmented expression of the obese gene in the adipose tissue from rates fed high fat diet. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 216:355～358.
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[10]Dai Rujuan et al. Partial characterization of porcine obesity gene (ob) and leptin receptor gene (OBR). In： Proceedings of International Conference on Animal Biotechnology, 1997, 96～100.
[11]Bado A et al. The stomach is a source of leptin. Nature, 1998, 394:790～793.
[12]Load G M et al. Leptin modulates the T-cell immune response and reverses starvation杋nduced immunosuppression. Nature, 1998, 394:897～901., http://www.100md.com
单位：戴茹娟 吴常信(中国农业大学动物科技学院，北京 100094)；李宁(中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京 100094)
关键词：ob基因；Leptin蛋白；猪脂肪cDNA文库
遗传学报000402
摘要：肥胖基因(ob)是近年刚被克隆的新基因，该基因产物Leptin是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子。首次报道猪ob基因全长序列，并对不同物种ob基因的同源性进行了比较。以 Uni朲APTM为载体构建了猪脂肪cDNA文库，根据已知的人和鼠ob基因序列设计PCR引物，利用PCR法筛选猪脂肪cDNA文库，并用RT-CR从脂肪RNA中扩增的366bp猪ob基因片段作探针，获得了全长3 277bp的猪ob基因cDNA的克隆和序列。ob基因序列在不同的物种之间具有很强的保守性。猪与人和鼠ob基因编码区核苷酸序列的同源性分别为88.5%和84.7%；猪ob基因编码的Leptin蛋白氨基酸序列和人、鼠Leptin蛋白的同源性分别为86.0%和83.4%。RT-CR分析表明：猪ob基因不仅在脂肪组织中大量表达，而且在肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肌肉组织中也有微量表达。表明猪ob基因的表达调控与人和鼠可能存在差异。
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中图分类号：Q343 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-0290-297
Molecular Cloning and Analysing of Porcine Obese cDNA
DAI Ru-Juan, WU Chang-Xin
(College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)
LI Ning
(National Laboratories for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094, China)
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Abstract: Obese gene (ob) is a novel gene cloned recently. The product of ob geneLeptin is an important signal reflecting body fat mass and controlling body weight. In this study the complete nucleotide sequences of porcine ob cDNA were identified, and the homology with ob genes from other species was also compared. The porcine fat cDNA was constructed based on λUni-ZAPTM system. The primers designed on the consensus region of human and mouse ob gene were employed to perform PCR-screening of the cDNA library, and a 366bp DNA fragment amplified from total RNA of pig fat cells was used to confirm positives as a hybridization probe. The complete ob cDNA with 3277bp in length was cloned and sequenced . The nucleotide sequences of ob genes between different species were very conservative. The overall identity of ob nucleotide sequences was 88.5% between pig and human, 84.7% between pig and mouse. The homology of ob amino acid sequences was 86.0% between pig and human. 83.4% between pig and mouse. The result of RT-PCR for transcripts detection of pig ob gene indicate that ob gene was expressed not only mainly in adipose tissue but also slightly in other tissues such as kidney, liver, spleen,heart and muscle, which imply that expression nature of pig ob gene is different from that of human and mouse ob gene.
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Key words: ob gene; Leptin protein; porcine fat cDNA library
不同猪种在脂肪蓄积能力方面差异比较大，西方商业猪种大都为瘦肉型，瘦肉率基本都在55%～60%以上，而我国大部分地方猪种为脂肪型，瘦肉率只有45%～50%左右，表明我国地方猪种具有较强的脂肪蓄积能力[1]。脂肪型和瘦肉型猪在脂肪含量上的巨大差异，虽然受环境和饲料的影响，但主要还是二者的遗传背景的差异造成的。长久以来，动物遗传育种工作者希望能找到影响猪生长和脂肪蓄积的主基因，并对一些影响脂肪合成和代谢的激素和酶的基因进行了分析，如生长激素、乙酰辅酶A等等，没有发现这些基因对脂肪蓄积具有主基因效应。
肥胖基因(Obese: ob)于1954年在小鼠中发现，为常染色体隐性遗传。1994年，小鼠和人ob基因的克隆和分析充分证明了ob/ob肥胖型小鼠的肥胖表型是由于ob基因的遗传变异而不能产生正常蛋白产物造成的。ob基因的产物“瘦蛋白”(Leptin)主要作用于大脑的摄食和饱食中枢，对体脂的蓄积进行反馈调控，对体重、体内脂肪蓄积和摄食行为有重要调节作用[2]。科学家们利用重组的人与鼠Leptin蛋白，对肥胖型小鼠(ob/ob)进行处理，可明显改善ob/ob小鼠的肥胖表型，体重在3周内下降40%，正常小鼠的体重由于Leptin蛋白的处理也下降了12%[3～5]。
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考虑到ob基因产物可以反映体内脂肪含量信息及调节体重，我们推测猪ob基因有可能是影响猪生长和脂肪蓄积的数量性状位点，它的克隆和分析将对猪的育种和提高瘦肉生产率有重要意义。在猪的育种生产过程中，我们发现猪的瘦肉生长率的选择提高总是与饲料转换率的降低相联系，这一现象尤其在猪自由采食时更明显。解释这一现象的假设有可能是Leptin蛋白的表达和作用是被紧密连在一起调控的。猪的ob基因位点有可能是潜在的影响体脂含量、摄食量及饱食感的一个数量性状位点[6]。另外，由于猪与人基因组序列在进化上的保守性，猪ob基因的分析使猪有可能成为研究人类肥胖病的有利动物模型，并且可以进一步分析ob基因在不同物种的表达调控机理。
目前，关于畜禽肥胖基因的报道较少，国外还没有全长畜禽ob基因序列的报道，本文克隆分析了猪肥胖基因的全长cDNA序列，并对ob在不同组织的表达分布进行了分析。
1 材料和方法
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1.1 组织样从刚屠宰的猪采取各种新鲜组织样品，立即放入液氮中，采取的组织样可在-70℃长期保存。
1.2 PCR引物的设计我们选择人和鼠ob基因cDNA编码区序列的保守区，主要依据人ob基因的序列设计了两对引物，分别可从猪脂肪RNA中反转录扩增366bp和684bp的ob基因片段。引物序列如下：
obF1 5′ GTCACCAGGATCAATGACAT 3′ 20bp；
obR1 5′ CTGTCACAGCATGTCCTGCAGAG 3′ 23bp；
obF2 5′ AGCGATCCCAGGGAAGGAAAATG 3′ 23bp；
obR2 5′ GGCTTAGGGTCTTATGCCTTTGG 3′ 23bp。
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1.3 RT-CR扩增条件的建立PCR仪为Gene Amp PCR System 2400, RT-CR试剂盒为Promega公司的AccessRT-CR System。反应体积为25l，含有1×AMV/Tfl buffer,dNTPs的终浓度为0.2mmol/L, 引物浓度各为1m, Mg2+浓度为1mmol/L，AMV反转录酶终浓度0.1U/l,Tfl DNA聚合酶0.1U/l。RNA样品0.5～1g。扩增条件为48℃反转录60min, 94℃变性3min, 1个循环；94℃变性50s, 55℃, 退火1min 30s, 68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸7min，1个循环，4℃保存。RT-CR反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分析。利用建立的RT-CR反应条件分析猪ob基因在不同组织的表达分布。
1.4 RT-CR产物的回收克隆与序列分析利用GENECLEAN II试剂盒将RT-CR产物从凝胶中回收，连接到Promega公司的pGEM朤载体上，转化DH5π感受态细胞获得重组菌落。利用ABI-77全自动序列分析仪进行测序。
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1.5 猪脂肪组织cDNA文库的构建与筛选利用ISOGENE RNA提取试剂盒从脂肪组织大量制备总RNA后，立即利用Pharmacia公司的mRNA Purification kit和Stratagene公司的cDNA合成试剂盒进行mRNA的分离纯化和反转录合成cDNA。将合成的cDNA按比例连接到Stratagene公司的 Uni朲APTM XR载体上，并用包装蛋白进行包装，建立猪脂肪组织的cDNA文库。利用PCR柹缚夥ù又碇綾DNA文库中分离克隆猪ob基因[7]。
1.6 猪ob基因cDNA的序列测定与分析通过酶切分析建立猪ob基因的酶切图谱后，对猪ob基因进行亚克隆。采用ABI公司PRISMTM Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing和Ready Reaction Dye Terminate Cycle Sequencing试剂盒对亚克隆进行序列反应，通过ABI-77全自动序列分析仪进行序列分析。利用GENETYX-.5软件对测得的ob基因序列与人、鼠序列进行同源性比较分析。
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2 结果
2.1 RT-CR分析ob基因在猪不同组织的表达分布利用引物obF1, obR1分析了ob基因在脂肪、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肌肉组织中的表达情况。
从图1我们可以看出猪ob基因在脂肪组织中大量表达，明显高于其他组织。但我们也意外发现猪ob基因在检测的其他组织也有微量的表达，这与在人和鼠中的研究报道有极大差异。虽然目前有人在人胎盘细胞中也检测到了ob基因的表达，但ob基因主要在人和鼠的脂肪组织中表达，而在其他大多数组织，如我们实验中所检测的几种组织，不论用Northern杂交还是RT-CR均不能检测到该基因转录物的存在[2，8，9]。这说明猪ob基因的表达分布及其调控机制与人和鼠存在差异。
图1 RT-PCR分析猪ob基因在猪不同组织的表达分布
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A.RT-PCR主物的电泳图;B.RT-PCR主物的Southern杂交分析.1.1kb ladder DNA marker;
2.心脏组织;3.肝脏组织;4.脾脏组织;5.肌肉组织;6.肾脏组织;7.脂肪组织
Fig.1 RT-PCR analysis of the ob gene expression in different tissues
A:Electrophoresis of RT-PCR products;B.Analysis of RT-PCR products by Southern blot.
1.1kb DNA ladder; 2.Heart; 3.Liver; 4.Spleen; 5.Muscle; 6.Kidney; 7.Fat
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为进一步检测RT-CR扩增产物的特异性和准确性，对RT-CR产物进行了Southern杂交。将RT-CR产物电泳后转移至尼龙膜，用DIG标记的人ob cDNA基因作探针，进行Southern杂交分析，所有RT-CR产物带均显阳性(图1，B)，表明为特异性扩增。
2.2 RT-CR产物的克隆与分析我们设计的两对引物obF1、obR1和obF2，obR2分别可从猪脂肪RNA中反转录扩增366bp和684bp的ob基因片段，其中obF1、obR1这一对引物的扩增强度和特异性非常好。将obF1、obR1这一对引物扩增的366bp长片段从凝胶上切下来，利用GENECLEAN试剂盒进行回收，连接到pGEM朤载体上，转化DH5π感受态细胞，获得含有猪ob基因366bp片段的阳性克隆。序列分析结果表明这部分编码区与人ob基因编码区序列的同源性为89.3%，与鼠ob基因的同源性为84.7%。这充分表明RT-CR扩增片段为特异性扩增的猪ob基因片段。
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2.3 猪肥胖基因的分离与鉴定利用Stratagene公司的 Uni朲APTMXR载体，我们构建了猪脂肪cDNA文库，文库容量为1×107，重组克隆与非重组克隆的比例大于1201， 文库平均插入片段大小为1.4kb，完全符合实验要求(图2)。我们利用PCR-筛库法将猪脂肪cDNA文库浓缩到每2×103个克隆至少含有1个目的克隆，然后用RT-CR扩增的猪ob基因366bp片段作探针进行噬菌斑原位杂交，获得猪ob基因的阳性克隆。根据 ZAP DNA载体的特性，将阳性克隆转化成质粒克隆后，制备DNA以进行分析。
图2 猪脂肪cDNA方库平均插入片段大小的鉴定
M1:λ/HindⅢ DNA marker,M2:λ/StyⅠDNA marker.1～10:随机选择的克隆
Fig.2 Identification of the average size of inserts from cDNA library
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M1:λ/HindⅢ DNA marker,M2:λ/StyⅠDNA marker.1～10:Randomly selected clones
利用obF2、obR2引物对阳性克隆DNA进行序列分析，进一步证实克隆的片段为猪ob基因。对猪ob基因克隆进行酶切分析，建立其酶切图谱(图3)。
图3 猪ob基因阳性克隆插片段的限制性酶切图谱(阴影部位为编码区)
Fig.3 Restriction map of the positive cloning of pig ob cDNA (The shadow box was the coding region )
2.4 猪ob基因序列的测定与分析根据阳性克隆插入片段的酶切图谱(图3)，利用EcoRI和XhoI进行双酶切，回收酶切得到的片段，亚克隆到pBluescript朣K(+)质粒，获得3个亚克隆pF1.5、pF1.0、pF0.7，进行双向序列分析，再结合利用obF2、obR2引物进行Dye朤erminate测序的结果，我们获得了全长猪ob基因的序列，并对其编码的蛋白质氨基酸序列进行了推测(图4)。
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Fig.4 The complete nucleotide sequence of pig ob cDNA and the predicted amino acid sequence
(GenBank accession Number:AF052691).The coding and non-coding nucleotide sequence was indicated with capital and small letter respectively where the double-underlined region was a ploy A signal.The G+C content of pig obcDNA was 54.32% ,and which in the coding region was 59.13%
用Genetyx-8.5 DNA软件，对猪和人、鼠ob基因DNA序列，蛋白质氨基酸序列的同源性进行了比较，结果表明猪与人、鼠ob基因DNA序列在编码区的同源性分别为88.5%和84.7%，猪与人、鼠ob基因表达的Leptin蛋白氨基酸同源性分别为86%和83.4%(图5)。
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图5 猪与人、鼠ob基因编码的Leptin蛋白氨基酸同源性比较
Fig.5 Alignment of the ob amino acid sequence of pig with those of mouse and human
3 讨论
本研究克隆并序列分析了全长的猪肥胖基因(ob)序列。ob基因序列在不同的物种之间具有很强的保守性。猪与人和鼠ob基因编码区核苷酸序列的同源性分别为88.5%和84.7%；猪与人和鼠ob基因编码的Leptin蛋白的氨基酸序列的同源性分别为86.0%和83.4%。猪与人Leptin蛋白氨基酸的同源性(86.0%)高于鼠与人之间的同源性(84%)，表明猪与人的核苷酸和蛋白氨基酸序列在进化上更为保守。对猪肥胖基因的研究有可能使猪成为研究人类肥胖症的潜在动物模型。
, http://www.100md.com RT-CR分析结果表明：猪ob基因不仅在脂肪组织中大量表达，同时在肝脏、肾脏、脾脏、肌肉和心脏组织也有微量表达，由于RT-CR十分敏感，因而本研究尚不能确定这些表达差异之间的倍数关系。要阐明这些微量表达是否有生理学意义，则需要更深一步的研究。人和鼠的ob基因在胎盘组织检测到有微量表达，但主要是在脂肪组织中表达，在上面列举的几种组织中不论用Northern杂交还是RT-CR均不能检测ob基因转录产物的存在。但是，最近的研究表明，人和鼠的ob基因还可以在胃细胞[11]和免疫细胞[12]中表达，因此相信对ob基因的表达和功能研究还会有新的发现。目前已证明ob基因产物Leptin蛋白在人和鼠体重调控中的重要作用，如果先天缺乏或产生无功能的Leptin蛋白就会造成肥胖，并且实验已证明了重组Leptin蛋白对小鼠有降低体内脂肪含量和体重的作用。那么给猪注射Leptin蛋白，是否能够达到降低猪脂肪含量和背膘厚的目的，以及外源性Leptin蛋白会引起猪哪些生理上的变化，这都是将来需要研究的问题。目前猪ob基因的定位是利用PCR对体细胞杂交体进行扩增检测而定位的，全长ob cDNA基因的克隆使得我们可以利用染色体原位杂交技术，将该基因在染色体上更精确地定位。
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我国是个养猪大国，提高猪种的瘦肉率有重要经济意义，目前利用传统的育种技术改良猪种的瘦肉率进展缓慢，尽管分子生物学技术、标记辅助选择研究有可能大规模地改良瘦肉性状，但相关的基础研究仍十分有限。目前仍未见到影响瘦肉性状和背膘厚的主效基因的报道。人与鼠的肥胖与肥胖受体基因的克隆与分析表明，猪ob基因的克隆与分析对改良猪脂肪蓄积性状有重要意义。目前已发现不同品种猪ob基因位点存在多态，它的进一步分析对了解ob基因对猪脂肪蓄积的基因效应及大规模改良猪种的瘦肉率性状有重要意义[10]。
参考文献
[1]张仲葛等编. 中国猪品种志. 上海：上海科学技术出版社，1986.
[2]Zhang Y et al. Positional cloning of the mouse abese gene and its human homologue. Nature, 1994, 372:425～432.
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[3]Pelleymounter M A et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science, 1995, 269:540～543.
[4]Halaas J L et al. Weight reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science, 1995, 269:543～546.
[5]Campfield L A et al. Recombinant mouse ob protein: evidence for a peripheral signal linking adiposity andcentral neural networks. Science, 1995, 269:546～549.
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[6]Neuenschwander S et al. Partial characterization of porcine obesity gene (OBS) and its localization to chromosome 18 by somatic cell hybrids. Anim. Genet., 1996, 27:275～278.
[7]戴茹娟等. 利用PCR法从文库中快速克隆人促红细胞生成素基因. 农业生物技术学报，1996，4：76～80.
[8]Funahashi T et al. Enhanced expression of rat obese (ob) gene in adipose tissues of VMH lesioned rats. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 211:469～475.
[9]Masuzaki H et al. Augmented expression of the obese gene in the adipose tissue from rates fed high fat diet. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 216:355～358.
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[10]Dai Rujuan et al. Partial characterization of porcine obesity gene (ob) and leptin receptor gene (OBR). In： Proceedings of International Conference on Animal Biotechnology, 1997, 96～100.
[11]Bado A et al. The stomach is a source of leptin. Nature, 1998, 394:790～793.
[12]Load G M et al. Leptin modulates the T-cell immune response and reverses starvation杋nduced immunosuppression. Nature, 1998, 394:897～901., http://www.100md.com