鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成调控研究XI. PUR box的突变分析
作者：龙海霞 马伟军 秦俊川 王敖全
单位：龙海霞 王敖全(中国科学院微生物研究所， 北京 100080)；马伟军 秦俊川(南京大学生物化学系国家医药生物技术重点实验室，南京 210093)
关键词：PUR box；鼠伤寒沙门氏菌；嘌呤核苷酸生物合成调控
遗传学报000513
摘要：为研究16bp PUR box中除第3位的G与第14位的C外，余下6个完全保守碱基的4个在与PurR阻遏蛋白结合中的功能，对它们分别做了定点突变，使其分别从C、A、A和T突变为G、G、G和C。凝胶阻滞实验结果表明，含上述指定突变的PUR box均不能与PurR阻遏蛋白结合。由此证明，这4个保守碱基对维持PUR box的功能是必须的，其中任一改变都导致PUR box功能的丧失。
, 百拇医药 中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0379-4172(2000)05-0462-06
Regulation of Purine Biosynthetic Genes Expression
in Salmonella typhimurium
LONG HaiXia WANG AoQuan
(Institutl of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080; China)
MA WeiJun QIN JunChuan
(Department of Biochemistry, State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Nanjing 210093, China)
, 百拇医药
Abstract： To study binding funtion of 4 consensus bases in 16bp PUR box with purR protein, the directed site mutation for each was carried out, which mutate from C to G, A to G, A to G, T to C, respectively. Gel retardation showed that the PUR box carrying a reserved mutation could not bind with purR protein. It suggested that all these consensus base pairs are necessary to hold the normal binding function of PUR box with purR protein.
Key words: PUR box; Salmonella typhimurium; regulation of purine biosynthetic genes expression
, 百拇医药
对鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成调节突变体的研究表明，嘌呤从头合成途径中分散在染色体上的所有结构基因的表达均受同一反式调节基因的负调控[1，2]。对受控结构基因的核苷酸序列测定发现，在它们的5′端调控区都存在一个16bp的保守序列称之PUR box。已证明该序列为pruR编码的阻遏蛋白的结合区[3～5]。比较各结构基因的PUR box序列可见，有8个bp即第3位的G、第4位的C、第5位的A、第6位的A、第8位的C、第9位的G、第12位的T和第14位的C是完全保守的。通过分离purHD和purG的OC突变体并测定它们的突变位点已证明，第3位和第14位碱基G和C对维持PUR box的功能是必须的。本文报道余下6个保守碱基中的4个的定点突变及其生物学功能。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒
见表1。
, http://www.100md.com
表1 菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids
相关遗传型
Relevant genotype
来源或参考文献
Source or reference
菌株
Strains
DH5α
supE44△lacU169(ψ80lacZ?M15)
Store in this lab.
, 百拇医药
hsdR17△recA/end/gyrA96thi/relA
DH-LO+P
DH5αwith pLHGO+
This study
DH-LP-4
DH5αwith pLHG-4
This study
DH-LP-5
DH5αwith pLHG-5
This study
, http://www.100md.com
DH-LP-6
DH5αwith pLHG-6
This study
DH-LP-12
DH5αwith pLHG-12
This study
质粒Plasmids
pBR322
Ampr tet r sup pMB
This lab.
pUC19
, http://www.100md.com
Ampr lacⅠPOZ rep pMB
This lab.
pLBG-1
270bp EcoRⅠ-PstⅠfragment containing PUR box inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19(O+)
[4]
pLHGO+
Mud5005 with 0+ purG DNA fragrant
This study
pLHG-4
, http://www.100md.com
270bp EcoRⅠ-PstⅠ fragment containing PUR box with a mutiation in the fourth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19
This study
pLHG-5
270bp EcoRⅠ-PstⅠfragment containing PUR box with a mutation in the fifth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19
This study
pLHG-6
270bp EcoRⅠ-PstⅠ fragment containing PUR box with a mutation in the sixth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠ of pUC19
, 百拇医药
This study
pLHG-12
270bp EcoRⅠ-PstⅠfragment containing PUR box with a mutation in the twelvwth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19
This study
1.2 培养基
M63用作基础培养基[6]，丰富培养基用LB[6]，氨苄青霉素浓度为50μg/ml。
1.3 质粒DNA的提取、目的片段的回收、限制核酸内切酶和T4连接酶连接
, http://www.100md.com 按文献[7]进行。
1.4 DNA核酸酶序列测定
采用Pharmacia T7 sequencing试剂盒，按厂家说明书操作。
1.5 PCR引物设计、扩增反应
按参考文献[7]进行。
1.6 蛋白浓度测定
按文献[8]进行。
1.7 PurR阻遏蛋白的提取
参照文献[4]完成。
1.7.1 含O+和带指定突变的PUR box DNA片段的5′端末端-32P标记 按Promega公司提供方法进行。
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1.7.2 阻遏蛋白质与PUR box的结合 反应在PurR buffer中完成，终体积为10μl，其中非特异性结合DNA pBR322 1μg，蛋白粗提液1l，蛋白浓度为2.4mg/ml。在加入特异结合DNA前将反应液在室温下继续反应20min，即刻上样进行聚丙烯酰胺电泳。胶浓度为4%(301)在7V/cm电压下
1h。
2 实验结果
2.1 PUR定点突变体的构建
采用PCR方法通过设计引物在PUR box特定位点引入突变。根据鼠伤寒沙门氏菌purG序列，使设计的引物的5′端含部分PUR box序列。分别将PUR box第4位的C、第5位的A、第6位的A和第12位的T改成G、G、G和C。这些引物分别为：
O+： 5′-TTTGAATTCTACGCAAACG-3′
, 百拇医药
引物4： 5′-TTTGAATTCTACGGAAACG-3′
引物5： 5′-TTTGAATTCTACGCGAACG-3′
引物6： 5′-TTTGAATTCTACGCAGACG-3′
引物12： 5′-TTTGAATTCTACGCAAACGGTCTCGT-3′
3′端下游引物： 5′-TTTCTGCAGGCGTTCAAG-3′
(注：黑体字表示酶切位点，斜体字表示改变的碱基，下划线部分为PUR box序列)
2.2 目的片段的PCR扩增
以具完整功能的purG克隆pLBG-3质粒DNA为模板，用上述引物分别进行PCR扩增，均扩增出约280bp的目的片段(资料未列出)。
, 百拇医药
2.3 目的片段的克隆、鉴定和核苷酸序列测定
5种PCR扩增片段经EcoRⅠ和PstⅠ酶切后用DEAE纤维素膜回收，分别克隆至pUC19的EcoR-PstⅠ位点，转化DH5π。进而对获得的转化子进行酶切鉴定。已知purG的PUR box下游80bp处有1个Hind切点，在pUC19 Pst切点处亦有1个HindⅢ切点。因此当用Hind酶切上述各克隆子时若克隆片段正确，则应切出约190bp的特征片段。结果表明，7种克隆均能切出预期片段。这些克隆分别被命名为pLHG-O+、pLGH-3、pLHG-3、pLHG-3和pLHG-32，构建过程见图1。为证明这些克隆已在PUR box指定位点引入突变，对它们分别作了DNA核苷酸序列测定(图2)。结果表明，4个PUR box 突变体的突变位点均正确。
图1 PUR box定点突变体的构建
, http://www.100md.com
Fig.1 Construction of PUR box mutant with a specific mutation
——primer;
PUR box
图2 PUR box突变体的DNA序列分析
Fig.2 Determination of DNA sequence of PUR box mutant
a.pLHGO+;b.pLHG-4;c.pLHG-5;d.pLHG-6;e.pLHG-12
, http://www.100md.com
2.4 PUR box突变体的功能分析
为检查上述各个保守碱基发生突变后PUR box是否仍具有与purR阻遏蛋白结合的功能，用EcoRI和PstI分别酶切上 述5种质粒。回收含PUR box且带有预定突变的280bp片段。以γ-32P标记这些片段后，与purR+阻遏蛋白作体外结合实验(gel retardation)，获得的结果见图3。
由图3可见，purR阻遏蛋白与野生型的PUR box能很好结合，但与带有突变的PURbox均不能结合。有力证明这些保守碱基对维持PUR box的正常功能是至关重要的，一旦突变便可导致功能的丧失。
3 讨论
比较已发表的各嘌呤结构基因的PUR box序列可见，16bp中仅有8个是完全保守的，本实验室曾获得了purHD和purG的OC突变体各1株。突变位点经分析表明，OC突变正是这8个保守碱基中的两个突变的结果，即第4位的C和第14位的G。为阐明每个保守碱基的生物学功能，我们对余下6个中的4个碱基进行了定点突变和功能分析。结果显示4个碱基中任一发生突变即丧失与purR阻遏蛋白的结合功能。观察PUR box的结构不难发现，16bp呈回文对称结构。因此可以认为完全保守的这些碱基在保持PUR box的对称性是必须的，而这种结构的对称性可能对维持PUR box与purR阻遏蛋白的结合功能是至关重要的。当然，我们的结果还不能排除16bp中非保守碱基对结合功能的影
, 百拇医药
响。这方面的工作正在进行中。
国家自然科学基金资助项目(39470382)
参考文献
[1]Sandobon K E et al. Linkage map of Salmonella typhimurium. Edition . Microbiological Reviews, 1988, 52:485～532.
[2]He B, Shiam A, Choik Y et al. Genes of the E. coli pur region are negatively controlled by a repressor-operator interaction. J. Bactorial, 1990, 172(8):4555～4562.
[3]Rolfs R J, Zalkin H. E. coli gene purR+ encoding a reprossor protein for purine nucleotides synthesis. J. Biol. Biochem., 1988, 261(36):19653～19661.
, 百拇医药
[4]李凯奕，戴秀玉，刘 奔，王敖全. 鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成调控研究 IV. pur JHD操纵子含O+和OC调控的分离和核苷酸序列测定. 遗传学报，1995， 22：152～160.
[5]Liu Ben (刘 奔)， Huang Yi(黄 宜)，Wang Aoquan(王敖全). Regulation of purine biosynthetic genes expression in Salmonella typhimurium IX. OC Mutation site of purG and its function analysis. Science in China (Series C)， 1997, 40(3)： 138～245.
[6]Miller J H. In： Experiments in Molecular Genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972.
, http://www.100md.com
[7]Sambrock J, Frithch E F, Maniatis T. In： Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[8]Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A R, Randall J R. Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1955, 193, 265～275.
1999-04-14
1999-06-01, 百拇医药
单位：龙海霞 王敖全(中国科学院微生物研究所， 北京 100080)；马伟军 秦俊川(南京大学生物化学系国家医药生物技术重点实验室，南京 210093)
关键词：PUR box；鼠伤寒沙门氏菌；嘌呤核苷酸生物合成调控
遗传学报000513
摘要：为研究16bp PUR box中除第3位的G与第14位的C外，余下6个完全保守碱基的4个在与PurR阻遏蛋白结合中的功能，对它们分别做了定点突变，使其分别从C、A、A和T突变为G、G、G和C。凝胶阻滞实验结果表明，含上述指定突变的PUR box均不能与PurR阻遏蛋白结合。由此证明，这4个保守碱基对维持PUR box的功能是必须的，其中任一改变都导致PUR box功能的丧失。
, 百拇医药 中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0379-4172(2000)05-0462-06
Regulation of Purine Biosynthetic Genes Expression
in Salmonella typhimurium
LONG HaiXia WANG AoQuan
(Institutl of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080; China)
MA WeiJun QIN JunChuan
(Department of Biochemistry, State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Nanjing 210093, China)
, 百拇医药
Abstract： To study binding funtion of 4 consensus bases in 16bp PUR box with purR protein, the directed site mutation for each was carried out, which mutate from C to G, A to G, A to G, T to C, respectively. Gel retardation showed that the PUR box carrying a reserved mutation could not bind with purR protein. It suggested that all these consensus base pairs are necessary to hold the normal binding function of PUR box with purR protein.
Key words: PUR box; Salmonella typhimurium; regulation of purine biosynthetic genes expression
, 百拇医药
对鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成调节突变体的研究表明，嘌呤从头合成途径中分散在染色体上的所有结构基因的表达均受同一反式调节基因的负调控[1，2]。对受控结构基因的核苷酸序列测定发现，在它们的5′端调控区都存在一个16bp的保守序列称之PUR box。已证明该序列为pruR编码的阻遏蛋白的结合区[3～5]。比较各结构基因的PUR box序列可见，有8个bp即第3位的G、第4位的C、第5位的A、第6位的A、第8位的C、第9位的G、第12位的T和第14位的C是完全保守的。通过分离purHD和purG的OC突变体并测定它们的突变位点已证明，第3位和第14位碱基G和C对维持PUR box的功能是必须的。本文报道余下6个保守碱基中的4个的定点突变及其生物学功能。
1 材料和方法
1.1 菌株和质粒
见表1。
, http://www.100md.com
表1 菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids
相关遗传型
Relevant genotype
来源或参考文献
Source or reference
菌株
Strains
DH5α
supE44△lacU169(ψ80lacZ?M15)
Store in this lab.
, 百拇医药
hsdR17△recA/end/gyrA96thi/relA
DH-LO+P
DH5αwith pLHGO+
This study
DH-LP-4
DH5αwith pLHG-4
This study
DH-LP-5
DH5αwith pLHG-5
This study
, http://www.100md.com
DH-LP-6
DH5αwith pLHG-6
This study
DH-LP-12
DH5αwith pLHG-12
This study
质粒Plasmids
pBR322
Ampr tet r sup pMB
This lab.
pUC19
, http://www.100md.com
Ampr lacⅠPOZ rep pMB
This lab.
pLBG-1
270bp EcoRⅠ-PstⅠfragment containing PUR box inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19(O+)
[4]
pLHGO+
Mud5005 with 0+ purG DNA fragrant
This study
pLHG-4
, http://www.100md.com
270bp EcoRⅠ-PstⅠ fragment containing PUR box with a mutiation in the fourth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19
This study
pLHG-5
270bp EcoRⅠ-PstⅠfragment containing PUR box with a mutation in the fifth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19
This study
pLHG-6
270bp EcoRⅠ-PstⅠ fragment containing PUR box with a mutation in the sixth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠ of pUC19
, 百拇医药
This study
pLHG-12
270bp EcoRⅠ-PstⅠfragment containing PUR box with a mutation in the twelvwth position inserted at EcoRⅠ-PstⅠof pUC19
This study
1.2 培养基
M63用作基础培养基[6]，丰富培养基用LB[6]，氨苄青霉素浓度为50μg/ml。
1.3 质粒DNA的提取、目的片段的回收、限制核酸内切酶和T4连接酶连接
, http://www.100md.com 按文献[7]进行。
1.4 DNA核酸酶序列测定
采用Pharmacia T7 sequencing试剂盒，按厂家说明书操作。
1.5 PCR引物设计、扩增反应
按参考文献[7]进行。
1.6 蛋白浓度测定
按文献[8]进行。
1.7 PurR阻遏蛋白的提取
参照文献[4]完成。
1.7.1 含O+和带指定突变的PUR box DNA片段的5′端末端-32P标记 按Promega公司提供方法进行。
, http://www.100md.com
1.7.2 阻遏蛋白质与PUR box的结合 反应在PurR buffer中完成，终体积为10μl，其中非特异性结合DNA pBR322 1μg，蛋白粗提液1l，蛋白浓度为2.4mg/ml。在加入特异结合DNA前将反应液在室温下继续反应20min，即刻上样进行聚丙烯酰胺电泳。胶浓度为4%(301)在7V/cm电压下
1h。
2 实验结果
2.1 PUR定点突变体的构建
采用PCR方法通过设计引物在PUR box特定位点引入突变。根据鼠伤寒沙门氏菌purG序列，使设计的引物的5′端含部分PUR box序列。分别将PUR box第4位的C、第5位的A、第6位的A和第12位的T改成G、G、G和C。这些引物分别为：
O+： 5′-TTTGAATTCTACGCAAACG-3′
, 百拇医药
引物4： 5′-TTTGAATTCTACGGAAACG-3′
引物5： 5′-TTTGAATTCTACGCGAACG-3′
引物6： 5′-TTTGAATTCTACGCAGACG-3′
引物12： 5′-TTTGAATTCTACGCAAACGGTCTCGT-3′
3′端下游引物： 5′-TTTCTGCAGGCGTTCAAG-3′
(注：黑体字表示酶切位点，斜体字表示改变的碱基，下划线部分为PUR box序列)
2.2 目的片段的PCR扩增
以具完整功能的purG克隆pLBG-3质粒DNA为模板，用上述引物分别进行PCR扩增，均扩增出约280bp的目的片段(资料未列出)。
, 百拇医药
2.3 目的片段的克隆、鉴定和核苷酸序列测定
5种PCR扩增片段经EcoRⅠ和PstⅠ酶切后用DEAE纤维素膜回收，分别克隆至pUC19的EcoR-PstⅠ位点，转化DH5π。进而对获得的转化子进行酶切鉴定。已知purG的PUR box下游80bp处有1个Hind切点，在pUC19 Pst切点处亦有1个HindⅢ切点。因此当用Hind酶切上述各克隆子时若克隆片段正确，则应切出约190bp的特征片段。结果表明，7种克隆均能切出预期片段。这些克隆分别被命名为pLHG-O+、pLGH-3、pLHG-3、pLHG-3和pLHG-32，构建过程见图1。为证明这些克隆已在PUR box指定位点引入突变，对它们分别作了DNA核苷酸序列测定(图2)。结果表明，4个PUR box 突变体的突变位点均正确。
图1 PUR box定点突变体的构建
, http://www.100md.com
Fig.1 Construction of PUR box mutant with a specific mutation
——primer;
PUR box图2 PUR box突变体的DNA序列分析
Fig.2 Determination of DNA sequence of PUR box mutant
a.pLHGO+;b.pLHG-4;c.pLHG-5;d.pLHG-6;e.pLHG-12
, http://www.100md.com
2.4 PUR box突变体的功能分析
为检查上述各个保守碱基发生突变后PUR box是否仍具有与purR阻遏蛋白结合的功能，用EcoRI和PstI分别酶切上 述5种质粒。回收含PUR box且带有预定突变的280bp片段。以γ-32P标记这些片段后，与purR+阻遏蛋白作体外结合实验(gel retardation)，获得的结果见图3。
由图3可见，purR阻遏蛋白与野生型的PUR box能很好结合，但与带有突变的PURbox均不能结合。有力证明这些保守碱基对维持PUR box的正常功能是至关重要的，一旦突变便可导致功能的丧失。
3 讨论
比较已发表的各嘌呤结构基因的PUR box序列可见，16bp中仅有8个是完全保守的，本实验室曾获得了purHD和purG的OC突变体各1株。突变位点经分析表明，OC突变正是这8个保守碱基中的两个突变的结果，即第4位的C和第14位的G。为阐明每个保守碱基的生物学功能，我们对余下6个中的4个碱基进行了定点突变和功能分析。结果显示4个碱基中任一发生突变即丧失与purR阻遏蛋白的结合功能。观察PUR box的结构不难发现，16bp呈回文对称结构。因此可以认为完全保守的这些碱基在保持PUR box的对称性是必须的，而这种结构的对称性可能对维持PUR box与purR阻遏蛋白的结合功能是至关重要的。当然，我们的结果还不能排除16bp中非保守碱基对结合功能的影
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响。这方面的工作正在进行中。
国家自然科学基金资助项目(39470382)
参考文献
[1]Sandobon K E et al. Linkage map of Salmonella typhimurium. Edition . Microbiological Reviews, 1988, 52:485～532.
[2]He B, Shiam A, Choik Y et al. Genes of the E. coli pur region are negatively controlled by a repressor-operator interaction. J. Bactorial, 1990, 172(8):4555～4562.
[3]Rolfs R J, Zalkin H. E. coli gene purR+ encoding a reprossor protein for purine nucleotides synthesis. J. Biol. Biochem., 1988, 261(36):19653～19661.
, 百拇医药
[4]李凯奕，戴秀玉，刘 奔，王敖全. 鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成调控研究 IV. pur JHD操纵子含O+和OC调控的分离和核苷酸序列测定. 遗传学报，1995， 22：152～160.
[5]Liu Ben (刘 奔)， Huang Yi(黄 宜)，Wang Aoquan(王敖全). Regulation of purine biosynthetic genes expression in Salmonella typhimurium IX. OC Mutation site of purG and its function analysis. Science in China (Series C)， 1997, 40(3)： 138～245.
[6]Miller J H. In： Experiments in Molecular Genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972.
, http://www.100md.com
[7]Sambrock J, Frithch E F, Maniatis T. In： Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[8]Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A R, Randall J R. Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1955, 193, 265～275.
1999-04-14
1999-06-01, 百拇医药