黑麦基因组中不同染色体在缺磷胁迫下对普通小麦根系分泌酸性磷酸酯酶(Acph)遗传效应的研究

http://www.100md.com 《遗传学报》 2000年第1期

     作者：刘建中 李玉京 李滨 姚树江 李振声 李继云

    单位：刘建中 李玉京 李滨 姚树江 李振声(中国科学院遗传研究所植物细胞与染色体工程国家重点实验室 北京 100101)；李继云(中国科学院生态环境研究中心，北京 100085)

    关键词：二体附加系；缺磷胁迫；酸性磷酸酯酶；同工酶

    遗传学报000107

    摘要：以一整套中国春-帝国黑麦二体附加系为材料，通过在低磷胁迫下对其根系分泌Acph能力测定及同工酶等电聚焦分析证明：缺磷胁迫是Acph基因表达的诱导因子，帝国黑麦不同染色体在中国春小麦背景中对其根系在低磷胁迫下Acph的分泌具不同的正效应，其中以1R染色体的效应最为强烈，Acph等电聚焦(IEF)的酶谱清楚地表明黑麦的1R染色体上携有在缺磷胁迫下诱导表达的Acph基因。

    中图分类号：Q342 文献标识码：A

    文章编号：0379-4172(2000)01-0039-0043

    Genetical Effect of Different Rye Chromosomes on the Acid Phosphatase (Acph) Secretion of Common Wheat Roots under Phosphorus Starvation Conditions

    LIU Jian-Zhong，LI Yu-Jing，LI Bin，YAO Shu-Jiang，LI Zhen-Sheng

    (Institute of Genetics,Chinese Academy of Sciences Beijing 100101,China)

    LI Ji-Yun

    (The Research Center for Eco-Environmental Science Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China)

    Abstract:The effects of different rye chromosomes on Acph secretion of common wheat roots under P starvation conditions were studied by using a set of Chinese Spring-Imperial (CS-IMP) alien addition lines as materials.The Acph activity measurement results showed that P starvation is an induction factor for Acph gene expression;Different chromosomes of Imperial rye in Chinese Spring background has different effects on the secretion of Acph by corresponding addition line roots.Among them,chromosome 1R had the strongest promoting effect;The IEF diagram of Acph isozymes clearly demonstrated that chromosome 1R in rye genome carries P starvation inducible Acph gene(s).

    Key words:disomic additional line;P deficient stress;Acph;isozyme

    土壤中含有丰富的有机磷，有机磷是不能被植物直接吸收利用的无效态磷。磷酸酯酶，特别是酸性磷酸酯酶(Acph)在活化土壤有机磷方面起着关

    键性的作用。Acph是水解酶，它可将复杂的有机磷化合物水解成可为植物吸收利用的正磷酸盐(HPO^2-₄，H₂OP^-₄)。因此，植物通过根系向土壤中分泌Acph的能力是植物耐低磷特性的重要组成部分^[1～4]。小麦近缘种中含有丰富的基因资源，有些是小麦中所不具有的。黑麦(Secale.L)是与普通小麦可交配性最好的近缘植物之一^[1，5，6]。搞清黑麦基因组中各染色体在小麦遗传背景中对小麦根系Acph分泌的效应，以及将编码Acph的基因定位于黑麦的某一染色体上，将为该基因向小麦中的定向转移打下基础。

    1材料和方法

    1.1 植物材料

    以一套中国春柕酃诼蠖甯郊酉担–hinese Spring-Imperial disomicaddition lines)及其背景亲本中国春与帝国黑麦为实验材料。 该套附加系由美国密苏里大学Kimber教授提供，分别标记为DA1R、DA2R、……DA7R。

    1.2 方法

    1.2.1 根尖染色体检查 用常规压片法，醋酸洋红染色。

    1.2.2 材料培养 用0.1% HgCl₂对供试材料的种子进行20min表面消毒→种子发芽，经根尖染色体检查，选取2n＝44的附加系植株。 按Tadano T^[5]的方法及营养元素配方将各材料在对照(CK)与缺磷(-P)条件下水培60天。

    1.2.3 根系分泌Acph活性的测定程序 将对照与缺磷条件下培养的幼苗各1株移至盛有40ml含1mmol/L CaCl₂蒸馏水的三角瓶中，在室温下培养24h→用CaCl₂溶液调整三角瓶中溶液体积并收集三角瓶中溶液离心(4000rpm，0℃，4min)→取上清液用以进行Acph活性的测定，具体测定原理及方法参见文献[5]。最后分别折算出单株根系和单位根干重分泌Acph活性。

    1.2.4 Acph同工酶的等电聚焦(IEF) (1)Acph粗酶的制备：将在CK和-P条件下培养60天供试材料的根系加液氮研磨，磨细后每个样品称取0.2g，放入Ependorf管中，按每0.1g样品加200μl 0.1mol/L 醋酸钠溶液室温下提取1h，离心后取上清液备用。(2)制胶、电泳参考Liu Chunji博士论文(个人交流)。加样量15μl。(3)染色：染液配方如下：NaAc 50mmol/L pH5.5 100ml；MgCl₂^.2H₂O 1mol/L 1ml；Fast Garnet GBS Salt100mg；1%β-萘磷酸酯(50%的丙酮为溶剂)3ml。将重氮盐Fast Garnet GBS Salt溶于醋酸钠缓冲液中，然后加入β-萘磷酸酯，这时将会出现悬浮颗粒，将凝胶在30℃下保温1～5h，便会出现紫色或红色带，倾出染液，用水冲洗干净后便可观察或拍照。

    2 结果分析与讨论

    2.1 缺磷胁迫对中国春-帝国黑麦二体附加系根系分泌Acph能力的效应

    从表1及表2中可以清楚地看出，缺磷胁迫不仅使所有供试材料每株根系分泌Acph增加而且使单位根干重分泌Acph的能力增强，但增加和增强幅度因不同附加系而有显著差异。

    表1 不同附加系在CK与-P条件下每株根系分泌Acph活性(单位：μg/株^.h)

    Table1 Acph activities secreted by per plant roots of different CS-IMP

    addition lines under CK and -P conditions(μg/plant^.h) 处理

    Treatment

    附加系

    Additional lines

    1R

    2R

    3R

    4R

    5R

    6R

    7R

    CS

    CK

    0.42

    0.84

    0.94

    0.67

    1.72

    0.76

    0.90

    1.95

    -P

    4.86

    2.68

    3.52

    2.96

    3.68

    3.96

    4.50

    2.56

    -P/CK

    11.57

    3.19

    3.74

    4.42

    2.14

    5.21

    5.00

    1.31

    F=731.74>F_0.01=4.28

    注(Note)：以上各数据为3个重复平均值.Each datum in the table is the mean value of 3 replications

    表2 不同附加系在CK与-P条件下单位根干重分泌Acph活性(单位：μg/株^.h)

    Table 2 Acph activities secreted by per unit dry roots of different CS-IMP

    addition lines under CK and -P conditions (μg/plant^.h) 处理

    Treatment

    附加系

    Additional lines

    1R

    2R

    3R

    4R

    5R

    6R

    7R

    CS

    CK

    42.36

    28.60

    21.76

    15.08

    51.62

    14.48

    18.36

    31.80

    -P

    129.26

    60.54

    58.99

    55.39

    79.31

    85.26

    68.49

    62.00

    -P/CK

    3.05

    2.12

    2.71

    3.67

    1.56

    5.89

    3.73

    1.95

    F=731.74>F_0.01=4.28

    注(Note)：以上各数据为3个重复平均值.Each datum in the table is the mean value of 3 replications

    将各处理的每株根系分泌Acph进行比较看出(表1)，无论是在缺磷条件下分泌的绝对量，或比对照的增长幅度，均是1R附加系位居首位。其在缺磷条件下分泌的绝对量达4.86μg/株^.h，而对照仅为0.42μg/株^.h，缺磷下是对照的11.57倍；与此相反，背景亲本中国春在这两方面均为最差，其在缺磷下的绝对分泌量为2.56μg/株^.h，对照为1.950μg/株h，缺磷下仅是对照的1.31倍。

    就单位根干重的分泌强度而言(表2)，在不同附加系中仍以1R附加系的分泌强度最高，而4R附加系为最低，但就相对于对照的增幅而言，以6R附加系为最多，是对照的5.89倍，5R附加系最低，仅为对照的1.56倍。

    在缺磷胁迫下每株根系分泌Acph的能力较单位根干重Acph的分泌强度更适合作为耐低磷特性筛选的指标，因为它反映了根系大小与单位根干重分泌强度两方面的综合信息，因而更具实际意义，作者的另一实验证明了这一点。

    以上结果表明缺磷胁迫是Acph基因充分表达的诱导因子，帝国黑麦不同染色体对中国春小麦根系在缺磷胁迫下Acph的分泌具不同的效应，其中以1R的促进作用最为强烈。

    2.2 在供磷正常与缺磷胁迫下中国春-帝国黑麦二体附加系及其背景亲本根系Acph同工酶的IEF分析

    对中国春-帝国黑麦二体附加系及其背景亲本在供磷正常与缺磷胁迫下根系Acph同工酶的IEF分析表明(图1)：除帝国黑麦与1R附加系外，其他所有供试材料缺磷酶谱中均较对照酶谱中多出1条新带(图1箭头1所示)，而帝国黑麦与1R附加系的对照酶谱中也有这条带，但在缺磷酶谱中箭头2所示的位置却出现了两条新带，且颜色较深。以上结果说明新出现的带是在缺磷诱导下产生的，新带所代表的Acph同工酶基因的充分表达依赖于缺磷的诱导。缺磷下Acph活性较对照增加的那部分中，新带所代表同工酶占有较大的比重，因而该同工酶很可能与小麦耐低磷特性间的关系较为紧密，这有待于进一步探讨。

    图1 不同附加系及背景亲本中国春与帝国黑麦在Ch与

    P下Acph的IEF酶谱(点样量15l，两性电解质为pH3～9.5)

    点样顺序自左到右为：1.CS Ck；2.CS-P；3.2R CK；4.2R-P；5.6R CK；

    6.6R -P；7.7R CK；8.7R -P；9.Rye CK；10.Rye -P；11.1R CK；12.1R -P

    箭头示在缺磷下诱导出的新带(3R、4R及5R的酶谱与CS等同，结果未附)

    Fig.1 IEF diagram of Acph isozymes of different CS-IMP disomic addition lines under CK and -P conditions(15μl sample each lane,ampholine pH3～9.5)

    Loading sequence：1.CS Ck；2.CS-P；3.2R CK；4.2R-P；5.6R CK；

    6.6R -P；7.7R CK；8.7R -P；9.Rye CK；10.Rye -P；11.1R CK；12.1R -P

    Arrows indicate the new bands induced by Pstarvation

    (The patterns of 3R,4R and 5R are the same as CS,data not shown)

    在对照与缺磷下1R附加系酶谱与帝国黑麦酶谱基本相似，这一结果说明1R染色体上携带有黑麦中编码Acph同工酶的基因，这一结果与1R染色体对中国春小麦根系在低磷胁迫下分泌Acph有强烈促进作用的结果一致。1B/1R代换(易位系)在世界小麦生产中应用广泛，贡献巨大，这除了与1R染色体上所携带的抗病基因有关外，或许与该Acph基因也不无关系。作者的另一实验证明洛夫林10号(1BL/1RS易位系)在所供向的8个品种中在耐低磷特性方面表现最佳，且分泌Acph能力最强，据此推测，Acph基因应位于1RS上，这一推论还需进一步验证。

    Hart等^[5]将黑麦编码Acph的基因定位于7R上，而本实验则定位于1R上，说明黑麦中至少有两条染色体上携有编码Acph同工酶的基因。造成二者定位差异的原因可能与所用方法、提取Acph所用材料不同有关，前者是以种子为提取Acph的材料，按分子量大小进行同工酶的分离，而后者则是以在CK或-P下培养了60天幼苗的根系为提取Acph的材料，按等电点的差异对Acph同工酶进行分离的。但作者认为缺磷胁迫这一诱导因子的有无是造成二者定位差异的最主要原因。

    关于在缺磷下诱导出的新Acph同工酶与耐低磷特性间的关系尚待进一步研究。

    参考文献

    [1]李继云，李振声等.有效利用土壤营养元素的作物育种新技术研究.中国科学(B辑)，1995，25(1)：41～47.

    [2]张福琐.根系分泌物及其在植物营养中的应用.北京农业大学学报，1991，18(1)：24～28.

    [3]刘建中.利用植物自身潜力提高土壤磷的生物有效性.生态农业研究，1994，5：16～23.

    [4]Tadano T.Secretion of acid phosphatase by the roots of several crop species under phosphorus-deficient conditions.Soil Sci.Plant Nutr.,1991,37(1):129～140.

    [5]Hart G.Chromosomal location and evolution of isozyme structural genes in hexaploid wheat.Heredity,1977,39(2):263～277.

    [6]Schlegel R et al.Mineral nutrition and genetical control in cereals.Vortr pflanzenzuchtg,1991,20:85～94.

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/28/57/856.htm