单抗TIGTC-Ⅲ片段F(ab′)2的制备及其放射免疫显像研究
作者：施乐华 杨家和 崔贞福 吴孟超 潘文舟 孔令山 王明库
单位：施乐华 杨家和 崔贞福 吴孟超 (第二军医大学东方肝胆外科医院，上海200433)；潘文舟 孔令山 (第二军医大学长海医院，上海200433)；王明库 (黑龙江红兴隆管局中心医院，黑龙江155811)
关键词：单克隆抗体；F(ab′)2片段；放射免疫显像
中国免疫学杂志990111 中国图书分类号 R392-33 R814.43
摘 要 目的：将抗人原发性肝癌(PLC)单抗TIGTC-Ⅲ，用胃蛋白酶法消化成F(ab′)2片段，标记131I后进行裸鼠人肝癌移植瘤的体内定位研究。方法：采用胃蛋白酶消化法，进行裸鼠体内核素显像。结果：消化产率为31.7%±2.4%，经细胞结合实验证明F(ab′)2具有良好的免疫活性，抗体片段进入裸鼠体内后，与完整抗体比，进入肿瘤的速度快，生物学分布特异性高，定位指数上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明显缩短。结论：F(ab′)2与全抗体比较可使成像时间提前，定位清晰。
, 百拇医药
The preparation of F(ab′)2 fragment of monoclonal antibody TIGTC-Ⅲ and its application in tumor radioimmunoimagine
SHI Le-Hua,YANG Jia-He,CUI Zhen-Fu et al.
Eastern Hepatobiary Surgery Hospital,The Second Military Medical College,Shanghai 200433
Abstract Objective：In order to realize the immunoimmaging with F(ab′)2 fragment of monoclonal antibody (TIGIC-Ⅲ) for PLC.Methods：Monoclonal antibody(TIGTC-Ⅲ) against human primary liver cancer(PLC) was digested into F(ab′)2 fragment by pepsin digestion.After labelled with 131 I and 125 I radioiodinated F(ab′)2 was injected into nude mice bearing tumor xenografts of PLC via tail vein and radioimmunoimagine was performed.Results:The experiment results showed that the yield of pure F(ab′)2 was 31.7%±2.4%,the immunoreactivity of F(ab′)2 based on the cell binding studies was retained well.After the injection of 131 I-F(ab′)2 into PLC tumor-bearing nude mice,photoscintigraphy was performed at intervals of 12 h.The xenografts were visualized distinctly during 24～96 h.Conclusion：The ratio of tumor to non-tumor(T/NT) was higher than those of the intact IgG in all tissues.Xenografts of PLC in nude mice acumulated TIGTC-Ⅲ.The excretion of radioactivity was decreased repidly.
, http://www.100md.com
Key words Monoclonal antibody F(ab′)2 Radioimmunoimagine
用胃蛋白酶法制成TIGTC-Ⅲ的活性片段F(ab′)2，标记上131I后进行了裸鼠人肝癌移植模型的放射免疫显像(RII)研究。
1 材料与方法
1.1 单抗TIGTC-Ⅲ的制备 TIGTC-Ⅲ系将肝癌细胞株HEPG2免疫Balb/c小鼠后将其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合而成的杂交瘤分泌的一系列抗体之一，已经抗体的专一性分析[1]。
1.2 抗体片段F(ab′)2的制备与纯化 按Harlow方法进行[2]。
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1.3 TIGTC-Ⅲ和F(ab′)2的标记及其免疫活性测定 用氯胺T法[3]。标记物用Sephadex G-25柱分离，去除游离碘。0.22 μm微孔滤膜除菌，用细胞结合分析法测定免疫活性。
1.4 荷人肝癌裸鼠模型的建立[4] 将PLC细胞接种在4周龄的Balb/c裸小鼠腋部皮下，待肿块长到0.8 cm3左右时进行定位及治疗研究。
1.5 放射免疫显像及抗体的生物学分布
1.5.1 动物处理 标记抗体注射前72 h起，在饮用水中加1%碘化钾，以封闭裸鼠甲状腺对碘的摄取。
1.5.2 TIGTC-Ⅲ及F(ab′)2在荷瘤裸鼠体内的分布[5] 12只荷瘤裸鼠，每鼠注射7.4×106 Bq的125I-F(ab′)2，给药后每24 h处死3只，取肿瘤、血液及各脏器。分别称重并测其放射性算出T/NT。另取3只荷瘤鼠，从尾静脉注入125I-F(ab′)2及非特异性的131I-F(ab′)2，48 h后处死，取器官组织称重后分别测放射性计数，计算定位指数。
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1.5.3 放射免疫显像 每鼠注射200 μCi/0.1 mg的131I-F(ab′)2，对照组注射相同剂量的非特异131I-
F(ab′)2，每12 h行γ照射。
1.5.4 标记抗体的生物半衰期 42只8周龄的Balb/c小鼠，分完整抗体组与F(ab′)2组。分别于给药后12、24、48、72、96、120 h处死，分离血清并加200 μl肝细胞(1×106)，测放射性计数后算出抗体的生物半衰期。
1.5.5 TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的体内药代动力学 取6只8周龄Balb/c小鼠分全抗体与F(ab′)2组，给药后分别于6、12、24、48、72、96、120 h自尾静脉取血10 μl，测放射性后绘制放射性-时间曲线。
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2 结果
2.1 抗体片段的制备 纯化TIGTC-Ⅲ，经电泳检测纯度大于95%。用胃蛋白酶消化，16 h以上消化完全。消化液经层析后第1峰为F(ab′)2。其产率为31.7%±2.4%。
2.2 标记抗体的质量控制 TIGTC-Ⅲ的标记率为72%，比活度为7.54 MBq/mg，放化纯度92.5%±1.7%。TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2标记上碘后，与PLC细胞的结合率分别为45%与28%，mIgG与其F(ab′)2的结合率均小于5%。
2.3 不同时间每克肿瘤及其它组织对TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的摄取量 见表1。
2.4 不同时间的T/NT值 见表2。
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2.5 定位指数 静注碘标抗体后48 h，测得定位指数TIGTC-Ⅲ为3.45，TIGTC-Ⅲ F(ab′)2为5.88。
2.6 荷瘤鼠放射免疫显像 注入抗体后24 h瘤区有放射性浓聚，36 h后肿瘤显像。显像最佳时间为全抗体96 h左右(图1，B)，F(ab′)2 36～48 h(图1，A)，mIgG整个显像过程无明显浓聚(图1，C)。
2.7 抗体的清除速率及生物半衰期 F(ab′)2在心血管的清除明显快于完整抗体，F(ab′)2的生物半衰期约20.0 h，全抗体为52.6 h左右，两者差异显著。
表1 裸鼠组织对完整抗体及其片段的摄取率
Tab.1 Percentage intake of TIGTC-Ⅲ and F(ab′)2 pergram of tissue Tissue
, 百拇医药
24 h
48 h
72 h
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
Tumor
0.31
1.41
, 百拇医药
2.21
0.79
3.11
0.68
Heart
0.46
0.36
0.48
0.30
0.45
0.15
Blood
2.51
, 百拇医药
1.45
1.87
0.62
1.62
0.41
Kidney
0.91
1.75
0.92
6.87
0.76
0.59
Liver
, 百拇医药
1.62
0.50
1.86
0.32
1.27
0.20
Lung
0.86
0.94
0.67
0.58
0.63
0.22
, 百拇医药
Muscle
0.36
0.25
0.31
0.24
0.42
0.15
Spleen
1.39
0.81
1.52
0.40
1.23
, 百拇医药
0.19
Bone
0.33
0.21
0.35
0.19
0.47
0.11
表2 裸鼠注射完整抗体及其片段后的T/NT值
Tab.2 T/NT values of different tissue in nude mice after in vivo injection of TIGTC-Ⅲ & F(ab′)2 Tissue
, http://www.100md.com
24 h
48 h
72 h
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
Cerebrum
19.50
18.33
, http://www.100md.com
21.80
20.20
23.50
22.80
Bone
2.70
2.85
2.95
3.02
3.20
2.85
Blood
0.69
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0.89
0.71
1.18
0.78
1.22
Heart
1.38
0.69
2.50
2.88
3.10
2.72
Intestine
, 百拇医药
2.25
1.12
4.75
4.86
5.30
5.58
Kidney
1.08
0.43
2.15
0.56
2.40
0.81
, 百拇医药
Liver
2.07
2.55
2.60
3.84
3.02
4.24
Lung
1.27
0.98
1.34
0.76
1.50
, 百拇医药
0.80
Muscle
3.50
3.25
3.78
3.45
3.85
3.47
Skin
0.43
0.66
0.98
1.72
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1.42
1.56
Spleen
1.67
1.90
2.25
3.44
2.48
3.89
Stomach
1.41
0.72
2.85
, http://www.100md.com
3.98
3.70
4.65
图1 F(ab′)2注入荷人肝癌裸鼠体内后72 h的RII
Fig.1 The radio immunoimage of PLC-bearing nude mice 72 h after injection of F(ab′)2
3 讨论
在以单抗为载体的放射免疫显像中，由于完整抗体的Fc段常与组织细胞的Fc受体结合而使本底清除减慢，从而影响成像，抗体片段优于完整抗体已被许多学者所证实[6]。我们实验结果亦表明F(ab′)2比完整抗体有如下优点：F(ab′)2进入肿瘤速度快，生物学分布特异性提高，定位指数上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明显缩短，从而使成像时间提前，成像清晰。
, http://www.100md.com
随着影像技术的发展，使原发性肝癌的诊断及定位变得较为容易，因此，单抗在肝癌的应用主要在于放射免疫治疗，由于F(ab′)2的以上特点，使抗体片段在肿瘤部位的摄取量低于完整抗体，且生物半衰期短，免疫活性低，从而用于肝癌导向治疗不如完整抗体。如何解决这一矛盾将是以后进一步研究的目标。
在抗体片段的制备中有两个基本要求，即尽可能高的消化产率及保留免疫活性。本实验采用胃蛋白酶消化法，此法虽然产率较低，但方法简便，免疫活性较高。F(ab′)2片段的免疫活性在标记的前后均低于全抗体，可能是消化过程中酶对其损伤所致，为保留抗体的免疫活性，应尽量缩短反应时间。
作者简介：施乐华，男，40岁，肝胆外科学博士；
指导教师，吴孟超，男，中科院院士，博士生导师，主要研究肝癌的基础研究与临床治疗
, 百拇医药 4 参考文献
1 施乐华，吴孟超，陈 汉 et al.分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤TIGTC的制备及专一性分析.第二军医大学学报，1996；17(4)：313
2 Harlow E D.Antibodies a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1988:615
3 肖祥熊.实用放射免疫分析及其临床意义.上海：上海同济大学出版社，1985：5
4 刘康达，鱼 达，包炎明 et al.裸鼠人肝癌模型在肝癌导向研究中的应用.中华肿瘤杂志，1988；10(6)：414
5 Riethmulley G,Schneider-Gadicke B,Schlimok G et al.Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes C colorectal carcinoma.Lancet,1994;343:1177
6 Goldenberg D M.Current statns of cancer imaging with radiolabeled antibodies.J Cancer Res,1987;113:203
〔收稿1996-05-29 修回1998-03-12〕, http://www.100md.com
单位：施乐华 杨家和 崔贞福 吴孟超 (第二军医大学东方肝胆外科医院，上海200433)；潘文舟 孔令山 (第二军医大学长海医院，上海200433)；王明库 (黑龙江红兴隆管局中心医院，黑龙江155811)
关键词：单克隆抗体；F(ab′)2片段；放射免疫显像
中国免疫学杂志990111 中国图书分类号 R392-33 R814.43
摘 要 目的：将抗人原发性肝癌(PLC)单抗TIGTC-Ⅲ，用胃蛋白酶法消化成F(ab′)2片段，标记131I后进行裸鼠人肝癌移植瘤的体内定位研究。方法：采用胃蛋白酶消化法，进行裸鼠体内核素显像。结果：消化产率为31.7%±2.4%，经细胞结合实验证明F(ab′)2具有良好的免疫活性，抗体片段进入裸鼠体内后，与完整抗体比，进入肿瘤的速度快，生物学分布特异性高，定位指数上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明显缩短。结论：F(ab′)2与全抗体比较可使成像时间提前，定位清晰。
, 百拇医药
The preparation of F(ab′)2 fragment of monoclonal antibody TIGTC-Ⅲ and its application in tumor radioimmunoimagine
SHI Le-Hua,YANG Jia-He,CUI Zhen-Fu et al.
Eastern Hepatobiary Surgery Hospital,The Second Military Medical College,Shanghai 200433
Abstract Objective：In order to realize the immunoimmaging with F(ab′)2 fragment of monoclonal antibody (TIGIC-Ⅲ) for PLC.Methods：Monoclonal antibody(TIGTC-Ⅲ) against human primary liver cancer(PLC) was digested into F(ab′)2 fragment by pepsin digestion.After labelled with 131 I and 125 I radioiodinated F(ab′)2 was injected into nude mice bearing tumor xenografts of PLC via tail vein and radioimmunoimagine was performed.Results:The experiment results showed that the yield of pure F(ab′)2 was 31.7%±2.4%,the immunoreactivity of F(ab′)2 based on the cell binding studies was retained well.After the injection of 131 I-F(ab′)2 into PLC tumor-bearing nude mice,photoscintigraphy was performed at intervals of 12 h.The xenografts were visualized distinctly during 24～96 h.Conclusion：The ratio of tumor to non-tumor(T/NT) was higher than those of the intact IgG in all tissues.Xenografts of PLC in nude mice acumulated TIGTC-Ⅲ.The excretion of radioactivity was decreased repidly.
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Key words Monoclonal antibody F(ab′)2 Radioimmunoimagine
用胃蛋白酶法制成TIGTC-Ⅲ的活性片段F(ab′)2，标记上131I后进行了裸鼠人肝癌移植模型的放射免疫显像(RII)研究。
1 材料与方法
1.1 单抗TIGTC-Ⅲ的制备 TIGTC-Ⅲ系将肝癌细胞株HEPG2免疫Balb/c小鼠后将其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合而成的杂交瘤分泌的一系列抗体之一，已经抗体的专一性分析[1]。
1.2 抗体片段F(ab′)2的制备与纯化 按Harlow方法进行[2]。
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1.3 TIGTC-Ⅲ和F(ab′)2的标记及其免疫活性测定 用氯胺T法[3]。标记物用Sephadex G-25柱分离，去除游离碘。0.22 μm微孔滤膜除菌，用细胞结合分析法测定免疫活性。
1.4 荷人肝癌裸鼠模型的建立[4] 将PLC细胞接种在4周龄的Balb/c裸小鼠腋部皮下，待肿块长到0.8 cm3左右时进行定位及治疗研究。
1.5 放射免疫显像及抗体的生物学分布
1.5.1 动物处理 标记抗体注射前72 h起，在饮用水中加1%碘化钾，以封闭裸鼠甲状腺对碘的摄取。
1.5.2 TIGTC-Ⅲ及F(ab′)2在荷瘤裸鼠体内的分布[5] 12只荷瘤裸鼠，每鼠注射7.4×106 Bq的125I-F(ab′)2，给药后每24 h处死3只，取肿瘤、血液及各脏器。分别称重并测其放射性算出T/NT。另取3只荷瘤鼠，从尾静脉注入125I-F(ab′)2及非特异性的131I-F(ab′)2，48 h后处死，取器官组织称重后分别测放射性计数，计算定位指数。
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1.5.3 放射免疫显像 每鼠注射200 μCi/0.1 mg的131I-F(ab′)2，对照组注射相同剂量的非特异131I-
F(ab′)2，每12 h行γ照射。
1.5.4 标记抗体的生物半衰期 42只8周龄的Balb/c小鼠，分完整抗体组与F(ab′)2组。分别于给药后12、24、48、72、96、120 h处死，分离血清并加200 μl肝细胞(1×106)，测放射性计数后算出抗体的生物半衰期。
1.5.5 TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的体内药代动力学 取6只8周龄Balb/c小鼠分全抗体与F(ab′)2组，给药后分别于6、12、24、48、72、96、120 h自尾静脉取血10 μl，测放射性后绘制放射性-时间曲线。
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2 结果
2.1 抗体片段的制备 纯化TIGTC-Ⅲ，经电泳检测纯度大于95%。用胃蛋白酶消化，16 h以上消化完全。消化液经层析后第1峰为F(ab′)2。其产率为31.7%±2.4%。
2.2 标记抗体的质量控制 TIGTC-Ⅲ的标记率为72%，比活度为7.54 MBq/mg，放化纯度92.5%±1.7%。TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2标记上碘后，与PLC细胞的结合率分别为45%与28%，mIgG与其F(ab′)2的结合率均小于5%。
2.3 不同时间每克肿瘤及其它组织对TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的摄取量 见表1。
2.4 不同时间的T/NT值 见表2。
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2.5 定位指数 静注碘标抗体后48 h，测得定位指数TIGTC-Ⅲ为3.45，TIGTC-Ⅲ F(ab′)2为5.88。
2.6 荷瘤鼠放射免疫显像 注入抗体后24 h瘤区有放射性浓聚，36 h后肿瘤显像。显像最佳时间为全抗体96 h左右(图1，B)，F(ab′)2 36～48 h(图1，A)，mIgG整个显像过程无明显浓聚(图1，C)。
2.7 抗体的清除速率及生物半衰期 F(ab′)2在心血管的清除明显快于完整抗体，F(ab′)2的生物半衰期约20.0 h，全抗体为52.6 h左右，两者差异显著。
表1 裸鼠组织对完整抗体及其片段的摄取率
Tab.1 Percentage intake of TIGTC-Ⅲ and F(ab′)2 pergram of tissue Tissue
, 百拇医药
24 h
48 h
72 h
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
Tumor
0.31
1.41
, 百拇医药
2.21
0.79
3.11
0.68
Heart
0.46
0.36
0.48
0.30
0.45
0.15
Blood
2.51
, 百拇医药
1.45
1.87
0.62
1.62
0.41
Kidney
0.91
1.75
0.92
6.87
0.76
0.59
Liver
, 百拇医药
1.62
0.50
1.86
0.32
1.27
0.20
Lung
0.86
0.94
0.67
0.58
0.63
0.22
, 百拇医药
Muscle
0.36
0.25
0.31
0.24
0.42
0.15
Spleen
1.39
0.81
1.52
0.40
1.23
, 百拇医药
0.19
Bone
0.33
0.21
0.35
0.19
0.47
0.11
表2 裸鼠注射完整抗体及其片段后的T/NT值
Tab.2 T/NT values of different tissue in nude mice after in vivo injection of TIGTC-Ⅲ & F(ab′)2 Tissue
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24 h
48 h
72 h
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
TIGTC-Ⅲ
F(ab′)2
Cerebrum
19.50
18.33
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21.80
20.20
23.50
22.80
Bone
2.70
2.85
2.95
3.02
3.20
2.85
Blood
0.69
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0.89
0.71
1.18
0.78
1.22
Heart
1.38
0.69
2.50
2.88
3.10
2.72
Intestine
, 百拇医药
2.25
1.12
4.75
4.86
5.30
5.58
Kidney
1.08
0.43
2.15
0.56
2.40
0.81
, 百拇医药
Liver
2.07
2.55
2.60
3.84
3.02
4.24
Lung
1.27
0.98
1.34
0.76
1.50
, 百拇医药
0.80
Muscle
3.50
3.25
3.78
3.45
3.85
3.47
Skin
0.43
0.66
0.98
1.72
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1.42
1.56
Spleen
1.67
1.90
2.25
3.44
2.48
3.89
Stomach
1.41
0.72
2.85
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3.98
3.70
4.65
图1 F(ab′)2注入荷人肝癌裸鼠体内后72 h的RII
Fig.1 The radio immunoimage of PLC-bearing nude mice 72 h after injection of F(ab′)2
3 讨论
在以单抗为载体的放射免疫显像中，由于完整抗体的Fc段常与组织细胞的Fc受体结合而使本底清除减慢，从而影响成像，抗体片段优于完整抗体已被许多学者所证实[6]。我们实验结果亦表明F(ab′)2比完整抗体有如下优点：F(ab′)2进入肿瘤速度快，生物学分布特异性提高，定位指数上升，血清本底下降迅速，生物半衰期明显缩短，从而使成像时间提前，成像清晰。
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随着影像技术的发展，使原发性肝癌的诊断及定位变得较为容易，因此，单抗在肝癌的应用主要在于放射免疫治疗，由于F(ab′)2的以上特点，使抗体片段在肿瘤部位的摄取量低于完整抗体，且生物半衰期短，免疫活性低，从而用于肝癌导向治疗不如完整抗体。如何解决这一矛盾将是以后进一步研究的目标。
在抗体片段的制备中有两个基本要求，即尽可能高的消化产率及保留免疫活性。本实验采用胃蛋白酶消化法，此法虽然产率较低，但方法简便，免疫活性较高。F(ab′)2片段的免疫活性在标记的前后均低于全抗体，可能是消化过程中酶对其损伤所致，为保留抗体的免疫活性，应尽量缩短反应时间。
作者简介：施乐华，男，40岁，肝胆外科学博士；
指导教师，吴孟超，男，中科院院士，博士生导师，主要研究肝癌的基础研究与临床治疗
, 百拇医药 4 参考文献
1 施乐华，吴孟超，陈 汉 et al.分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤TIGTC的制备及专一性分析.第二军医大学学报，1996；17(4)：313
2 Harlow E D.Antibodies a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1988:615
3 肖祥熊.实用放射免疫分析及其临床意义.上海：上海同济大学出版社，1985：5
4 刘康达，鱼 达，包炎明 et al.裸鼠人肝癌模型在肝癌导向研究中的应用.中华肿瘤杂志，1988；10(6)：414
5 Riethmulley G,Schneider-Gadicke B,Schlimok G et al.Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes C colorectal carcinoma.Lancet,1994;343:1177
6 Goldenberg D M.Current statns of cancer imaging with radiolabeled antibodies.J Cancer Res,1987;113:203
〔收稿1996-05-29 修回1998-03-12〕, http://www.100md.com