可溶性gp130(sgp130)在IL-6/IL-6R系统中的生物学作用研究
作者：顾宗江 张学光 戴燕芳
单位：苏州医学院免疫研究室，苏州215007
关键词：可溶性gp130；生物学作用；负性调节
中国免疫学杂志990102 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：在成功克隆、表达和纯化人可溶性gp130(sgp130)分子的基础上，研究sgp130在白介素-6(IL-6)/白介素-6受体(IL-6R)系统中的生物学作用。方法：采用转人膜型gp130的BAF-130细胞和人多发性骨髓瘤(MM)细胞株XG4-CNTF和分离得到新鲜MM细胞，通过3H-TdR的掺入做生物学检测，观察sgp130在上述细胞上对IL-6生物学活性的影响。结果：sgp130对IL-6和可溶性IL-6R引起BAF-130细胞的增殖有抑制作用。此外，sgp130对IL-6刺激XG4-CNTF细胞和分离得到新鲜MM细胞的增殖也有抑制作用。结论：sgp130为IL-6的拮抗剂。
, http://www.100md.com
Study of biological effect of soluble gp130(sgp130)molecule on the system of interlukin-6/interlukin-6 recepter
GU Zong-Jiang,ZHANG Xue-Guang,DAI Yan-Fang.
Immunology Research Unit,Suzhou Medical College,Suzhou 215007
Abstract Objective：Study of the biological effect of soluble gp130(sgp130)molecule on the system of interlukin-6(IL-6)/IL-6 recepter on the basis of successful cloning,expression and purification of sgp130 molecule.Methods:The membrane gp130-transduced cell line BAF-130,human multiple myeloma(MM)cell line XG4-CNTF and freshly isolated MM cells were used for biological assa by means of 3HTdR incorporation in order to observe biological effect of sgp130 on IL-6 activity to these cells.Results:The results demonstrated that sgp130 displayed inhibitory role in the proliferation of BAF-130 cell line induced by IL-6 and soluble IL-6 recepter.In addition,sgp130 also showed the inhibitory effects on the proliferation,of XG4-CNTF cell lne stimulated by IL-6 and freshly isolated MM cells.Conclusion:These results suggested that sgp130 was an antagonist of IL-6.
, 百拇医药
Key words Soluble gp130 Biological effect Negative regulation
gp130分子是分子量为130 kD的糖蛋白，是白介素-6(IL-6)的信号传导链。IL-6和IL-6受体(IL-6R)结合后，并不引起信号的跨膜传递，还必须与二个gp130分子结合，使之发生同二聚体化，导致细胞浆内Jak激酶的活化，引起信号传递[1]。gp130分子除以膜型形式表达在细胞膜上外，目前发现也有以可溶性的形式(sgp130)存在于血浆中。但对sgp130的生物学作用的探讨，尚缺乏系统的研究。我们利用已克隆表达和纯化的sgp130[2]，对sgp130的生物学作用进行了研究探讨。本文报道sgp130对IL-6/IL-6R系统的作用。
1 材料与方法
1.1 试剂 重组人IL-6(rhIL-6)、重组人可溶性IL-6R(rhsIL-6R)和睫状神经营养因子(CNTF)由法国Klein博士赠送。抗gp130单克隆抗体B-R3由本室研制[3]；抗浆细胞抗体BB4(抗Syndecan-1,CD138)由法国Wijdense博士提供。连接磁珠的羊抗鼠抗体购自法国免疫公司。木瓜蛋白酶为Sigma产品。
, 百拇医药
1.2 细胞 WEHI为小鼠细胞，可分泌IL-3，被常规培养在含10%FCS的RPMI1640中。BAF-130是转了人膜型gp130分子的转基因细胞株[4]，用含10%WEHI细胞上清的培养基培养。XG4-CNTF为人多发性骨髓瘤(MM)细胞，是来自于XG4细胞的一个亚克隆。XG4-CNTF细胞除对IL-6高度敏感外，对白血病抑制因子(LIF)、制瘤素(OM)和CNTF也高度敏感[5]。它被常规培养在含1 ng/ml的CNTF培养基中。人多发性骨髓瘤新鲜细胞来自于浆细胞性白血病病人的外周血，经肝素抗凝、Ficoll分离出单个核细胞后，用BB4抗体和磁珠分离纯化。磁珠的解离用木瓜蛋白酶。表达和分泌sgp130的CHO细胞由本室所建立[2]，表达量可达2 μg/ml。sgp130的纯化见参考文献[2]。
1.3 BAF-130、XG4-CNTF和新鲜MM细胞的增殖抑制试验 这三种细胞分别以5 000/孔加入96孔板中，然后分别加入各种组合的IL-6、sIL-6R、sgp130和抗gp130单抗B-R3。培养5 d后，加入0.5 μCi/孔的3H-TdR，继续培养8 h收集细胞，在液闪仪(Beckman)上测定cpm数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 sgp130抑制IL-6/sIL-6R复合物对BAF-130的增殖作用 BAF-130细胞膜上无鼠IL-6R和gp130分子，但表达人gp130，IL-6和sIL-6R单独应用时无作用，但合用时，可刺激BAF-130细胞增殖。sgp130部分抑制IL-6/sIL-6R对BAF-130细胞的刺激作用，抗gp130则可几乎全部抑制这种刺激作用(图1)。
2.2 sgp130抑制IL-6对XG4-CNTF的增殖作用 XG4-CNTF对IL-6高度敏感，在IL-6为20 pg/ml时，就可达到最大增殖。sgp130对其同样有部分抑制作用(图2)。
2.3 sgp130对新鲜MM细胞的抑制作用 IL-6是MM细胞的主要生长因子，在体外分离得到的新鲜MM细胞对IL-6的刺激都有增殖反应[6]，sgp130对这种增殖反应也有部分抑制作用(图3)。
, 百拇医药
图1 sgp130部分抑制IL-6/sIL-6R对BAF-130的刺激作用
Fig.1 sgp130 inhibited partially the stimulating effect of IL-6/sIL-6R on BAF-130
图2 sgp130部分抑制IL-6对XG4-CNTF的刺激作用
Fig.2 sgp130 exhibited partial inhibitory role in proliferation of XG4-CNTF stimulated by IL-6
图3 sgp130部分抑制IL-6对新鲜MM细胞刺激作用
, 百拇医药
Fig.3 Proliferative role of IL-6 in freshly ioslated MM cells was partially inhibited by sgp130
3 讨论
gp130是一个重要分子，几乎表达于体内各种组织细胞上，它参与着体内的一些重要的生理过程。sgp130为gp130分子的胞外部分。已有报道在正常人血浆中存在着可溶性IL-6受体，其含量可达约75 ng/ml[7，8]。sIL-6R与大部分可溶性细胞因子受体不同，一旦与IL-6结合，形成IL-6/sIL-6R复合物后，可以和膜型IL-6R同样的亲和力与膜型gp130分子结合，引起信号传导。但通常情况下，正常人血浆中含有的IL-6量很少，只有在炎症、感染和患有某些肿瘤等情况下，IL-6的含量会上升，IL-6和sIL-6R形成复合物后，就可作用于表达膜型gp130分子的细胞，引起生物学效应。因此，体内必定存在着某种负性调节机制，对这种效应进行负性调节。事实上，本室利用我们自己研制的抗gp130单抗[3]，对正常人血浆中是否存在sgp130进行了研究，结果发现正常人血浆中sgp130的含量可达410 ng/ml(刘俊恒等，待发表资料)。Narazaki等也曾报道，在正常人血浆中存在着自然产生的sgp130[8]，并且在体外实验中，这种自然产生的sgp130对IL-6/sIL-6R复合物介导BAF-130细胞的增殖有抑制作用。我们用基因工程生产纯化的重组sgp130(rsgp130)，在BAF-130细胞上同样有此抑制作用。此外，rsgp130对IL-6有反应的细胞也起抑制作用(图2、图3)。从我们和Narazaki等的结果推测，在体内对IL-6和sIL-6R的生物学效应起着负性调节作用的关键因子之一可能就是sgp130。由于gp130除了作为IL-6的信号传导链外，也是OM、LIF、CNTF、IL-11和心肌营养因子-1(CT-1)的共用信号传导链。用基因工程方法获得的大量sgp130，为以后在体外研究sgp130对这些细胞因子的负性调节作用提供很好的物质基础，具体结果将另文发表。
, 百拇医药
可溶性gp130(sgp130)在IL-6/IL-6R系统中的生物学作用研究 本课题受国家自然科学基金(39670689)和国家教委留学回国人员基金(97436)资助
戴燕芳 苏州医学院脑神经研究室，苏州215006
作者简介：顾宗江，男，42岁，博士，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤免疫、免疫调节等研究
4 参考文献
1 Kishimoto T, Akira S, Narazaki M et al. Interleukin-6 family of cytokines and gp130.Blood,1995；86:1234.
2 顾宗江，张学光，Hallet M M et al. 人可溶性gp130(sgp130)分子的克隆与表达.苏州医学院学报，1998；18(8)：781
, http://www.100md.com
3 Gu Z J, Wijdense J,Zhang X G et al. Anti-gp130 transducer monoclonal antibodies specifically inhibiting cilary neurotrophic factor,interleukin-6,interleukin-11,leukemia inhibitory factor or oncostatin M. J Immunol Methods，1996;190:21
4 顾宗江，张学光，Hallet M M et al. 人膜型gp130分子的克隆与表达.苏州医学院学报，1998；18(10)：1001
5 Gu Z J，Zhang X G,Hallet M M et al. A ciliary neurotrophic factor sensitive human myeloma cell line.Exp Hematol,1996;24:1195
, 百拇医药
6 Klein B,Zhang X G,Lu Z Y et al. Interlukin-6 in human multiple myeloma.Blood,1995;85:863
7 Honda M,Yamamoto S,Cheng M et al. Human soluble Il-6 receptor:Its detection and enhanced release by HIV infection.J Immunol,1992;148:2175
8 Narazaki M,Yasukawa K， Saito T et al. Soluble forms of the interleukin-6 signal-transducing receptor component in human serum possessing a potential to inhibit signals through membraneanchored gp130.Blood,1993;82:1120
〔收稿1998-03-10 修回1998-10-16〕, http://www.100md.com
单位：苏州医学院免疫研究室，苏州215007
关键词：可溶性gp130；生物学作用；负性调节
中国免疫学杂志990102 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：在成功克隆、表达和纯化人可溶性gp130(sgp130)分子的基础上，研究sgp130在白介素-6(IL-6)/白介素-6受体(IL-6R)系统中的生物学作用。方法：采用转人膜型gp130的BAF-130细胞和人多发性骨髓瘤(MM)细胞株XG4-CNTF和分离得到新鲜MM细胞，通过3H-TdR的掺入做生物学检测，观察sgp130在上述细胞上对IL-6生物学活性的影响。结果：sgp130对IL-6和可溶性IL-6R引起BAF-130细胞的增殖有抑制作用。此外，sgp130对IL-6刺激XG4-CNTF细胞和分离得到新鲜MM细胞的增殖也有抑制作用。结论：sgp130为IL-6的拮抗剂。
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Study of biological effect of soluble gp130(sgp130)molecule on the system of interlukin-6/interlukin-6 recepter
GU Zong-Jiang,ZHANG Xue-Guang,DAI Yan-Fang.
Immunology Research Unit,Suzhou Medical College,Suzhou 215007
Abstract Objective：Study of the biological effect of soluble gp130(sgp130)molecule on the system of interlukin-6(IL-6)/IL-6 recepter on the basis of successful cloning,expression and purification of sgp130 molecule.Methods:The membrane gp130-transduced cell line BAF-130,human multiple myeloma(MM)cell line XG4-CNTF and freshly isolated MM cells were used for biological assa by means of 3HTdR incorporation in order to observe biological effect of sgp130 on IL-6 activity to these cells.Results:The results demonstrated that sgp130 displayed inhibitory role in the proliferation of BAF-130 cell line induced by IL-6 and soluble IL-6 recepter.In addition,sgp130 also showed the inhibitory effects on the proliferation,of XG4-CNTF cell lne stimulated by IL-6 and freshly isolated MM cells.Conclusion:These results suggested that sgp130 was an antagonist of IL-6.
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Key words Soluble gp130 Biological effect Negative regulation
gp130分子是分子量为130 kD的糖蛋白，是白介素-6(IL-6)的信号传导链。IL-6和IL-6受体(IL-6R)结合后，并不引起信号的跨膜传递，还必须与二个gp130分子结合，使之发生同二聚体化，导致细胞浆内Jak激酶的活化，引起信号传递[1]。gp130分子除以膜型形式表达在细胞膜上外，目前发现也有以可溶性的形式(sgp130)存在于血浆中。但对sgp130的生物学作用的探讨，尚缺乏系统的研究。我们利用已克隆表达和纯化的sgp130[2]，对sgp130的生物学作用进行了研究探讨。本文报道sgp130对IL-6/IL-6R系统的作用。
1 材料与方法
1.1 试剂 重组人IL-6(rhIL-6)、重组人可溶性IL-6R(rhsIL-6R)和睫状神经营养因子(CNTF)由法国Klein博士赠送。抗gp130单克隆抗体B-R3由本室研制[3]；抗浆细胞抗体BB4(抗Syndecan-1,CD138)由法国Wijdense博士提供。连接磁珠的羊抗鼠抗体购自法国免疫公司。木瓜蛋白酶为Sigma产品。
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1.2 细胞 WEHI为小鼠细胞，可分泌IL-3，被常规培养在含10%FCS的RPMI1640中。BAF-130是转了人膜型gp130分子的转基因细胞株[4]，用含10%WEHI细胞上清的培养基培养。XG4-CNTF为人多发性骨髓瘤(MM)细胞，是来自于XG4细胞的一个亚克隆。XG4-CNTF细胞除对IL-6高度敏感外，对白血病抑制因子(LIF)、制瘤素(OM)和CNTF也高度敏感[5]。它被常规培养在含1 ng/ml的CNTF培养基中。人多发性骨髓瘤新鲜细胞来自于浆细胞性白血病病人的外周血，经肝素抗凝、Ficoll分离出单个核细胞后，用BB4抗体和磁珠分离纯化。磁珠的解离用木瓜蛋白酶。表达和分泌sgp130的CHO细胞由本室所建立[2]，表达量可达2 μg/ml。sgp130的纯化见参考文献[2]。
1.3 BAF-130、XG4-CNTF和新鲜MM细胞的增殖抑制试验 这三种细胞分别以5 000/孔加入96孔板中，然后分别加入各种组合的IL-6、sIL-6R、sgp130和抗gp130单抗B-R3。培养5 d后，加入0.5 μCi/孔的3H-TdR，继续培养8 h收集细胞，在液闪仪(Beckman)上测定cpm数。
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2 结果
2.1 sgp130抑制IL-6/sIL-6R复合物对BAF-130的增殖作用 BAF-130细胞膜上无鼠IL-6R和gp130分子，但表达人gp130，IL-6和sIL-6R单独应用时无作用，但合用时，可刺激BAF-130细胞增殖。sgp130部分抑制IL-6/sIL-6R对BAF-130细胞的刺激作用，抗gp130则可几乎全部抑制这种刺激作用(图1)。
2.2 sgp130抑制IL-6对XG4-CNTF的增殖作用 XG4-CNTF对IL-6高度敏感，在IL-6为20 pg/ml时，就可达到最大增殖。sgp130对其同样有部分抑制作用(图2)。
2.3 sgp130对新鲜MM细胞的抑制作用 IL-6是MM细胞的主要生长因子，在体外分离得到的新鲜MM细胞对IL-6的刺激都有增殖反应[6]，sgp130对这种增殖反应也有部分抑制作用(图3)。
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图1 sgp130部分抑制IL-6/sIL-6R对BAF-130的刺激作用
Fig.1 sgp130 inhibited partially the stimulating effect of IL-6/sIL-6R on BAF-130
图2 sgp130部分抑制IL-6对XG4-CNTF的刺激作用
Fig.2 sgp130 exhibited partial inhibitory role in proliferation of XG4-CNTF stimulated by IL-6
图3 sgp130部分抑制IL-6对新鲜MM细胞刺激作用
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Fig.3 Proliferative role of IL-6 in freshly ioslated MM cells was partially inhibited by sgp130
3 讨论
gp130是一个重要分子，几乎表达于体内各种组织细胞上，它参与着体内的一些重要的生理过程。sgp130为gp130分子的胞外部分。已有报道在正常人血浆中存在着可溶性IL-6受体，其含量可达约75 ng/ml[7，8]。sIL-6R与大部分可溶性细胞因子受体不同，一旦与IL-6结合，形成IL-6/sIL-6R复合物后，可以和膜型IL-6R同样的亲和力与膜型gp130分子结合，引起信号传导。但通常情况下，正常人血浆中含有的IL-6量很少，只有在炎症、感染和患有某些肿瘤等情况下，IL-6的含量会上升，IL-6和sIL-6R形成复合物后，就可作用于表达膜型gp130分子的细胞，引起生物学效应。因此，体内必定存在着某种负性调节机制，对这种效应进行负性调节。事实上，本室利用我们自己研制的抗gp130单抗[3]，对正常人血浆中是否存在sgp130进行了研究，结果发现正常人血浆中sgp130的含量可达410 ng/ml(刘俊恒等，待发表资料)。Narazaki等也曾报道，在正常人血浆中存在着自然产生的sgp130[8]，并且在体外实验中，这种自然产生的sgp130对IL-6/sIL-6R复合物介导BAF-130细胞的增殖有抑制作用。我们用基因工程生产纯化的重组sgp130(rsgp130)，在BAF-130细胞上同样有此抑制作用。此外，rsgp130对IL-6有反应的细胞也起抑制作用(图2、图3)。从我们和Narazaki等的结果推测，在体内对IL-6和sIL-6R的生物学效应起着负性调节作用的关键因子之一可能就是sgp130。由于gp130除了作为IL-6的信号传导链外，也是OM、LIF、CNTF、IL-11和心肌营养因子-1(CT-1)的共用信号传导链。用基因工程方法获得的大量sgp130，为以后在体外研究sgp130对这些细胞因子的负性调节作用提供很好的物质基础，具体结果将另文发表。
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可溶性gp130(sgp130)在IL-6/IL-6R系统中的生物学作用研究 本课题受国家自然科学基金(39670689)和国家教委留学回国人员基金(97436)资助
戴燕芳 苏州医学院脑神经研究室，苏州215006
作者简介：顾宗江，男，42岁，博士，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤免疫、免疫调节等研究
4 参考文献
1 Kishimoto T, Akira S, Narazaki M et al. Interleukin-6 family of cytokines and gp130.Blood,1995；86:1234.
2 顾宗江，张学光，Hallet M M et al. 人可溶性gp130(sgp130)分子的克隆与表达.苏州医学院学报，1998；18(8)：781
, http://www.100md.com
3 Gu Z J, Wijdense J,Zhang X G et al. Anti-gp130 transducer monoclonal antibodies specifically inhibiting cilary neurotrophic factor,interleukin-6,interleukin-11,leukemia inhibitory factor or oncostatin M. J Immunol Methods，1996;190:21
4 顾宗江，张学光，Hallet M M et al. 人膜型gp130分子的克隆与表达.苏州医学院学报，1998；18(10)：1001
5 Gu Z J，Zhang X G,Hallet M M et al. A ciliary neurotrophic factor sensitive human myeloma cell line.Exp Hematol,1996;24:1195
, 百拇医药
6 Klein B,Zhang X G,Lu Z Y et al. Interlukin-6 in human multiple myeloma.Blood,1995;85:863
7 Honda M,Yamamoto S,Cheng M et al. Human soluble Il-6 receptor:Its detection and enhanced release by HIV infection.J Immunol,1992;148:2175
8 Narazaki M,Yasukawa K， Saito T et al. Soluble forms of the interleukin-6 signal-transducing receptor component in human serum possessing a potential to inhibit signals through membraneanchored gp130.Blood,1993;82:1120
〔收稿1998-03-10 修回1998-10-16〕, http://www.100md.com