抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡
作者：陈 明 刘晓惠 黄颂敏 屈燧林 刘先蓉 许国章 刘 聪
单位：华西医科大学附属第一医院肾病科，成都610041
关键词：Fas-FasL；抗Fas抗体；系膜细胞
中国免疫学杂志990314 中国图书分类号 R392.12
摘 要 目的：研究抗Fas抗体对人肾小球系膜细胞的致凋亡作用，探讨Fas-FasL在肾脏损伤中的作用。方法：常规方法分离、培养人肾小球系膜细胞(Mcs)，并传代鉴定，用不同浓度的抗Fas抗体(0,2,5,10 μg/ml)刺激4～6代Mcs 16 h后，荧光染色观察Mcs凋亡变化，二苯胺法和DNA凝胶电泳方法定量和定性分析Mcs DNA片段化变化。结果：抗Fas抗体可诱导Mcs凋亡，且致凋亡效应呈依赖性关系。结论：Fas-FasL系统在Mcs凋亡中起着重要作用。
, http://www.100md.com
Anti-Fas antibody induce apoptosis in cultured human glomerular mesangial cells
CHEN Ming，LIU Xiao-Hui，HUANG Song-Min et al.
Department of Nephrology, the First University Hospital West China University of Medical Science,Chengdu 610041
Abstract Objective：To investigate the mechanism inducing apptosis of human glomerular mesangial cells (Mcs) by anti-Fas antibody.Methods: Msc were cultured with anti-Fas antibody (anti-Fas Ab) at different concentrations for 16 hrs. Apoptosis of Mcs was evaluated and qualifed by acriding orange (AO) stained and DNA fragmentation assay. Results: Anti-Fas antibody was found to be able to induce apoptosis in culture human masangial cells and the effect of anti-Fas antibody inducing apoptosis was dose-dependent.Conclusion:Fas and its ligand could play a an role in the injury of human glomerular cell.
, 百拇医药
Key words Fas-FasL Anti-Fas antibody Human mesangial cell
细胞凋亡在肾脏疾病的发生和发展过程中起重要作用，但其机制尚不清楚[1]。研究表明Fas抗原存在于多种细胞表面，一旦被激活可介导细胞凋亡[2]。本文拟用Fas配体(FasL)的协同剂——抗Fas抗体研究Fas-FasL系统对人肾小球系膜细胞(Mcs)的作用，旨为研究肾小球疾病开拓新的理论思路。
1 材料与方法
取新鲜正常人肾组织在无菌条件下去除肾包膜，按谌氏的方法[3]重叠过筛分离并用IV型胶原酶(Sigma Chemical Co) (300 U/ml)消化肾小球。用RPMI1640培养肾小球，直到细胞布满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Sigma Chemical Co)消化细胞后传代培养。取第4～6代细胞经形态学鉴定(相差显微镜、透射电镜、扫描电镜)及抗胸腺细胞抗体，抗Desmin抗体免疫荧光鉴定证实为系膜细胞(Mcs)后。取第4～6代Mcs，以1×104/孔接种于24孔培养板上，待细胞贴壁过夜后，换成无血清RPMI1640液，继续孵育48 h，使细胞同步于G1期，去上清液后分成对照组、实验组A、B、C 4组，分别加入羊血清IgM 2 μg/ml，抗Fas抗体(Santa Craz Co)2\,5和10 μg/ml各1 ml，继续培养16 h。收集Mcs作下列凋亡检测(Ao)。
, 百拇医药
1.1 Mas凋亡的形态学观察 将2 μl吖淀橙染液(100 mg/ml)加50 μl待观察Mcs悬液中充分混匀后，再加入1%多聚甲醛溶液40 μl固定细胞后，于24 h内荧光镜下(以细胞出现核浓缩或核碎裂为细胞凋亡标准)计数每份标本出现凋亡的细胞数〔每份标本至少计数200个细胞，计算凋亡率(%)〕。
1.2 DNA片段化率的测定 用二苯胺测定方法[4]，用Bio-Rad450型比色仪在590 nm波长下比色测定每份标本DNA片段化率(%)。
1.3 DNA凝胶电泳 取实验后Mcs悬液，4℃离心(500 r/min)PBS洗涤后，加入等体积裂解缓冲液(5 mmol/L Tris HCl,pH8.0,100 mmol/L NaCl,100 mmol/L EDTA,1%SDS,200 μg/ml蛋白酶K)充分混匀，37℃孵育12 h后按传统酚-氯仿-异戊醇抽提DNA方法[5]，收集Mcs的DNA，在1.6%凝胶中160 mV电泳2 h后，观察DNA条带分布情况。Mcs细胞凋亡率、Mcs DNA片段化率用
±s(%)表示，用配对t检验及直线相关进行统计学处理。
, 百拇医药
2 结果
形态学观察表明抗Fas抗体能诱导Mcs凋亡，细胞凋亡率随抗Fas抗体剂增加而增高，Mcs的DNA片段化定量分析显示Mcs DNA 片段化率与抗Fas抗体浓度呈直线正相关(Y=10.20+4.6X,r=0.972,P<0.001)(表1)；Mcs DNA电泳分析表明抗Fas抗体可致Mcs的DNA呈不同程度“梯形”改变，而对照组Mcs的DNA断裂不甚明显(图1)。
表1 抗Fas抗体诱导Mcs凋亡DNA片段化率和凋亡细胞计数的定量分析
Tab.1 DNA fragmentation of Mcs apoptosis induced by anti-Fas antibody was quantiative analysis Group
Anto-Fas Ab(μg/ml)
, 百拇医药
DNA fragmentation(%)
Mcs apopotosis(%)
Control
0
4.82±1.56
5.62±2.30
A
2
25.2±4.241)
24.56±1.951)
B
, 百拇医药
5
34.52±5.651)
31.78±2.851)
C
10
54.45±4.821)
51.24±3.251)
Note:1) Compared with control,P<0.01
图1 抗Fas抗体诱导Mcs凋亡的DNA凝胶电泳分析
, 百拇医药
Fig.1 DNA fragmentation of Mcs apoptosis induced by anti-Fas antibody was quality analysis
3 讨论
细胞凋亡是多细胞机体的重要生理、病理过程，主要表现为细胞核的皱缩、染色质浓聚、碎裂，DNA片段化。这种现象贯穿于肾脏正常生理及疾病发生的全过程[1]。文献[2]报告Fas-FasL系统可通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导细胞毒性作用和对免疫应答的调节作用而参与机体的细胞凋亡过程。Wong等报告Fas抗原不仅存在于淋巴细胞、巨噬细胞表面，也存在于肝、肺实质细胞表面[6]。本实验通过用FasL的协同剂——抗Fas抗体与Mcs共同培养16 h，从细胞形态学角度观察到抗Fas抗体导致Mcs核浓缩、核碎裂，与正常对照组比较存在明显差异(P<0.01),从Mcs DNA裂解片段化的定性分析可见受刺激后Mcs的DNA呈“梯形”分布，Mcs的DNA片段化的定量分析也有相同结果。这些结果充分证实抗Fas抗体对Mcs具有致凋亡作用，间接证实了Mcs膜表面存在着Fas抗原、与文献[6]报告的抗Fas抗体可诱导鼠肾小球系膜细胞凋亡的结果相似。Los等认为Fas抗原存在于细胞表面的特定区域，一旦被FasL或类似物激活，可通过白细胞介素转化酶或Ced-3基因产物转移凋亡信息入细胞内，产生类似于原癌基因或化学药物的物质作用于细胞DNA，或者导致类似CTL反应作用于细胞DNA，使其裂解而致细胞凋亡[7]。可见细胞凋亡不仅受细胞本身的Ced-3、Bcl-2基因控制也受Fas-FasL系统的调控。
, 百拇医药
本实验使用不同浓度的抗Fas抗体刺激人肾小球Mcs，发现Mcs凋亡与抗Fas抗体剂量呈正相关, 与Ogaswaza等报告不同剂量的抗Fas抗体诱导大鼠肝细胞凋亡的实验结果相似[8]。
综上所述，抗Fas 抗体可通过激活Mcs膜上的Fas抗原，导致剂量依赖性的Mcs凋亡。Barker等认为诱导过度增生的Mcs凋亡可达到控制系膜增殖性肾炎的目的[9]。由此可见我们可利用Fas-FasL系统的作用原理，合成重组的FasL和/或协同剂，促使增多的系膜细胞凋亡，从而达到预防肾脏病进展的目的。
陈 明 现工作于泸州医学院附属医院肾内科，泸州 646000
作者简介：陈 明，男，31岁，内科学硕士；
黄颂敏，女，副教授，硕士导师，主要研究糖尿病肾病
, 百拇医药
4 参考文献
1 Savill J, Mooney A, Hughes J. Apoptosis and renal scarring. Kidney Int, 1995; 49(suppl, 54): S14
2 Nagata S，Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995; 267:1449
3 谌贻璞，高 进，邢宝才et al. 肾小球系膜细胞培养. 北京医科大学学报，1989；21(6)：335
4 Illera V A, Perandones C E, Stunz L L et al. apoptosis in splenic lymphocytes: Regulation by protein kinase C and IL-4. J Immul, 1993; 141:2965
, 百拇医药
5 姜 泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1994: 66-67
6 Wong G H, Goeddel D V. Fas Antigen and P55 TNF receptor signal apoptosis through distince pathways. J Immunol, 1994;152: 1751
7 Los M, Graen M V, Penning L E et al.Requirement of ICE/CED-3 proteinase for Fas/Apo-1 mediated apoptosis. Nature, 1995; 375: 81
8 Ogasawaza J, Watanabe F R, Adachi M et al. Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice. Nature, 1993; 369:806
9 Baker A J, Mooney A, Hughes J et al. Mesangial cell apoptosis: The major mechanism for resolution of glomerular hypercellularity in experimental mesangial proliferative Nephritis. J Clin Invest, 1994; 94: 2105
〔收稿1997-09-06 修回1998-02-05〕, 百拇医药
单位：华西医科大学附属第一医院肾病科，成都610041
关键词：Fas-FasL；抗Fas抗体；系膜细胞
中国免疫学杂志990314 中国图书分类号 R392.12
摘 要 目的：研究抗Fas抗体对人肾小球系膜细胞的致凋亡作用，探讨Fas-FasL在肾脏损伤中的作用。方法：常规方法分离、培养人肾小球系膜细胞(Mcs)，并传代鉴定，用不同浓度的抗Fas抗体(0,2,5,10 μg/ml)刺激4～6代Mcs 16 h后，荧光染色观察Mcs凋亡变化，二苯胺法和DNA凝胶电泳方法定量和定性分析Mcs DNA片段化变化。结果：抗Fas抗体可诱导Mcs凋亡，且致凋亡效应呈依赖性关系。结论：Fas-FasL系统在Mcs凋亡中起着重要作用。
, http://www.100md.com
Anti-Fas antibody induce apoptosis in cultured human glomerular mesangial cells
CHEN Ming，LIU Xiao-Hui，HUANG Song-Min et al.
Department of Nephrology, the First University Hospital West China University of Medical Science,Chengdu 610041
Abstract Objective：To investigate the mechanism inducing apptosis of human glomerular mesangial cells (Mcs) by anti-Fas antibody.Methods: Msc were cultured with anti-Fas antibody (anti-Fas Ab) at different concentrations for 16 hrs. Apoptosis of Mcs was evaluated and qualifed by acriding orange (AO) stained and DNA fragmentation assay. Results: Anti-Fas antibody was found to be able to induce apoptosis in culture human masangial cells and the effect of anti-Fas antibody inducing apoptosis was dose-dependent.Conclusion:Fas and its ligand could play a an role in the injury of human glomerular cell.
, 百拇医药
Key words Fas-FasL Anti-Fas antibody Human mesangial cell
细胞凋亡在肾脏疾病的发生和发展过程中起重要作用，但其机制尚不清楚[1]。研究表明Fas抗原存在于多种细胞表面，一旦被激活可介导细胞凋亡[2]。本文拟用Fas配体(FasL)的协同剂——抗Fas抗体研究Fas-FasL系统对人肾小球系膜细胞(Mcs)的作用，旨为研究肾小球疾病开拓新的理论思路。
1 材料与方法
取新鲜正常人肾组织在无菌条件下去除肾包膜，按谌氏的方法[3]重叠过筛分离并用IV型胶原酶(Sigma Chemical Co) (300 U/ml)消化肾小球。用RPMI1640培养肾小球，直到细胞布满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Sigma Chemical Co)消化细胞后传代培养。取第4～6代细胞经形态学鉴定(相差显微镜、透射电镜、扫描电镜)及抗胸腺细胞抗体，抗Desmin抗体免疫荧光鉴定证实为系膜细胞(Mcs)后。取第4～6代Mcs，以1×104/孔接种于24孔培养板上，待细胞贴壁过夜后，换成无血清RPMI1640液，继续孵育48 h，使细胞同步于G1期，去上清液后分成对照组、实验组A、B、C 4组，分别加入羊血清IgM 2 μg/ml，抗Fas抗体(Santa Craz Co)2\,5和10 μg/ml各1 ml，继续培养16 h。收集Mcs作下列凋亡检测(Ao)。
, 百拇医药
1.1 Mas凋亡的形态学观察 将2 μl吖淀橙染液(100 mg/ml)加50 μl待观察Mcs悬液中充分混匀后，再加入1%多聚甲醛溶液40 μl固定细胞后，于24 h内荧光镜下(以细胞出现核浓缩或核碎裂为细胞凋亡标准)计数每份标本出现凋亡的细胞数〔每份标本至少计数200个细胞，计算凋亡率(%)〕。
1.2 DNA片段化率的测定 用二苯胺测定方法[4]，用Bio-Rad450型比色仪在590 nm波长下比色测定每份标本DNA片段化率(%)。
1.3 DNA凝胶电泳 取实验后Mcs悬液，4℃离心(500 r/min)PBS洗涤后，加入等体积裂解缓冲液(5 mmol/L Tris HCl,pH8.0,100 mmol/L NaCl,100 mmol/L EDTA,1%SDS,200 μg/ml蛋白酶K)充分混匀，37℃孵育12 h后按传统酚-氯仿-异戊醇抽提DNA方法[5]，收集Mcs的DNA，在1.6%凝胶中160 mV电泳2 h后，观察DNA条带分布情况。Mcs细胞凋亡率、Mcs DNA片段化率用
±s(%)表示，用配对t检验及直线相关进行统计学处理。, 百拇医药
2 结果
形态学观察表明抗Fas抗体能诱导Mcs凋亡，细胞凋亡率随抗Fas抗体剂增加而增高，Mcs的DNA片段化定量分析显示Mcs DNA 片段化率与抗Fas抗体浓度呈直线正相关(Y=10.20+4.6X,r=0.972,P<0.001)(表1)；Mcs DNA电泳分析表明抗Fas抗体可致Mcs的DNA呈不同程度“梯形”改变，而对照组Mcs的DNA断裂不甚明显(图1)。
表1 抗Fas抗体诱导Mcs凋亡DNA片段化率和凋亡细胞计数的定量分析
Tab.1 DNA fragmentation of Mcs apoptosis induced by anti-Fas antibody was quantiative analysis Group
Anto-Fas Ab(μg/ml)
, 百拇医药
DNA fragmentation(%)
Mcs apopotosis(%)
Control
0
4.82±1.56
5.62±2.30
A
2
25.2±4.241)
24.56±1.951)
B
, 百拇医药
5
34.52±5.651)
31.78±2.851)
C
10
54.45±4.821)
51.24±3.251)
Note:1) Compared with control,P<0.01
图1 抗Fas抗体诱导Mcs凋亡的DNA凝胶电泳分析
, 百拇医药
Fig.1 DNA fragmentation of Mcs apoptosis induced by anti-Fas antibody was quality analysis
3 讨论
细胞凋亡是多细胞机体的重要生理、病理过程，主要表现为细胞核的皱缩、染色质浓聚、碎裂，DNA片段化。这种现象贯穿于肾脏正常生理及疾病发生的全过程[1]。文献[2]报告Fas-FasL系统可通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导细胞毒性作用和对免疫应答的调节作用而参与机体的细胞凋亡过程。Wong等报告Fas抗原不仅存在于淋巴细胞、巨噬细胞表面，也存在于肝、肺实质细胞表面[6]。本实验通过用FasL的协同剂——抗Fas抗体与Mcs共同培养16 h，从细胞形态学角度观察到抗Fas抗体导致Mcs核浓缩、核碎裂，与正常对照组比较存在明显差异(P<0.01),从Mcs DNA裂解片段化的定性分析可见受刺激后Mcs的DNA呈“梯形”分布，Mcs的DNA片段化的定量分析也有相同结果。这些结果充分证实抗Fas抗体对Mcs具有致凋亡作用，间接证实了Mcs膜表面存在着Fas抗原、与文献[6]报告的抗Fas抗体可诱导鼠肾小球系膜细胞凋亡的结果相似。Los等认为Fas抗原存在于细胞表面的特定区域，一旦被FasL或类似物激活，可通过白细胞介素转化酶或Ced-3基因产物转移凋亡信息入细胞内，产生类似于原癌基因或化学药物的物质作用于细胞DNA，或者导致类似CTL反应作用于细胞DNA，使其裂解而致细胞凋亡[7]。可见细胞凋亡不仅受细胞本身的Ced-3、Bcl-2基因控制也受Fas-FasL系统的调控。
, 百拇医药
本实验使用不同浓度的抗Fas抗体刺激人肾小球Mcs，发现Mcs凋亡与抗Fas抗体剂量呈正相关, 与Ogaswaza等报告不同剂量的抗Fas抗体诱导大鼠肝细胞凋亡的实验结果相似[8]。
综上所述，抗Fas 抗体可通过激活Mcs膜上的Fas抗原，导致剂量依赖性的Mcs凋亡。Barker等认为诱导过度增生的Mcs凋亡可达到控制系膜增殖性肾炎的目的[9]。由此可见我们可利用Fas-FasL系统的作用原理，合成重组的FasL和/或协同剂，促使增多的系膜细胞凋亡，从而达到预防肾脏病进展的目的。
陈 明 现工作于泸州医学院附属医院肾内科，泸州 646000
作者简介：陈 明，男，31岁，内科学硕士；
黄颂敏，女，副教授，硕士导师，主要研究糖尿病肾病
, 百拇医药
4 参考文献
1 Savill J, Mooney A, Hughes J. Apoptosis and renal scarring. Kidney Int, 1995; 49(suppl, 54): S14
2 Nagata S，Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995; 267:1449
3 谌贻璞，高 进，邢宝才et al. 肾小球系膜细胞培养. 北京医科大学学报，1989；21(6)：335
4 Illera V A, Perandones C E, Stunz L L et al. apoptosis in splenic lymphocytes: Regulation by protein kinase C and IL-4. J Immul, 1993; 141:2965
, 百拇医药
5 姜 泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1994: 66-67
6 Wong G H, Goeddel D V. Fas Antigen and P55 TNF receptor signal apoptosis through distince pathways. J Immunol, 1994;152: 1751
7 Los M, Graen M V, Penning L E et al.Requirement of ICE/CED-3 proteinase for Fas/Apo-1 mediated apoptosis. Nature, 1995; 375: 81
8 Ogasawaza J, Watanabe F R, Adachi M et al. Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice. Nature, 1993; 369:806
9 Baker A J, Mooney A, Hughes J et al. Mesangial cell apoptosis: The major mechanism for resolution of glomerular hypercellularity in experimental mesangial proliferative Nephritis. J Clin Invest, 1994; 94: 2105
〔收稿1997-09-06 修回1998-02-05〕, 百拇医药