人白细胞分化抗原CD59基因克隆及序列分析
作者：白 云 姜 曼 朱锡华
单位：第三军医大学免疫学教研室，重庆400038
关键词：CD59；RT-PCR；基因克隆；序列分析
中国免疫学杂志990301 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：为了获得人CD59 cDNA完整序列，以建立表达人CD59分子的小鼠T细胞模型，更深入地探讨补体MAC及CD59分子与T细胞活化的关系。方法：通过设计和合成引物、提取细胞总RNA进行逆转录反应，经PCR扩增目的片段，并将其克隆于pUC18及pUC19质粒上，测定其DNA序列。结果：从Jurkat细胞总RNA中扩增得到396 bp片段，序列测定证实该片段为包括25aa信号肽在内的全部CD59编码序列。结论：表明CD59 cDNA已成功地得到克隆。
, http://www.100md.com Molecular cloning and sequencing of human CD59
BAI Yun,JIANG Man,ZHU Xi-Hua.
Department of Immunology,The 3rd Military Medical University,Chongqing 400038
Abstract Objective：CD59,with multiple functions,is a widely expressed cell surface glycosyl-phosphatidyl inositol(GPI) anchored glycoprotein.It acts as an inhibitor of the assembly of the membrane attack complex of autologous complement,binds to CD2,and also transduces activation signals in T cells.The purpose of this study is to obtain the cDNA sequence encoding humam CD59.Methods：The primers are designed based on the known CD59 cDNA sequence.Total RNA was isolated from cultured Jurkat cells,and then RT-PCR was performed.The fragment was cloned into pUC18 and pUC19 plasmids,and further sequenced by sanger' s-dideoxy-mediated chain termination.Results:A 396 bp DNA fragment was amplified by RT-PCR method from Jurkat cells.This cDNA fragment includes 384 bp open reading fragment and it's sequence is identical to the published sequence encoding human CD59.Conclusion:CD59 cDNA has been cloned successfully.
, http://www.100md.com
Key words CD59 RT-PCR Gene clone Sequencing analysis
CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的GPI锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能[1]。首先，它作为补体系统终末阶段的调节蛋白，以同源限制的方式抑制攻膜复合物C5b-9的生成，保护自身正常组织细胞免受补体损伤[1，2]，其异常和缺损是导致夜间阵发性血红蛋白尿(PNH)的直接原因[3，4]。其次，GPI锚固的CD59是一个重要的信号转导分子，参与了单核细胞、粒细胞、血小板、T细胞的活化信号转导过程，尤其是在T细胞活化中的辅助作用倍受人们的关注[5-7]。此外，越来越多的研究表明，CD59在微生物及肿瘤的免疫逃避、异种器官移植超急排斥反应、自身免疫性疾病及生殖免疫病理方面都具有重要的意义，并且在PNH的治疗、超急排斥反应的控制及多种免疫性疾病的治疗方面显示了良好的应用前景[8]。
, http://www.100md.com
为了深入研究CD59功能，探讨其生理及病理意义，本文利用多聚酶链反应，扩增得到了CD59分子的全序列基因片段，并将其克隆于pUC19\,pUC18质粒上，进行DNA序列分析，为进一步表达CD59分子并进行其它功能的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 M-MLV RTase(200 U/μl)，oligo(dT)12-18(0.5 μg/μl)，RNasin(40 U/μl)
,T4 Ligase(1 U/μl)购自GIBCO公司，T7测序kit购自Pharmacia公司，32P-dATP购自北京亚辉公司。限制性内切酶购自华美公司。
1.2 引物设计和合成 设计合成了一对分别位于编码CD59分子cDNA序列的上下两侧引物，中间包含了包括25aa信号肽在内的完整的CD59编码序列384 bp。上游引物5′端加EcoR I酶切位点，下游引物3′端加BamH I酶切位点。PCR引物由本校生化教研室合成。Primer 1:5′-GAATTCATGG
, 百拇医药
GAATCCAA-GGAGG-3′；Primer 2:5′-GGATCCTTAGGGATGAAGGC-TCCAG-3′。
1.3 细胞总RNA的提取 采用CD59高表达的Jurkat细胞系，参照异硫氰酸胍一步法提取总RNA，提取物于1.5%的琼脂糖凝胶上行甲醛变性电泳。
1.4 逆转录反应和PCR扩增 取细胞总RNA 10 μg，分别加oligo(dT)12-18 1 μl或Primer 2 1 μl,5×缓冲液4 μl,0.1 mol/L DTT 2 μl,RNasin 0.25 μl，dNTPs 4 μl，逆转录酶MMLV RTase(200 U/μl)0.2 μl,补充ddH20至20 μl，混匀后37℃反应60 min。分别取逆转录产物5 μl,加入10×Taq酶缓冲液5 μl，dNTPs 2 μl,Primer 1和Primer 2各0.5 μl，MgCl2 2 μl，ddH20 35 μl,95℃变性5 min后加Taq酶0.5 μl，PCR反应程序为93℃变性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸90 s，周期为30个循环，最后72℃延伸10 min。取8 μl PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上行电泳观察结果。扩增片段以pst I酶切进行初步鉴定。
, 百拇医药
1.5 扩增片段的基因克隆和序列分析 将PCR产物、pUC19和pUC18质粒分别用EcoR I和BamH I酶切，琼脂糖凝胶电泳,回收粘末端的DNA片段，用T4连接酶连接。转化入E.coli JM109后经氨苄青霉素及α-互补筛选，用EcoR I和BamH I酶切鉴定，得到含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列分析按Pharmacia公司的T7 Sequence kit说明书进行操作。
2 结果
2.1 Jurkat细胞总RNA的提取 我们选择Jurkat细胞为原材料抽提总RNA，电泳结果显示不同批次抽提的RNA 28、18、5 S三带明显，且28 S>18 S(图1)。紫外测定表明A260/A280>1.8，说明抽提的总RNA完整且纯度符合反转录要求。
图1 Jurkat细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳图
, 百拇医药
Fig.1 Total RNA of Jurkat cells
2.2 cDNA第一链的合成及PCR扩增 本实验以合成的CD59下游引物Primer 2为引物合成cDNA第一链，再进行PCR扩增，结果获得396 bp的单一片段。已知CD59 cDNA片段内含有一个pst I酶切位点，用pst I酶切PCR扩增片段后得到70 bp和326 bp片段，初步证明扩增得到的396 bp片段是CD59的cDNA(图2)。
图2 PCR产物酶切鉴定图谱
Fig.2 Digestion map of PCR products
Note:lane 1.DNA markers;lane 2.PCR products digested with pst I;lane 3.PCR product
, 百拇医药
图3 克隆质粒酶切鉴定图谱
Fig.3 Digestion map of pUC18-CD59
Note:lane 1.λDNA/HindIII markers;lane 2.pUC18-CD59 digested with EcoR I+ BamH I;lane 3.pUC18-CD59 digested with BamH I
2.3 扩增产物的克隆 扩增的CD59 cDNA分别与质粒pUC18和pUC19连接，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，用EcoR I、BamH I酶切鉴定，阳性重组子可切出396 bp的片段(图3)，说明cDNA已克隆于载体中，命名为pUC18-CD59和pUC19-CD59。
2.4 克隆片段的DNA序列分析 pUC18和pUC19是可以直接测序的载体，因此我们以重组质粒为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列(图4)，经计算机分析，与已知的包括25aa信号肽序列在内的人CD59 cDNA序列完全一致。
, 百拇医药
G A A T T C A T G G G A A T C C A A G G A G G G T C T G T C C T G T T C G G G C T G C T G C T C G T C C T G G C T G T C T T C T G C C A T T C A G G T C A T A G C C T G C A G T G C T A C A A C T G T C C T A A C C C A A C T G C T G A C T G C A A A A C A G C C G T C A A T T G T T C A T C T G A T T T T G A T G C G T G T C T C A T T A C C A A A G C T G G G T T A C A A G T G T A T A A C A A G T G T T G G A A G T T T G A G C A T T G C A A T T T C A A C G A C G T C A C A A C C C G C T T G A G G G A A A A T G A G C T A A C G T A C T A C T G C T G C A A G A A G G A C C T G T G T A A C T T T A A C G A A C A G C T T G A A A A T G G T G G G A C A T C C T T A T C A G A G A A A A C A G T T C T T C T G C T G G T G A C T C C A T T T C T G G C A G C A G C C T G G A G C C T T C A T C C C T A A G G A T C C
, 百拇医药
图4 重组质粒的克隆片段测读片结果
Fig.4 Sequence of recombinant plasmid's clone fragment
3 讨论
CD59广泛分布于人体各组织细胞表面，但在不同的组织细胞的表达有所差异。本室用anti-CD59 mAb经FACS鉴定结果表明，CD59高表达于Jurkat\,Molter-4细胞系，中度表达于K562细胞系，而在Raji细胞和U937细胞中不表达[9]，因此我们选择Jurkat细胞为原材料获取CD59的cDNA。用RT-PCR克隆获取目的cDNA是目前最常用的克隆方法，分为一步法和二步法，本实验采用二步法进行，首先以oligo (dT)为引物，反转录合成cDNA第一链为模板进行PCR，扩增所得的产物较少，且有非特异性产物存在，结果不理想。后改用合成的CD59下游引物Primer 2为引物合成cDNA第一链，再进行PCR扩增，并将退火温度提高到60℃，结果获得396 bp的单一片段。扩增的cDNA片段分别与质粒pUC18和pUC19连接后进行测序，DNA序列分析表明我们已经克隆了包括25aa信号肽序列在内的人CD59 cDNA 全部编码序列，为进一步进行真核细胞表达、建立表达人CD59分子的小鼠T细胞模型、更深入地探讨补体MAC及CD59分子与T细胞活化的关系奠定了基础。
, 百拇医药
人白细胞分化抗原CD59基因克隆及序列分析 国家自然科学基金资助项目(No.39630290)
作者简介：白 云，女，32岁，博士，副教授，硕士生导师，主要从事补体分子生物学研究；
朱锡华，男，教授，博士生导师，《中国免疫学杂志》副主编，从事分子免疫学研究
4 参考文献
1 白 云.CD59抗原的研究进展.见：朱锡华主编.免疫学进展(第一集).重庆：四川科技出版社，1995：86
2 Davies A,Simmos D L,Hale G et al.CD59,an Ly6-like protein expressed in human lymphoid cells,regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.J Exp Med,1989;170:637
, 百拇医药
3 Yomtovian R,Prince G M,Medof M E.The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobulinuria.Transfusion,1993;33:852
4 Kinoshita T,Inoue N,Takeda J.Defective glycosylphosphatidyl-inositol anchor synthesis and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.Adv Immunol,1995;60:57
5 Korty P E,Brando C,Shevach E M.CD59 functions as a signal-transducing molecule for human T cell activation.J Immunol,1991;146:4092
, http://www.100md.com
6 Deckert M,Ticchioni M,Mari B et al.The glycosylphos-phatidylinositol-anchored CD59 protein stimulates both T cell receptor ZAP-70 dependent and independent signaling pathways in T cells.Eur J Immunol,1995;25:1815
7 Morgan B P,Davies E V,Hallett M B et al.Cross-linking of CD59 and of other glycosyl-phosphatidylinositd-anchored molecules on neutrophils tiggers cell activation via tyrosine kinase.Eur J Immunol,1993;23:2841
8 Asghar S S.Membrane regulators of complement activation and their aberrant expression in disease.Lab Invest,1995;72:254
9 白 云，朱锡华.抗CD59单克隆抗体的制备及鉴定.免疫学杂志，1994；10(5)：218
〔收稿1997-06-02 修回1997-10-13〕, http://www.100md.com
单位：第三军医大学免疫学教研室，重庆400038
关键词：CD59；RT-PCR；基因克隆；序列分析
中国免疫学杂志990301 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：为了获得人CD59 cDNA完整序列，以建立表达人CD59分子的小鼠T细胞模型，更深入地探讨补体MAC及CD59分子与T细胞活化的关系。方法：通过设计和合成引物、提取细胞总RNA进行逆转录反应，经PCR扩增目的片段，并将其克隆于pUC18及pUC19质粒上，测定其DNA序列。结果：从Jurkat细胞总RNA中扩增得到396 bp片段，序列测定证实该片段为包括25aa信号肽在内的全部CD59编码序列。结论：表明CD59 cDNA已成功地得到克隆。
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BAI Yun,JIANG Man,ZHU Xi-Hua.
Department of Immunology,The 3rd Military Medical University,Chongqing 400038
Abstract Objective：CD59,with multiple functions,is a widely expressed cell surface glycosyl-phosphatidyl inositol(GPI) anchored glycoprotein.It acts as an inhibitor of the assembly of the membrane attack complex of autologous complement,binds to CD2,and also transduces activation signals in T cells.The purpose of this study is to obtain the cDNA sequence encoding humam CD59.Methods：The primers are designed based on the known CD59 cDNA sequence.Total RNA was isolated from cultured Jurkat cells,and then RT-PCR was performed.The fragment was cloned into pUC18 and pUC19 plasmids,and further sequenced by sanger' s-dideoxy-mediated chain termination.Results:A 396 bp DNA fragment was amplified by RT-PCR method from Jurkat cells.This cDNA fragment includes 384 bp open reading fragment and it's sequence is identical to the published sequence encoding human CD59.Conclusion:CD59 cDNA has been cloned successfully.
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Key words CD59 RT-PCR Gene clone Sequencing analysis
CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的GPI锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能[1]。首先，它作为补体系统终末阶段的调节蛋白，以同源限制的方式抑制攻膜复合物C5b-9的生成，保护自身正常组织细胞免受补体损伤[1，2]，其异常和缺损是导致夜间阵发性血红蛋白尿(PNH)的直接原因[3，4]。其次，GPI锚固的CD59是一个重要的信号转导分子，参与了单核细胞、粒细胞、血小板、T细胞的活化信号转导过程，尤其是在T细胞活化中的辅助作用倍受人们的关注[5-7]。此外，越来越多的研究表明，CD59在微生物及肿瘤的免疫逃避、异种器官移植超急排斥反应、自身免疫性疾病及生殖免疫病理方面都具有重要的意义，并且在PNH的治疗、超急排斥反应的控制及多种免疫性疾病的治疗方面显示了良好的应用前景[8]。
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为了深入研究CD59功能，探讨其生理及病理意义，本文利用多聚酶链反应，扩增得到了CD59分子的全序列基因片段，并将其克隆于pUC19\,pUC18质粒上，进行DNA序列分析，为进一步表达CD59分子并进行其它功能的研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 M-MLV RTase(200 U/μl)，oligo(dT)12-18(0.5 μg/μl)，RNasin(40 U/μl)
,T4 Ligase(1 U/μl)购自GIBCO公司，T7测序kit购自Pharmacia公司，32P-dATP购自北京亚辉公司。限制性内切酶购自华美公司。
1.2 引物设计和合成 设计合成了一对分别位于编码CD59分子cDNA序列的上下两侧引物，中间包含了包括25aa信号肽在内的完整的CD59编码序列384 bp。上游引物5′端加EcoR I酶切位点，下游引物3′端加BamH I酶切位点。PCR引物由本校生化教研室合成。Primer 1:5′-GAATTCATGG
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GAATCCAA-GGAGG-3′；Primer 2:5′-GGATCCTTAGGGATGAAGGC-TCCAG-3′。
1.3 细胞总RNA的提取 采用CD59高表达的Jurkat细胞系，参照异硫氰酸胍一步法提取总RNA，提取物于1.5%的琼脂糖凝胶上行甲醛变性电泳。
1.4 逆转录反应和PCR扩增 取细胞总RNA 10 μg，分别加oligo(dT)12-18 1 μl或Primer 2 1 μl,5×缓冲液4 μl,0.1 mol/L DTT 2 μl,RNasin 0.25 μl，dNTPs 4 μl，逆转录酶MMLV RTase(200 U/μl)0.2 μl,补充ddH20至20 μl，混匀后37℃反应60 min。分别取逆转录产物5 μl,加入10×Taq酶缓冲液5 μl，dNTPs 2 μl,Primer 1和Primer 2各0.5 μl，MgCl2 2 μl，ddH20 35 μl,95℃变性5 min后加Taq酶0.5 μl，PCR反应程序为93℃变性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸90 s，周期为30个循环，最后72℃延伸10 min。取8 μl PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上行电泳观察结果。扩增片段以pst I酶切进行初步鉴定。
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1.5 扩增片段的基因克隆和序列分析 将PCR产物、pUC19和pUC18质粒分别用EcoR I和BamH I酶切，琼脂糖凝胶电泳,回收粘末端的DNA片段，用T4连接酶连接。转化入E.coli JM109后经氨苄青霉素及α-互补筛选，用EcoR I和BamH I酶切鉴定，得到含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列分析按Pharmacia公司的T7 Sequence kit说明书进行操作。
2 结果
2.1 Jurkat细胞总RNA的提取 我们选择Jurkat细胞为原材料抽提总RNA，电泳结果显示不同批次抽提的RNA 28、18、5 S三带明显，且28 S>18 S(图1)。紫外测定表明A260/A280>1.8，说明抽提的总RNA完整且纯度符合反转录要求。
图1 Jurkat细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳图
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Fig.1 Total RNA of Jurkat cells
2.2 cDNA第一链的合成及PCR扩增 本实验以合成的CD59下游引物Primer 2为引物合成cDNA第一链，再进行PCR扩增，结果获得396 bp的单一片段。已知CD59 cDNA片段内含有一个pst I酶切位点，用pst I酶切PCR扩增片段后得到70 bp和326 bp片段，初步证明扩增得到的396 bp片段是CD59的cDNA(图2)。
图2 PCR产物酶切鉴定图谱
Fig.2 Digestion map of PCR products
Note:lane 1.DNA markers;lane 2.PCR products digested with pst I;lane 3.PCR product
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图3 克隆质粒酶切鉴定图谱
Fig.3 Digestion map of pUC18-CD59
Note:lane 1.λDNA/HindIII markers;lane 2.pUC18-CD59 digested with EcoR I+ BamH I;lane 3.pUC18-CD59 digested with BamH I
2.3 扩增产物的克隆 扩增的CD59 cDNA分别与质粒pUC18和pUC19连接，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，用EcoR I、BamH I酶切鉴定，阳性重组子可切出396 bp的片段(图3)，说明cDNA已克隆于载体中，命名为pUC18-CD59和pUC19-CD59。
2.4 克隆片段的DNA序列分析 pUC18和pUC19是可以直接测序的载体，因此我们以重组质粒为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列(图4)，经计算机分析，与已知的包括25aa信号肽序列在内的人CD59 cDNA序列完全一致。
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图4 重组质粒的克隆片段测读片结果
Fig.4 Sequence of recombinant plasmid's clone fragment
3 讨论
CD59广泛分布于人体各组织细胞表面，但在不同的组织细胞的表达有所差异。本室用anti-CD59 mAb经FACS鉴定结果表明，CD59高表达于Jurkat\,Molter-4细胞系，中度表达于K562细胞系，而在Raji细胞和U937细胞中不表达[9]，因此我们选择Jurkat细胞为原材料获取CD59的cDNA。用RT-PCR克隆获取目的cDNA是目前最常用的克隆方法，分为一步法和二步法，本实验采用二步法进行，首先以oligo (dT)为引物，反转录合成cDNA第一链为模板进行PCR，扩增所得的产物较少，且有非特异性产物存在，结果不理想。后改用合成的CD59下游引物Primer 2为引物合成cDNA第一链，再进行PCR扩增，并将退火温度提高到60℃，结果获得396 bp的单一片段。扩增的cDNA片段分别与质粒pUC18和pUC19连接后进行测序，DNA序列分析表明我们已经克隆了包括25aa信号肽序列在内的人CD59 cDNA 全部编码序列，为进一步进行真核细胞表达、建立表达人CD59分子的小鼠T细胞模型、更深入地探讨补体MAC及CD59分子与T细胞活化的关系奠定了基础。
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人白细胞分化抗原CD59基因克隆及序列分析 国家自然科学基金资助项目(No.39630290)
作者简介：白 云，女，32岁，博士，副教授，硕士生导师，主要从事补体分子生物学研究；
朱锡华，男，教授，博士生导师，《中国免疫学杂志》副主编，从事分子免疫学研究
4 参考文献
1 白 云.CD59抗原的研究进展.见：朱锡华主编.免疫学进展(第一集).重庆：四川科技出版社，1995：86
2 Davies A,Simmos D L,Hale G et al.CD59,an Ly6-like protein expressed in human lymphoid cells,regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells.J Exp Med,1989;170:637
, 百拇医药
3 Yomtovian R,Prince G M,Medof M E.The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobulinuria.Transfusion,1993;33:852
4 Kinoshita T,Inoue N,Takeda J.Defective glycosylphosphatidyl-inositol anchor synthesis and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.Adv Immunol,1995;60:57
5 Korty P E,Brando C,Shevach E M.CD59 functions as a signal-transducing molecule for human T cell activation.J Immunol,1991;146:4092
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6 Deckert M,Ticchioni M,Mari B et al.The glycosylphos-phatidylinositol-anchored CD59 protein stimulates both T cell receptor ZAP-70 dependent and independent signaling pathways in T cells.Eur J Immunol,1995;25:1815
7 Morgan B P,Davies E V,Hallett M B et al.Cross-linking of CD59 and of other glycosyl-phosphatidylinositd-anchored molecules on neutrophils tiggers cell activation via tyrosine kinase.Eur J Immunol,1993;23:2841
8 Asghar S S.Membrane regulators of complement activation and their aberrant expression in disease.Lab Invest,1995;72:254
9 白 云，朱锡华.抗CD59单克隆抗体的制备及鉴定.免疫学杂志，1994；10(5)：218
〔收稿1997-06-02 修回1997-10-13〕, http://www.100md.com