pIcln肽段抗体对猪肾脏细胞pIcln分布的检测
作者：马颖哲 杨翰仪 孙步彤
单位：马颖哲 杨翰仪 (白求恩医科大学基础生化科，长春130021)；孙步彤 (白求恩医科大学三院血液科，长春130031)
关键词：
中国免疫学杂志/990607 中国图书分类号 R392.12
pIcln是与Clˉ电流密切相关、对核苷酸(n)敏感的蛋白质,它在调节细胞体积方面发挥重要的作用。我国尚未开展其研究。我们在制备pIcln肽段抗体的基础上检测了猪肾脏细胞pIcln的分布。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 肽合成试剂、合成仪等(PE公司),标准pIcln (由Dr.J.Eggermont赠送),羊抗兔过氧化物酶标记IgG(Bio Rad),新西兰白兔(秋田大学实验动物部),猪肾脏(收集于当地屠宰场)。
, http://www.100md.com
1.2 Western blot对抗pIcln肽段抗体的鉴定 用合成的pIcln碳端18肽与PVP(聚乙烯吡咯烷酮)及佐剂混合乳化后,对兔进行免疫注射。对免疫血清进行抗体检测：分A、B、C 3组,电泳加样时每组均加标准pIcln和猪肾脏匀浆液样品；第一步免疫反应A、B、C组分别加入免疫血清、未免疫血清和预先与猪肾脏匀浆液混合的免疫血清；以后所加试剂3组均相同。
1.3 猪肾脏细胞pIcln在可溶性和不溶性成分中分布的检测 取猪肾脏10 g,剪净脂肪等组织并充分清洗后,超声匀浆,4℃、100 000 r/min 离心1.5 h,对上清和沉淀部分分别进行蛋白定量,按15 μg蛋白加样量、用上述鉴定的pIcln肽段抗体等进行Western blot分析。
2 结果
2.1 抗pIcln肽段抗体的特异性 Western blot结果显示：待测组A的两样品均在约40 kD位置出现单一的免疫反应带；而阴性对照组B和免疫耗竭组C均呈阴性结果(图略)。
, 百拇医药
2.2 猪肾脏细胞pIcln在可溶性和不溶性成分中的分布 可溶性成分的蛋白样品呈现很强的免疫反应带；不溶性成分的样品呈现窄的、弱的免疫反应带(图略)。说明肾脏细胞pIcln主要分布在可溶性成分中。
3 讨论
免疫血清特异地与标准pIcln蛋白反应,且与猪肾脏蛋白反应也呈现单一的约40 kD的免疫反应带,结合阴性对照和免疫耗竭实验的结果,证明我们得到了高特异性的抗pIcln肽段抗体,为pIcln的研究打下基础。
细胞的体积调节作用是细胞的重要功能[1]。1992年pIcln作为调节细胞体积的Cl-通道蛋白被发现[2]；2年后的一些实验,否定了它是通道蛋白而提出是 Cl-通道调节蛋白[3]。本实验pIcln在猪肾脏细胞主要分布在可溶性成分中,正常的分离可溶性成分应为细胞质成分(本实验用酶学检测所确认),pIcln在胞质中的大量分布说明了很大可能它是作为胞质调节蛋白来发挥调节细胞体积的作用。在调节机制上也许符合模型推测[4],当细胞体积增大时pIcln从胞质插入细胞膜组成离子通道,促进Cl-等转出细胞,来调节细胞的体积,但这些还有待于进一步证实。
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作者简介：马颖哲,女,35岁,博士生,讲师,主要从事抗体及蛋白质的研究；
指导教师,杨翰仪,女, 64 岁,博士生导师,教授,主要从事抗体及蛋白质的研究
4 参考文献
1 Ballanyi K, Grafe P. Cell volume regulation in the nervous system. Renal Physiol Biochem,1988;3-5:142
2 Paulmichl M, Li Y, Wickman K et al. New mammalian chloride channel identified by expression cloning. Nature, 1992;365:238
3 Krapivinsky G B, Ackerman M J, Gordon E A et al. Molecular charcterization of a swelling-induced chloride conductance regulatory protein, pIcln. Cell,1994;76:439
4 Strage K, Emma F, Jackson P S. Cellular and molecular physiology of volume-sensitive anion channels. Am J Physiol,1996;270(Cell Physiol.39):C711
〔收稿1998-11-23 修回1999-02-25〕, 百拇医药
单位：马颖哲 杨翰仪 (白求恩医科大学基础生化科，长春130021)；孙步彤 (白求恩医科大学三院血液科，长春130031)
关键词：
中国免疫学杂志/990607 中国图书分类号 R392.12
pIcln是与Clˉ电流密切相关、对核苷酸(n)敏感的蛋白质,它在调节细胞体积方面发挥重要的作用。我国尚未开展其研究。我们在制备pIcln肽段抗体的基础上检测了猪肾脏细胞pIcln的分布。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 肽合成试剂、合成仪等(PE公司),标准pIcln (由Dr.J.Eggermont赠送),羊抗兔过氧化物酶标记IgG(Bio Rad),新西兰白兔(秋田大学实验动物部),猪肾脏(收集于当地屠宰场)。
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1.2 Western blot对抗pIcln肽段抗体的鉴定 用合成的pIcln碳端18肽与PVP(聚乙烯吡咯烷酮)及佐剂混合乳化后,对兔进行免疫注射。对免疫血清进行抗体检测：分A、B、C 3组,电泳加样时每组均加标准pIcln和猪肾脏匀浆液样品；第一步免疫反应A、B、C组分别加入免疫血清、未免疫血清和预先与猪肾脏匀浆液混合的免疫血清；以后所加试剂3组均相同。
1.3 猪肾脏细胞pIcln在可溶性和不溶性成分中分布的检测 取猪肾脏10 g,剪净脂肪等组织并充分清洗后,超声匀浆,4℃、100 000 r/min 离心1.5 h,对上清和沉淀部分分别进行蛋白定量,按15 μg蛋白加样量、用上述鉴定的pIcln肽段抗体等进行Western blot分析。
2 结果
2.1 抗pIcln肽段抗体的特异性 Western blot结果显示：待测组A的两样品均在约40 kD位置出现单一的免疫反应带；而阴性对照组B和免疫耗竭组C均呈阴性结果(图略)。
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2.2 猪肾脏细胞pIcln在可溶性和不溶性成分中的分布 可溶性成分的蛋白样品呈现很强的免疫反应带；不溶性成分的样品呈现窄的、弱的免疫反应带(图略)。说明肾脏细胞pIcln主要分布在可溶性成分中。
3 讨论
免疫血清特异地与标准pIcln蛋白反应,且与猪肾脏蛋白反应也呈现单一的约40 kD的免疫反应带,结合阴性对照和免疫耗竭实验的结果,证明我们得到了高特异性的抗pIcln肽段抗体,为pIcln的研究打下基础。
细胞的体积调节作用是细胞的重要功能[1]。1992年pIcln作为调节细胞体积的Cl-通道蛋白被发现[2]；2年后的一些实验,否定了它是通道蛋白而提出是 Cl-通道调节蛋白[3]。本实验pIcln在猪肾脏细胞主要分布在可溶性成分中,正常的分离可溶性成分应为细胞质成分(本实验用酶学检测所确认),pIcln在胞质中的大量分布说明了很大可能它是作为胞质调节蛋白来发挥调节细胞体积的作用。在调节机制上也许符合模型推测[4],当细胞体积增大时pIcln从胞质插入细胞膜组成离子通道,促进Cl-等转出细胞,来调节细胞的体积,但这些还有待于进一步证实。
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作者简介：马颖哲,女,35岁,博士生,讲师,主要从事抗体及蛋白质的研究；
指导教师,杨翰仪,女, 64 岁,博士生导师,教授,主要从事抗体及蛋白质的研究
4 参考文献
1 Ballanyi K, Grafe P. Cell volume regulation in the nervous system. Renal Physiol Biochem,1988;3-5:142
2 Paulmichl M, Li Y, Wickman K et al. New mammalian chloride channel identified by expression cloning. Nature, 1992;365:238
3 Krapivinsky G B, Ackerman M J, Gordon E A et al. Molecular charcterization of a swelling-induced chloride conductance regulatory protein, pIcln. Cell,1994;76:439
4 Strage K, Emma F, Jackson P S. Cellular and molecular physiology of volume-sensitive anion channels. Am J Physiol,1996;270(Cell Physiol.39):C711
〔收稿1998-11-23 修回1999-02-25〕, 百拇医药