类风湿关节炎患者外周血及滑膜液Ⅹ型胶原反应性B细胞检测及其特异性分析①
作者：王江滨 王育珊 张晓楠 王淑蕙 杨贵贞
单位：王江滨 白求恩医科大学第三临床学院，长春130031；王育珊 白求恩医科大学第二临床学院，长春130041；张晓楠 王淑蕙 白求恩医科大学第一临床学院，长春130021；杨贵贞 白求恩医科大学基础医学院免疫室，长春130021
关键词：类风湿关节炎；Ⅹ型胶原；酶联斑点技术
中国免疫学杂志990715 中国图书分类号 R593.22
摘 要 目的：探讨类风湿关节炎(RA)患者体内是否存在抗Ⅹ型胶原B细胞反应。方法：以EL-4 OUr BUr/rIL-2/PMA作为刺激系统，通过酶联斑点技术检测抗Ⅹ型胶原免疫球蛋白分泌B细胞(anti-HCⅩ ISC)频率。结果：28例RA患者滑膜中11例出现 anti-HCⅩ ISC，而对照组骨性关节炎(OA)患者滑膜液中则未检测到anti-HCⅩ ISC。RA患者外周血及滑膜液CD19+及CD20+细胞百分率于刺激前后无明显变化，但CD5+B细胞百分率却明显增加, 外周血刺激前后分别为17.0±6.0,27.0±9.0, 滑膜液分别为8.0±3.2，16.0±6.0。结论：(1) RA患者体内存在抗Ⅹ型胶原B细胞反应,(2) CD4+ EL-4 OUr BUr/rIL-2/PMA是激活CD5+自身抗体产生B细胞的有效方法。
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Detection and specificity analysis of B cell response to human collagen type Ⅹ in peripheral blood and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis
WANG Jiang-Bin, WANG Yu-Shan, ZHANG Xiao-Nan et al.
Department of Internal Medicine, The Third Hospital, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031
Abstract Objective:To detect the frequencies of B cell reaction to human collagen type Ⅹ (HCⅩ) in synovial fluid and peripheral blood in patients with rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA). Methods:The enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay was used for enumerating anti-HCⅩ immunoglobulin secreting cells (anti-HCⅩ ISC) after highly efficient polyclonal B cell stimulation with the thymoma cells line (clone OUr BUr) in conjunction with PMA and recombinant human IL-2. Results:A low level, but significantly of human collagen Ⅹ specific B cell reaction was found in SFMC of RA patients after stimulation with EL-4 thymoma cells together with PMA and rIL-2, however, this polyclonal activation was inefficiency in SFMC of OA patients. Similar ratios were found for cells that expressed CD19 or CD20 in both RA and OA patients after stimulation of PBMC and SFMC with EL-4/rIL-2/PMA, however, the number of CD5+ B cell was increased in both RA synovial fluid and peripheral blood. Specificity analysis demonstrated that B cell reaction with HCⅩ in SFMC of RA patients was strongly inhibited by anti-HCⅩ antibody but not by isotype matched anti-HCII antibody in both ELISA and ELISPOT assays. Conclusion:(1)antibody against type Ⅹ collagen in RA patients have pathogenic potential, however, this collagen Ⅹ specific B cell response only can be found in a very sensitive assay and a very sufficient stimulation. (2) CD4+EL-4 OUr BUr/rIL-2/PMA is efficient for activation of CD5+ autoantibody producing cells.
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Key words Rheumatoid arthritis Collagen type Ⅹ ELISPOT assay
类风湿关节炎(RA) 是国际范围内的常见病，病因尚不完全清楚，但自从人们发现人体对Ⅱ 型胶原的免疫反应是RA发病机理中的重要因素以来，本病在国内外引起研究者们的极大重视，而且进展相当迅速。
软骨细胞合成的胶原类型是不同软骨细胞不同分化阶段的特殊标志。软骨前体细胞和再分化软骨细胞合成Ⅰ、Ⅲ 型胶原，具有功能活性的透明软骨细胞合成Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅵ型胶原， 肥大软骨细胞已经被明确证实合成Ⅹ型胶原[1]。以往人们研究比较多的是 RA 患者抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型胶原免疫反应，但也有人先后从RA患者血清及滑膜液中检测到抗Ⅸ、Ⅺ型微量胶原抗体[2],不过Ⅹ型微量胶原是否和Ⅸ、Ⅺ型胶原一样具有免疫原性，是否参与RA 的免疫病理损伤过程还是目前尚不清楚的问题。
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本项工作是在我们预先已经观察了RA患者外周血及滑膜液Ⅱ型胶原反应B细胞频率的基础上[3，4]，把最初由Zubler报道的一个多克隆B细胞刺激系统和由Sedgwick报道的从单细胞水平检测抗体分泌细胞技术结合起来[5，6]，分析了RA患者外周血及滑膜液Ⅹ型胶原特异性B细胞免疫反应, 并与骨性关节炎 (OA) 患者进行了比较。
1 材料与方法
1.1 检测对象 RA患者28例，男7例，女21例,年龄45～69岁，平均54岁,病程7个月～20年,平均5.1年。取标本当时15例患者正在服用强的松，所有患者在取关节液前3个月均未接受过关节腔内激素治疗。全部患者类风湿因子阳性并有局部关节严重损伤的CT或X线改变。骨关节炎患者15 例，其中男6例,女9例，年龄48～74岁，平均52岁，病程5个月～7年，平均3.9年。6例患者在取关节液当时正在服用非激素类抗风湿药，全部患者也均有关节局部严重损伤的CT或X线改变。
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1.2 试剂和细胞克隆 EL-4胸腺细胞克隆(OUr BUr,RH Zuber教授,Geneva 瑞士),PMA(Sigma,Deisenhofen,德国),rIL-2(Eurocetus Amsterdam,荷兰),PWM(Gibco Eggenstein,德国),抗CD19、CD20、CD5抗体(Dianova Hamberg,德国),重组人Ⅹ型胶原(HCⅩ) 及抗Ⅱ型、Ⅹ型胶原抗体(anti-HCⅡ/anti-HCⅩ)均由von der Mark K教授提供(Erlangen,德国)。
1.3 抗体分泌细胞的产生 Ficoll-Hypaque 梯度离心分离外周血及滑膜液单个核细胞(PBMC及SFMC)，调整细胞浓度2.5×105ml-1，然后以照射后的EL-4 OUr BUr细胞(2.5×105ml-1)、PMA(3 ng/ml)、rIL-2(50 U/ml)进行刺激,6 d后收集细胞通过ELISPOT技术检测(anti-HCⅩ ISC)频率，部分试验于6 d后收集细胞培养上清，通过ELISA检测上清中抗体浓度。
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1.4 酶联斑点(ELISPOT)试验 用HCⅩ包板，置4℃过夜，1%BSA封板后将刺激后的PBMC或SFMC加入培养板，37℃ 16 h后洗细胞，加入碱性磷酸酶标记抗人Ig、IgM或IgG抗体，37℃ 2 h后洗板，加入含琼脂的底物溶液(AMP缓冲的BCIP，pH10.25)，12 h 后ELISPOT计数仪下通过计数蓝色斑点而计数anti-HCⅩ ISC。
1.5 CD19、CD20、CD15 细胞表型分析 采用间接荧光染色技术用抗CD19、CD20抗体分别染色外周血及滑膜液单个核细胞，用抗CD5抗体染色外周血及滑膜液B淋巴细胞,通过流式细胞仪分析CD19、CD20或CD5表达状况。
2 结果
2.1 不同刺激状态下外周血及滑膜液anti-HCⅩ ISC频率分析 图1表明，当联合应用EL-4/rIL-2/PMA作为刺激原时，在RA患者滑膜液中引起一个较显著的Ⅹ型胶原特异性B细胞反应；而单独应用anti-HIg或PWM仅引起一个极低水平的B细胞反应。无论应用任何刺激原在外周血都未能引起一个可检测到的Ⅹ型胶原特异性B细胞反应。以同样方法刺激OA患者外周血及滑膜液，亦未检测到anti-HCⅩ ISC，图略。
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图1 不同刺激状态下RA患者外周血及滑膜液anti-HCⅩ ISC频率分析
Fig.1 Frequencies of anti-HCⅩ ISC in PBMC and SFMC of RA patients
Anti-HCⅩ ISC产生的动力学分析结果表明在EL-4/rIL-2/PMA刺激状态下, 滑膜液中HCⅩ特异性IgG 或IgM 分泌细胞频率在5～6 d达到高峰(图略)，因此，在本研究中anti-HCⅩ ISC频率在刺激后第6天左右被检测。
2.2 Anti-HCⅩ ISC 特异性分析 应用ELISA及ELISPOT 技术分别证明滑膜液中Ⅹ型胶原特异性B细胞反应可以被反应系统中存在的anti-HCⅩ 所抑制，其抑制率达90%。对照组Ⅱ型胶原B 细胞反应则未被其抑制，图略。
2.3 RA及OA患者滑膜液anti-HCⅩ ISC频率比较 图2显示了不同个体滑膜液HCⅩ特异性IgG、IgM分泌细胞水平。结果表明部分RA患者anti-HCⅩ ISC水平明显增高，而全部OA患者SFMC经EL-4/rIL-2/PMA刺激后，均未显示明显的HCⅩ特异性B细胞反应。
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图2 RA及OA患者不同个体滑膜液anti-HCⅩ IgG/IgM分泌细胞频率分析
Fig.2 Individual levels of anti-HCⅩ ISC in SFMC of RA and OA patients
2.4 RA患者外周血及滑膜液CD19+、CD20+及CD5+B细胞分析 RA及OA患者外周血及滑膜液单个核细胞中CD19+及CD20+细胞百分率在EL-4/rIL-2/PMA刺激前后均无明显变化，但RA患者外周血及滑膜液B淋巴细胞中CD5+细胞百分率于刺激后则明显增加。与OA患者相比，未经刺激的RA患者外周血及滑膜液CD5+B细胞表达水平也明显增加，见表 1。单独应用PWM刺激时， RA患者外周血及滑膜液CD5+细胞百分率于刺激前后无明显变化，图略。
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表1 抗原刺激前后RA及OA患者外周血及滑膜液CD19+、CD20+及CD5+细胞表达水平分析
Tab.1 Percentage of CD19+,CD20+ and CD5+ cells in PBMC and SFMC before and after stimulation
Before stimulation
After stimulation
RA(n=12)
OA(n=8)
RA(n=12)
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OA(n=8)
PBMC
SFMC
PBMC
SFMC
PBMC
SFMC
PBMC
SFMC
CD19 in lymphocytes
8.5±3.50
4.4±2.00
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9.0±3.80
4.0±2.50
8.8±4.00
4.8±2.80
8.5±2.50
5.6±2.50
CD20 in lymphocytes
12.2±4.00
5.8±2.50
12.1±4.20
5.5±2.00
12.4±4.50
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5.0±3.00
10.4±4.00
4.5±2.50
CD5 in B cells
17.0±6.001)
8.0±3.202)
11.3±3.80
5.5±1.52
27.0±9.003)
16.0±6.004)
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7.5±3.00
Note：1) P<0.001 compared with unstimulated PBMC of OA patients; 2) P<0.001 compared with unstimulated SFMC of OA patients; 3) P<0.001 compared with unstimulated PBMC of RA patients; 4) P<0.001 compared with unstimulated SFMC of RA patients
3 讨论 类风湿关节炎患者关节局部的软骨细胞包括降解的软骨细胞在疾病的不同时期均产生Ⅱ型胶原，而Ⅹ型胶原仅是由肥大的软骨细胞产生。但Ⅹ型胶原是否具有免疫原性，是否参与RA的免疫病理损伤，RA患者体内是否存在抗Ⅹ型胶原免疫反应，抗不同类型胶原免疫反应的出现是否代表疾病的不同病理时期，都是人们关注的问题。
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我们预先的研究已经证明应用Zubler建立并提供的CD4+T细胞克隆(EL-4 OUr BUr)和rIL-2、PMA共同作为刺激系统，可以激活外周血中30%～40% B细胞[3，4]。EL-4克隆激活B细胞的精确机制尚不十分清楚，但EL-4细胞表达CD40配体(CD40L)， 通过CD40-CD40L间的相互作用，对小鼠及人B 细胞提供辅助性作用, 诱导其增殖和分泌抗体的机制被认为是EL-4 克隆激活B细胞的关键[7，8]。在本研究中正是因为联合应用EL-4/rIL-2/PMA扩大了检测系统的敏感性，才使部分RA患者滑膜液中存在的Ⅹ型胶原特异性B细胞免疫反应得以显现，抑制试验的结果也证实了该技术的特异性。另外，我们在本研究中采用了酶联斑点试验，从单细胞水平检测了抗体分泌细胞的频率，在将细胞加到第2个检测周期前，实验过程包括洗涤细胞，这就避免了血清及滑膜液中的免疫球蛋白及其它影响因素。
根据RA患者滑膜液中存在抗Ⅹ型胶原抗体分泌细胞这一事实，我们推论产生Ⅹ型胶原的肥大软骨细胞虽然本来位于关节软骨中层和深层，但是在广泛关节软骨受到侵蚀后，该层则有可能出现在关节软骨的表面，像Ⅱ型胶原一样具有抗原性，刺激滑膜组织及滑膜液淋巴细胞。B淋巴细胞在炎症过程中一旦被抗原激活就可以分化成胶原特异性自身抗体产生细胞，参与RA免疫病理损伤，但是这种胶原特异性B细胞反应，只能在适当刺激条件下，通过敏感的检测手段才能为人们所认识。
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文献报道应用抗Ⅹ型胶原抗体，通过组织化学染色技术证实在14例关节严重损伤的OA患者中，有10例于病变软骨中出现Ⅹ型胶原阳性染色，由此认为Ⅹ型胶原的出现，标志着关节炎症病理损伤比较严重[9]。但本组病例中，存在软骨结构严重破坏的全部OA患者滑膜液均未出现Ⅹ型胶原反应性B细胞，而部分RA患者滑膜液中却存在Ⅹ型胶原特异性B细胞反应。结果提示抗Ⅹ型胶原免疫反应并不单纯取决于关节软骨的损伤程度。
在本研究中经EL-4/rIL-2/PMA 刺激的RA患者外周血及滑膜液CD5+B细胞百分率明显高于OA患者，而单独应用PWM刺激时，RA患者CD5+B细胞并未见明显增加。结果提示RA患者外周血及滑膜液中高水平抗胶原B细胞免疫反应并不是由于简单的B细胞增殖，而是与CD5+自身抗体产生细胞的激活密切相关，rIL-2、PMA、CD4+EL-4 OUr BUr克隆及其产生的细胞因子是激活RA患者CD5+自身抗体产生的细胞的有效方法。值得强调的是未经刺激的本组RA患者外周血及滑膜液中CD5+B细胞百分率也高于对照组，分析其原因，可能与本组患者类风湿因子全部阳性有关，因为RA患者体内激活的CD5+B细胞具有产生 IgM-类风湿因子的功能。总之，本项研究中所采用的CD4+EL-4 OUr BUr T细胞克隆，以及rIL-2、PMA刺激系统，为进一步探讨滑膜液中抗Ⅹ型胶原抗体分泌细胞出现的生物学意义及其与抗其它不同类型胶原免疫反应的关系奠定了基础。
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致谢：德国Max-planck 风湿/免疫研究所von der Mark K教授、白求恩医科大学第一临床学院骨科单玉兴、第二临床学院骨科张学华对本研究工作给予了大力支持和帮助。
①本课题为国家自然科学基金(39470666)、中国博士后基金(中博基96-2)、吉林省科委(953564)项目资助
作者简介：王江滨，女，44岁，博士生导师，主要从事临床免疫学研究；
杨贵贞，女，博士生导师，主要从事基础免疫学研究
4 参考文献
1 Kirsch T, von der Mark K. Isolation of human type X collagen and immunolocalization in fetal human cartilage. Eur J Biochem, 1991；196:575
, 百拇医药
2 Morgan K, Clague R B, Collins I et al. A longitudinal study of anticollagen antibodies in patients with rheumatoid arthritis. Eur J Biochem, 1989；32:139
3 Emmrich F, Jiangbin W. Frequencies of autoreactive collagen type Ⅱ specific B-cells in rheumatoid arthritis. Scand J Rheumatol, 1995；24:39
4 王江滨，王育珊，杨贵贞.类风湿性关节炎患者外周血及滑膜液Ⅱ型胶原反应性B细胞频率分析.中国免疫学杂志，1997；13(4)：233
5 Zubler R H, Erard F, less R K et al. Mutant EL-4 thymoma cells polyclonally activate murine and human B cells via direct cells interaction. J Immunol, 1985;134;3662
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6 Sedgwick J D, Holt P G. A solid-phase immunoenzymatic technique for enumeration of specific antibodysecreting cells. J Immunol Methods, 1983;57:301
7 Armitage R J, Fanslow W C, Strockbine L et al. Molecular and biolgical characterization of a murine ligand for CD40. Nature, 1992;357:80
8 Werener-Faver C, Gauchat J F, Mazzei G et al. Similar CD40 ligand expression on El-4 thymoma cel lines with widely different helper activity for B lymphocytes. Immunoly, 1994;81:111
9 vonder Mark K, Kirsch T, Aigner T et al. the fate of chondrocytes in osteoarthritic cartilage. In: Kuettner K eds. Articular cartilage and osteoarthritis. New York: Raven press,1992:221
收稿1998-11-29 修回1999-01-20, 百拇医药
单位：王江滨 白求恩医科大学第三临床学院，长春130031；王育珊 白求恩医科大学第二临床学院，长春130041；张晓楠 王淑蕙 白求恩医科大学第一临床学院，长春130021；杨贵贞 白求恩医科大学基础医学院免疫室，长春130021
关键词：类风湿关节炎；Ⅹ型胶原；酶联斑点技术
中国免疫学杂志990715 中国图书分类号 R593.22
摘 要 目的：探讨类风湿关节炎(RA)患者体内是否存在抗Ⅹ型胶原B细胞反应。方法：以EL-4 OUr BUr/rIL-2/PMA作为刺激系统，通过酶联斑点技术检测抗Ⅹ型胶原免疫球蛋白分泌B细胞(anti-HCⅩ ISC)频率。结果：28例RA患者滑膜中11例出现 anti-HCⅩ ISC，而对照组骨性关节炎(OA)患者滑膜液中则未检测到anti-HCⅩ ISC。RA患者外周血及滑膜液CD19+及CD20+细胞百分率于刺激前后无明显变化，但CD5+B细胞百分率却明显增加, 外周血刺激前后分别为17.0±6.0,27.0±9.0, 滑膜液分别为8.0±3.2，16.0±6.0。结论：(1) RA患者体内存在抗Ⅹ型胶原B细胞反应,(2) CD4+ EL-4 OUr BUr/rIL-2/PMA是激活CD5+自身抗体产生B细胞的有效方法。
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Detection and specificity analysis of B cell response to human collagen type Ⅹ in peripheral blood and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis
WANG Jiang-Bin, WANG Yu-Shan, ZHANG Xiao-Nan et al.
Department of Internal Medicine, The Third Hospital, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031
Abstract Objective:To detect the frequencies of B cell reaction to human collagen type Ⅹ (HCⅩ) in synovial fluid and peripheral blood in patients with rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA). Methods:The enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay was used for enumerating anti-HCⅩ immunoglobulin secreting cells (anti-HCⅩ ISC) after highly efficient polyclonal B cell stimulation with the thymoma cells line (clone OUr BUr) in conjunction with PMA and recombinant human IL-2. Results:A low level, but significantly of human collagen Ⅹ specific B cell reaction was found in SFMC of RA patients after stimulation with EL-4 thymoma cells together with PMA and rIL-2, however, this polyclonal activation was inefficiency in SFMC of OA patients. Similar ratios were found for cells that expressed CD19 or CD20 in both RA and OA patients after stimulation of PBMC and SFMC with EL-4/rIL-2/PMA, however, the number of CD5+ B cell was increased in both RA synovial fluid and peripheral blood. Specificity analysis demonstrated that B cell reaction with HCⅩ in SFMC of RA patients was strongly inhibited by anti-HCⅩ antibody but not by isotype matched anti-HCII antibody in both ELISA and ELISPOT assays. Conclusion:(1)antibody against type Ⅹ collagen in RA patients have pathogenic potential, however, this collagen Ⅹ specific B cell response only can be found in a very sensitive assay and a very sufficient stimulation. (2) CD4+EL-4 OUr BUr/rIL-2/PMA is efficient for activation of CD5+ autoantibody producing cells.
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Key words Rheumatoid arthritis Collagen type Ⅹ ELISPOT assay
类风湿关节炎(RA) 是国际范围内的常见病，病因尚不完全清楚，但自从人们发现人体对Ⅱ 型胶原的免疫反应是RA发病机理中的重要因素以来，本病在国内外引起研究者们的极大重视，而且进展相当迅速。
软骨细胞合成的胶原类型是不同软骨细胞不同分化阶段的特殊标志。软骨前体细胞和再分化软骨细胞合成Ⅰ、Ⅲ 型胶原，具有功能活性的透明软骨细胞合成Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ和Ⅵ型胶原， 肥大软骨细胞已经被明确证实合成Ⅹ型胶原[1]。以往人们研究比较多的是 RA 患者抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型胶原免疫反应，但也有人先后从RA患者血清及滑膜液中检测到抗Ⅸ、Ⅺ型微量胶原抗体[2],不过Ⅹ型微量胶原是否和Ⅸ、Ⅺ型胶原一样具有免疫原性，是否参与RA 的免疫病理损伤过程还是目前尚不清楚的问题。
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本项工作是在我们预先已经观察了RA患者外周血及滑膜液Ⅱ型胶原反应B细胞频率的基础上[3，4]，把最初由Zubler报道的一个多克隆B细胞刺激系统和由Sedgwick报道的从单细胞水平检测抗体分泌细胞技术结合起来[5，6]，分析了RA患者外周血及滑膜液Ⅹ型胶原特异性B细胞免疫反应, 并与骨性关节炎 (OA) 患者进行了比较。
1 材料与方法
1.1 检测对象 RA患者28例，男7例，女21例,年龄45～69岁，平均54岁,病程7个月～20年,平均5.1年。取标本当时15例患者正在服用强的松，所有患者在取关节液前3个月均未接受过关节腔内激素治疗。全部患者类风湿因子阳性并有局部关节严重损伤的CT或X线改变。骨关节炎患者15 例，其中男6例,女9例，年龄48～74岁，平均52岁，病程5个月～7年，平均3.9年。6例患者在取关节液当时正在服用非激素类抗风湿药，全部患者也均有关节局部严重损伤的CT或X线改变。
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1.2 试剂和细胞克隆 EL-4胸腺细胞克隆(OUr BUr,RH Zuber教授,Geneva 瑞士),PMA(Sigma,Deisenhofen,德国),rIL-2(Eurocetus Amsterdam,荷兰),PWM(Gibco Eggenstein,德国),抗CD19、CD20、CD5抗体(Dianova Hamberg,德国),重组人Ⅹ型胶原(HCⅩ) 及抗Ⅱ型、Ⅹ型胶原抗体(anti-HCⅡ/anti-HCⅩ)均由von der Mark K教授提供(Erlangen,德国)。
1.3 抗体分泌细胞的产生 Ficoll-Hypaque 梯度离心分离外周血及滑膜液单个核细胞(PBMC及SFMC)，调整细胞浓度2.5×105ml-1，然后以照射后的EL-4 OUr BUr细胞(2.5×105ml-1)、PMA(3 ng/ml)、rIL-2(50 U/ml)进行刺激,6 d后收集细胞通过ELISPOT技术检测(anti-HCⅩ ISC)频率，部分试验于6 d后收集细胞培养上清，通过ELISA检测上清中抗体浓度。
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1.4 酶联斑点(ELISPOT)试验 用HCⅩ包板，置4℃过夜，1%BSA封板后将刺激后的PBMC或SFMC加入培养板，37℃ 16 h后洗细胞，加入碱性磷酸酶标记抗人Ig、IgM或IgG抗体，37℃ 2 h后洗板，加入含琼脂的底物溶液(AMP缓冲的BCIP，pH10.25)，12 h 后ELISPOT计数仪下通过计数蓝色斑点而计数anti-HCⅩ ISC。
1.5 CD19、CD20、CD15 细胞表型分析 采用间接荧光染色技术用抗CD19、CD20抗体分别染色外周血及滑膜液单个核细胞，用抗CD5抗体染色外周血及滑膜液B淋巴细胞,通过流式细胞仪分析CD19、CD20或CD5表达状况。
2 结果
2.1 不同刺激状态下外周血及滑膜液anti-HCⅩ ISC频率分析 图1表明，当联合应用EL-4/rIL-2/PMA作为刺激原时，在RA患者滑膜液中引起一个较显著的Ⅹ型胶原特异性B细胞反应；而单独应用anti-HIg或PWM仅引起一个极低水平的B细胞反应。无论应用任何刺激原在外周血都未能引起一个可检测到的Ⅹ型胶原特异性B细胞反应。以同样方法刺激OA患者外周血及滑膜液，亦未检测到anti-HCⅩ ISC，图略。
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图1 不同刺激状态下RA患者外周血及滑膜液anti-HCⅩ ISC频率分析
Fig.1 Frequencies of anti-HCⅩ ISC in PBMC and SFMC of RA patients
Anti-HCⅩ ISC产生的动力学分析结果表明在EL-4/rIL-2/PMA刺激状态下, 滑膜液中HCⅩ特异性IgG 或IgM 分泌细胞频率在5～6 d达到高峰(图略)，因此，在本研究中anti-HCⅩ ISC频率在刺激后第6天左右被检测。
2.2 Anti-HCⅩ ISC 特异性分析 应用ELISA及ELISPOT 技术分别证明滑膜液中Ⅹ型胶原特异性B细胞反应可以被反应系统中存在的anti-HCⅩ 所抑制，其抑制率达90%。对照组Ⅱ型胶原B 细胞反应则未被其抑制，图略。
2.3 RA及OA患者滑膜液anti-HCⅩ ISC频率比较 图2显示了不同个体滑膜液HCⅩ特异性IgG、IgM分泌细胞水平。结果表明部分RA患者anti-HCⅩ ISC水平明显增高，而全部OA患者SFMC经EL-4/rIL-2/PMA刺激后，均未显示明显的HCⅩ特异性B细胞反应。
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图2 RA及OA患者不同个体滑膜液anti-HCⅩ IgG/IgM分泌细胞频率分析
Fig.2 Individual levels of anti-HCⅩ ISC in SFMC of RA and OA patients
2.4 RA患者外周血及滑膜液CD19+、CD20+及CD5+B细胞分析 RA及OA患者外周血及滑膜液单个核细胞中CD19+及CD20+细胞百分率在EL-4/rIL-2/PMA刺激前后均无明显变化，但RA患者外周血及滑膜液B淋巴细胞中CD5+细胞百分率于刺激后则明显增加。与OA患者相比，未经刺激的RA患者外周血及滑膜液CD5+B细胞表达水平也明显增加，见表 1。单独应用PWM刺激时， RA患者外周血及滑膜液CD5+细胞百分率于刺激前后无明显变化，图略。
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表1 抗原刺激前后RA及OA患者外周血及滑膜液CD19+、CD20+及CD5+细胞表达水平分析
Tab.1 Percentage of CD19+,CD20+ and CD5+ cells in PBMC and SFMC before and after stimulation
Before stimulation
After stimulation
RA(n=12)
OA(n=8)
RA(n=12)
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OA(n=8)
PBMC
SFMC
PBMC
SFMC
PBMC
SFMC
PBMC
SFMC
CD19 in lymphocytes
8.5±3.50
4.4±2.00
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9.0±3.80
4.0±2.50
8.8±4.00
4.8±2.80
8.5±2.50
5.6±2.50
CD20 in lymphocytes
12.2±4.00
5.8±2.50
12.1±4.20
5.5±2.00
12.4±4.50
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5.0±3.00
10.4±4.00
4.5±2.50
CD5 in B cells
17.0±6.001)
8.0±3.202)
11.3±3.80
5.5±1.52
27.0±9.003)
16.0±6.004)
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7.5±3.00
Note：1) P<0.001 compared with unstimulated PBMC of OA patients; 2) P<0.001 compared with unstimulated SFMC of OA patients; 3) P<0.001 compared with unstimulated PBMC of RA patients; 4) P<0.001 compared with unstimulated SFMC of RA patients
3 讨论 类风湿关节炎患者关节局部的软骨细胞包括降解的软骨细胞在疾病的不同时期均产生Ⅱ型胶原，而Ⅹ型胶原仅是由肥大的软骨细胞产生。但Ⅹ型胶原是否具有免疫原性，是否参与RA的免疫病理损伤，RA患者体内是否存在抗Ⅹ型胶原免疫反应，抗不同类型胶原免疫反应的出现是否代表疾病的不同病理时期，都是人们关注的问题。
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我们预先的研究已经证明应用Zubler建立并提供的CD4+T细胞克隆(EL-4 OUr BUr)和rIL-2、PMA共同作为刺激系统，可以激活外周血中30%～40% B细胞[3，4]。EL-4克隆激活B细胞的精确机制尚不十分清楚，但EL-4细胞表达CD40配体(CD40L)， 通过CD40-CD40L间的相互作用，对小鼠及人B 细胞提供辅助性作用, 诱导其增殖和分泌抗体的机制被认为是EL-4 克隆激活B细胞的关键[7，8]。在本研究中正是因为联合应用EL-4/rIL-2/PMA扩大了检测系统的敏感性，才使部分RA患者滑膜液中存在的Ⅹ型胶原特异性B细胞免疫反应得以显现，抑制试验的结果也证实了该技术的特异性。另外，我们在本研究中采用了酶联斑点试验，从单细胞水平检测了抗体分泌细胞的频率，在将细胞加到第2个检测周期前，实验过程包括洗涤细胞，这就避免了血清及滑膜液中的免疫球蛋白及其它影响因素。
根据RA患者滑膜液中存在抗Ⅹ型胶原抗体分泌细胞这一事实，我们推论产生Ⅹ型胶原的肥大软骨细胞虽然本来位于关节软骨中层和深层，但是在广泛关节软骨受到侵蚀后，该层则有可能出现在关节软骨的表面，像Ⅱ型胶原一样具有抗原性，刺激滑膜组织及滑膜液淋巴细胞。B淋巴细胞在炎症过程中一旦被抗原激活就可以分化成胶原特异性自身抗体产生细胞，参与RA免疫病理损伤，但是这种胶原特异性B细胞反应，只能在适当刺激条件下，通过敏感的检测手段才能为人们所认识。
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文献报道应用抗Ⅹ型胶原抗体，通过组织化学染色技术证实在14例关节严重损伤的OA患者中，有10例于病变软骨中出现Ⅹ型胶原阳性染色，由此认为Ⅹ型胶原的出现，标志着关节炎症病理损伤比较严重[9]。但本组病例中，存在软骨结构严重破坏的全部OA患者滑膜液均未出现Ⅹ型胶原反应性B细胞，而部分RA患者滑膜液中却存在Ⅹ型胶原特异性B细胞反应。结果提示抗Ⅹ型胶原免疫反应并不单纯取决于关节软骨的损伤程度。
在本研究中经EL-4/rIL-2/PMA 刺激的RA患者外周血及滑膜液CD5+B细胞百分率明显高于OA患者，而单独应用PWM刺激时，RA患者CD5+B细胞并未见明显增加。结果提示RA患者外周血及滑膜液中高水平抗胶原B细胞免疫反应并不是由于简单的B细胞增殖，而是与CD5+自身抗体产生细胞的激活密切相关，rIL-2、PMA、CD4+EL-4 OUr BUr克隆及其产生的细胞因子是激活RA患者CD5+自身抗体产生的细胞的有效方法。值得强调的是未经刺激的本组RA患者外周血及滑膜液中CD5+B细胞百分率也高于对照组，分析其原因，可能与本组患者类风湿因子全部阳性有关，因为RA患者体内激活的CD5+B细胞具有产生 IgM-类风湿因子的功能。总之，本项研究中所采用的CD4+EL-4 OUr BUr T细胞克隆，以及rIL-2、PMA刺激系统，为进一步探讨滑膜液中抗Ⅹ型胶原抗体分泌细胞出现的生物学意义及其与抗其它不同类型胶原免疫反应的关系奠定了基础。
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致谢：德国Max-planck 风湿/免疫研究所von der Mark K教授、白求恩医科大学第一临床学院骨科单玉兴、第二临床学院骨科张学华对本研究工作给予了大力支持和帮助。
①本课题为国家自然科学基金(39470666)、中国博士后基金(中博基96-2)、吉林省科委(953564)项目资助
作者简介：王江滨，女，44岁，博士生导师，主要从事临床免疫学研究；
杨贵贞，女，博士生导师，主要从事基础免疫学研究
4 参考文献
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4 王江滨，王育珊，杨贵贞.类风湿性关节炎患者外周血及滑膜液Ⅱ型胶原反应性B细胞频率分析.中国免疫学杂志，1997；13(4)：233
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收稿1998-11-29 修回1999-01-20, 百拇医药